Valutare interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso in un<em> Ex Vivo</em> Assay Autoperfused Microflow Camera
Summary
Qui, presentiamo un protocollo che permette al ricercatore di valutare dinamiche reclutamento di leucociti ex vivo collegando una camera rivestita con molecole di adesione endoteliali derivate al sistema circolatorio di un topo. Questo metodo offre notevoli vantaggi, in quanto permette di valutazione leucociti in condizioni biologiche relative.
Abstract
Interazioni leucociti-endotelio sono precoci e importanti eventi in infiammazione acuta e cronica e può, quando deregolazione, mediare lesioni dei tessuti che porta a danni permanenti patologico. Esistenti saggi convenzionali consentono l'analisi di molecole di adesione leucocitaria solo dopo l'estrazione dei leucociti dal sangue. Questo richiede il sangue sottoporsi a diversi passaggi prima leucociti del sangue periferico (PBL) possono essere pronti per l'analisi, che a sua volta può stimolare PBLs influenzano i risultati della ricerca. Il test camera di flusso micro autoperfused, tuttavia, consente agli scienziati di studiare i primi leucociti disregolazione funzionale al flusso sistemico di un topo vivo pur avendo la libertà di manipolare una camera rivestita. Attraverso un modello di malattia, l'espressione funzionale di molecole di adesione leucocitaria può essere valutata e quantificata in una camera di micro-vetro rivestito con le molecole di adesione endoteliale immobilizzati ex vivo. In questo modello, il sangue scorretra il diritto carotide comune e sinistra vena giugulare esterna di un topo vivo sotto anestesia, permettendo l'interazione di PBLs nativi nella camera. Analisi sperimentale in tempo reale è ottenuto con l'aiuto di un microscopio intravitale, nonché un dispositivo di pressione Apparecchiatura Harvard. L'applicazione di un regolatore di flusso al punto di ingresso della camera di vetro permette comparabili condizioni fisiologiche di flusso tra gli esperimenti. La velocità di rotolamento dei leucociti è il risultato principale e si misura con il National Institutes of Health open-access software ImageJ. In sintesi, il autoperfused micro test camera di flusso fornisce un ambiente fisiologico ottimale per studiare l'interazione leucociti endoteliale e permette ai ricercatori di trarre conclusioni precise quando si studia l'infiammazione.
Introduction
L'infiammazione è la risposta universale del corpo di infortunio ed è un passo cruciale sia la funzione del sistema immunitario innato e adattativo. In risposta al danno e / o stimoli infiammatori, le cellule endoteliali upregulate molecole di adesione specifici; questo porta a leucociti stravaso attraverso l'endotelio microvascolare, soprattutto in venule post-capillari. Questo processo inizia con tethering dei leucociti flusso libero nel sangue sull'endotelio. Rolling stabile e ferma adesione dei leucociti, che a sua volta conduce alla trasmigrazione e la secrezione di agenti citotossici, seguono questa legare 1,2. Selectine sono noti per mediare i primi passaggi della cascata 3-5; integrine sono responsabili per i passi successivi della ditta adesione e la trasmigrazione 1,6-8.
Un crescente corpo di evidenza suggerisce leucociti e molecole di adesione endoteliali hanno un ruolo fondamentale in modelli animali di ischemia riperfusione, Asma, psoriasi, sclerosi multipla, e la degenerazione maculare senile 9-12. In queste condizioni, la risposta infiammatoria è indirizzato ad attaccare il proprio corpo, con conseguente rottura del tessuto sano. Agenti anti-infiammatori esistenti (come i farmaci non steroidei anti-infiammatori, corticosteroidi o altri agenti chemioterapici) comportano il rischio di gravi effetti collaterali con l'uso a lungo termine 13. Pertanto, è di grande interesse per avere gli strumenti appropriati con la capacità di identificare molecole malattie specifiche, che alla fine possono essere mirati ad avere l'effetto anti-infiammatorio desiderata rimanendo atossico 14.
Esistenti metodi in vitro, come il test di adesione leucocitaria statico sono state usate come già nel 1976 15. La camera di flusso parallelo è stato impiegato in vitro nel 1987 per studiare le interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso. In questi esperimenti, stimolato Human leucociti polimorfonucleati (PMN) dal sangue venoso sono stati perfusi su un monostrato di cellule primarie umane vena ombelicale endoteliali (HUVEC). Per controllare le condizioni di flusso emodinamico, la pompa a siringa Harvard Apparatus 16 è stato impiegato. In alternativa, per evitare l'isolamento leucociti artificiale, sangue intero è stato usato in combinazione con la camera di vetro rivestito con molecole di adesione immobilizzati 17.
