Évaluer les interactions de leucocytes-endothélial dans des conditions d'écoulement dans un<em> Ex Vivo</em> Autoperfused Microflow Chambre Assay

Toutes les expériences sur les animaux ont été traités conformément à l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research, et les directives et règlements énoncés par le Ear Infirmary Comité de protection des animaux Massachusetts Eye et. La veille de l'expérience: 1. Préparation des tubes de la Chambre de débit Pour préparer le côté jugulaire, connectez une cm PE10 tuyaux en polyéthylène à un tube de silicium de 6 cm par 5 cm suivi des tuyaux en polyéthylène. Pour la partie de la carotide, de préparer de manière similaire au côté jugulaire avec l'addition d'un tube en T dans le tube de silicium de 6 cm à environ 1,5 cm de la 1 cm de tubulure en polyéthylène (figure 1A, B). Pour insérer le tube en T, d'élargir le tube de silicium en utilisant une pince fine si nécessaire. Branchez une extrémité de 10 cm de tube de silicone pour le capteur de pression puis insérez la fin de la carotide s Tide tube en T dans l'autre extrémité. Vérifiez que la connexion des sites sont serrés et sans fuite. Appliquer une petite pièce rectangulaire de parafilm sur lequel se emboîte le tube, si nécessaire, pour éviter les fuites (figure 1C). 2. Revêtement la Chambre Préparation de la protéine de revêtement de surface endotheliale (par exemple, P-sélectine, molécule d'adhésion intercellulaire-1 (ICAM-1), protéine vasculaire-1 d'adhésion cellulaire (VCAM-1)) dans 0,1% de BSA. A titre indicatif, 1 pg de protéine dans 200 pi de BSA est assez pour recouvrir 4-5 chambres. En utilisant une seringue de 1 ml reliée à une aiguille G 25, infuser chaque chambre (0,04 x 0,4 x 50 mm) avec une protéine de revêtement de surface endotheliale. Stocker les chambres revêtues dans un tube de 15 ml à 4 ° C jusqu'au lendemain. Le jour de l'expérience: 3. Préparation de la Chambre Enlever les chambres recouvertes de 4 ° C et raccorder le tuyau jugulaire et la carotide de chaque côté. Sceller les rapproons en étirant attentivement une petite pièce rectangulaire de parafilm sur l'endroit où le tuyau se réunit la chambre. En utilisant une seringue, remplir la chambre et le tube avec 0,1% de BSA (vérifier les fuites). Incuber pendant 45 min. Préparer un plat de 35 mm de Petri à maintenir la chambre en coupant encoches de chaque côté de l'assiette. Stabiliser la chambre dans les encoches; puis utiliser une petite goutte de silicone à apposer la chambre à l'antenne sur le site crantée. Assurez-vous que la chambre est de niveau en regardant sous le microscope. Laisser le silicone sécher pendant au moins 15 min. Remplir une seringue de verrouillage 60 ml avec de l'héparine et à connecter le transducteur de pression. Connecter le transducteur de pression à la tubulure de la carotide dans l'ordre suivant: transducteur, un tube de silicium et T-tube. Utiliser un 1 cm entre la tubulure PE50 de silicium relié au transducteur et le tube en T pour sécuriser la connexion. Passez le tube de silicium de l'artère carotide dans le collier de pression (figure 1D). Exécutez 100USP héparine Through le tube et la chambre jusqu'à ce qu'il n'y a pas de bulles d'air. 4. Mise en place du logiciel Pour préparer le logiciel, allumez l'ordinateur, microscope, et un dispositif de laboratoire ouvert. Double-cliquez sur le Leica Application Suite (LAS) (ou l'équivalent) et de préparer un dossier pour enregistrer la vidéo: parcourir → → acquérir film → définir séquence de clips (clips = 15, temps d'enregistrement = 30 sec, et les intervalles = 15 sec) puis cliquez sur le signe "+" pour confirmer. Pour enregistrer la pression d'écoulement ouvrir le LabChart (ou équivalent) fichier et coordonner le nom de fichier dans le dossier d'enregistrement à l'étape 4.1, ci-dessus. 