Per evitare la stimolazione dei leucociti e studiare meccanicamente la loro interazione con le molecole di adesione in condizioni fisiologiche approssimativi, un ex vivo autoperfused, extracorporea, circuito artero è stato sviluppato 16. In questo circuito, il sangue scorre tra il diritto carotide comune e sinistra vena giugulare esterna di un topo vivo sotto anestesia, permettendo interazione di PBLs nativi entro una camera microflusso vetro rivestito con molecole singole o co-immobilizzato adesione. Uno dei principali vantaggi di questo system è la capacità di impiegare topi geneticamente ingegnerizzati, in cui vie infiammatorie sono manipolati direttamente o indirettamente. Inoltre, vi è la possibilità di individuare il contributo isolato di molecole di adesione leucocitaria all'infiammazione, gratuitamente attivazione esterna, in condizioni di flusso. L'applicazione di un regolatore di flusso al punto di ingresso della camera di flusso fornisce una vasta gamma di variazioni sperimentali di forze di taglio per mimare sia arterioso o venoso 18-22. Qui si descrive in grande dettaglio un protocollo sulla preparazione e le prestazioni della ex vivo autoperfused microflusso test camera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il processo di reclutamento dei leucociti è un passo cruciale nella risposta infiammatoria; comporta la migrazione dei leucociti dal sistema circolatorio verso tessuti bersaglio, dove sono in grado di esercitare la loro funzione effettrice. Il reclutamento dei leucociti è integrale in una varietà di condizioni infiammatorie come placche aterosclerotiche, infarto miocardico, ischemia / riperfusione e chirurgia dei trapianti 1, così come più CNS relative condizioni neuro-infiammatori 10-12,20,24,25. Considerando la diversità delle condizioni di malattia che si estende il reclutamento dei leucociti, la camera di microflusso autoperfused fornisce uno strumento indispensabile che consente al ricercatore la possibilità di studiare la dinamica di migrazione dei leucociti.
Nel corso degli ultimi decenni, una serie di test in vitro sono stati sviluppati per studiare la dinamica dei leucociti cella adesione 26. Purtroppo, tutti questi saggi richiedono l'estrazione dii leucociti dal sangue, introducendo attivazione meccanica. Per avvicinarsi all'ambiente in vivo, sono stati effettuati adattamenti per raccogliere campioni di sangue intero e controllare le condizioni di flusso emodinamico 16,17. Qui, si estendono i progressi precedenti nel campo collegando una camera rivestita al sistema circolatorio del mouse. Possiamo regolare il flusso del sangue in un intervallo fisiologico e studiare la dinamica di leucociti rotolamento. La camera rivestita ci dà la possibilità di studiare le interazioni leucociti con specifiche molecole di adesione. Poiché il sistema funziona come unità azionata da un topo vivo, imita più strettamente l'ambiente naturale, consentendo di studiare le interazioni leucociti-endotelio in una varietà di modelli di topo immunologici. Inoltre, questo sistema ci permette di trarre vantaggio dalle molteplici modelli murini genetiche disponibili. Mentre il sistema non replica completamente l'ambiente in vivo, fornisce una piattaforma per studiare specifielementi c dei leucociti in condizioni fisiologiche, una prodezza che non è stato possibile in precedenza. Anche se questo ci porta un passo avanti verso un ambiente più fisiologica ci sono limitazioni al sistema. Essa non replica completamente la complessa matrice 3D della vascolarizzazione quindi siamo solo in grado di valutare alcuni elementi di interazioni leucociti che sono limitati al rivestimento della camera. Inoltre, grande attenzione dovrebbe essere presa per garantire un sistema chiuso per la circolazione del mouse seguendo tutti i passaggi indicati nel protocollo. L'introduzione di bolle d'aria influenzerà notevolmente la precisione e la riproducibilità degli esperimenti.
Mentre si descrive l'uso della camera Autoperfused Microflow per valutare le dinamiche di rotolamento dei leucociti la procedura ha il potenziale per essere personalizzato dagli investigatori di studiare una serie di malattie. Ad esempio, le cellule tumorali metastatizzano esprimendo molte delle integrine comuni condivisi dai leucociti. Studying loro dinamica di laminazione in un ambiente che imita più da vicino un ambiente in vivo potrebbe aiutare nella nostra conoscenza, e forse la previsione, la natura invasiva delle cellule tumorali. Un possibile approccio potrebbe essere quello di combinare una tecnica di etichettatura per le cellule tumorali, come GFP 27, insieme con il test camera di flusso per monitorare le dinamiche di rotolamento delle cellule tumorali esprimenti GFP. Data la flessibilità del rivestimento della camera con una varietà di sostanze e collegando camere multiple allo stesso topo sarà interessante vedere come questa procedura viene modificato per l'utilizzo in altri laboratori in combinazione con topi geneticamente modificati e modelli di malattia. La tecnica che descriviamo qui tocca solo su una potenziale applicazione molto più ampio che è limitato solo dalla creatività del ricercatore.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Eye Institute dei National Institutes of Health di cui ai numeri di aggiudicazione: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) e P30EY014104. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Ulteriore supporto è stato fornito dal Fondo Massachusetts Lions Eye Research (KMC) e un premio speciale dal Research Scholar per prevenire la cecità (a KMC).
Materials
| Material | Vendor | Part number |
| Micro glass chamber 0.4×0.04x50mm | VitroCom | 2540-050 |
| Polyethylene tubing PE 10 | Fisher Scientific | 427400 |
| Polyethylene tubing PE 60 | Fisher Scientific | 427416 |
| Silicone tubing 002 | Fisher Scientific | 11-189-15A |
| Y tube | Value Plastics | Y210-6 |
| T tube | value plastics | T410-6 |
| Silicone gel | Hardware store – Home Depo | |
| 35mm petri dish | Corning | 430165 |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 |
| Fine forceps | FST | 11253-25 |
| Fine scissors | FST | 15000-08 |
| Tube holder | FST | 00608-11 |
| Clamp applicator | FST | 18057-14 |
| Vascular clamp | FST | 18055-04 |
| 6-0 silk sutures | George Tiemann & Co | 160-1215-6/0 |
| 25x1G needles | BD | 305125 |
| 30×1/2G needles | BD | 305106 |
| Heparin 100 USP units/ml | Hospital pharmacy |
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