5. Procédure chirurgicale 10.8 anesthésier un week-old souris en utilisant une combinaison de kétamine (60 mg / kg) et de xylazine (6 mg / kg) injecté par voie intraperitoneale (IP). Assurez-vous que la sédation profonde est atteint dans 5-10 min par la perte du retrait de la pédale réflexe. Si nécessaire, l'isofluraneenvoyé par masque peut être donnée au besoin. Alors que sous anesthésie, placer un coussin chauffant sous la cage et mettre à 37 ° C pour maintenir la température du corps. Une fois l'anesthésie adéquate est confirmée, placez la souris dans une position ventrale et le manteau les yeux avec bacitracine onguent pour prévenir la sécheresse oculaire. Par la suite, de se raser les cheveux à l'endroit de l'incision à l'aide d'une lame de rasoir et nettoyer le site avec de l'alcool. Une fois complètement anesthésié sécuriser l'animal avec du ruban adhésif en gardant la souris dans une position ventrale. Exposer la région du cou avec des ciseaux et enlever la glande thyroïde pour exposer la trachée et des vaisseaux (figure 2A). Nettoyez l'artère carotide jusqu'à ce qu'il soit entièrement exposé en prenant soin de ne pas endommager le nerf vague (figure 2B). Pliez un morceau de suture et passer le virage sous l'artère carotide puis couper au niveau du coude il ya donc maintenant deux morceaux de suture en dessous de la carotide. Boucle chaque suture en noeuds (ne pas serrer lesnœuds). Répétez la même procédure pour exposer la veine jugulaire gauche (figure 2C), la préparation des sutures de la même manière (Figure 2D). Connectez le tuyau à la vascularisation de la souris. Hépariner la souris par injection de 1 ml d'héparine IP. Serrer la suture supérieure sur l'artère carotide. Placez la pince aussi bas qu'il peut aller sur l'artère carotide (figure 3A) de la cuve. Utiliser des pinces pour maintenir l'artère par la suture supérieure et une petite incision, environ 1/8 de la circonférence de l'artère, en utilisant les microciseaux (figure 3B). Faire passer le tube de l'artère carotide par l'intermédiaire du second noeud dans le fil de suture supérieure et dans l'incision pratiquée dans l'artère. Attacher la suture inférieure de sorte que l'artère est scellée autour du tube (plusieurs noeuds doivent être prises pour assurer un joint étanche, la figure 3C). Répétez la même procédure pour insérer le tube de la veine jugulaire (le navirepince ne est pas nécessaire pour le côté jugulaire; Figure 3D). Testez le flux en relâchant la pince de navire. Se il n'y a pas de fuites déplacer la souris pour le microscope et raccorder le tuyau de la carotide et la veine jugulaire à la tubulure de chambre (voir vidéo ci-jointe pour la démonstration d'intervention chirurgicale). 6. Enregistrement de Rolling Velocity Ouvrir la pince carotide pour remplir la chambre, ce qui rend un circuit avec le système circulatoire de la souris. Laisser le sang de circuler pendant 3-5 min, de manière à ce que les conditions d'écoulement se stabilisent. Au cours de la période d'attente de 3-5 minutes, ajuster la platine du microscope de telle sorte que la chambre est au niveau d'une extrémité à l'autre de l'objectif du microscope et son bord est parallèle à la fenêtre d'enregistrement vidéo sur l'écran. Remplissez la boîte de Pétri modifié contenant la chambre de verre avec de l'eau puis abaissez l'objectif de l'immersion en eau 10X dans le plat de sorte que les cellules se écoulant à travers la chambre sont visibles.L'intensité de la lumière peut être ajusté pour une visualisation adéquate des cellules. En général, une intensité plus faible est mieux. Régler la pince sur le tube de sorte que le transducteur lit une constante 30 mm Hg, en corrélation avec une pression physiologique fluide en écoulement, ou comme on le souhaite. Appuyez sur "Start" pour lancer l'enregistrement à la fois la vidéo et la pression avec le premier laps de temps près de la fin jugulaire et se déplaçant à contre-courant vers la fin de la carotide jusqu'à leur achèvement. NOTE: Plusieurs conditions de revêtement utilisant différentes molécules d'adhésion peuvent être étudiés dans la même souris en utilisant plusieurs chambres. Une seule chambre est enregistré à la fois. Lorsque l'enregistrement est terminé, fermer la vanne sur le site d'entrée, l'arrêt de la circulation sanguine. Retirer la chambre et se adapter à une nouvelle chambre (couché avec une molécule d'adhérence différente) au circuit à l'aide de pinces fines dans une main et pince rainurés dans l'autre main. Reprendre l'enregistrement de la nouvelle chambre comme indiqué dans les étapes06.01 à 06.04. Euthanasier toutes les souris par asphyxie au CO2 suivie d'une dislocation de la moelle épinière à la fin de l'expérience. La procédure est terminal, par conséquent, les souris sont euthanasiées par dislocation de la moelle épinière à la fin de l'expérience. 7. Interprétation des résultats Pour analyser les données enregistrées utiliser le plugin "M TrackJ" pour le logiciel ImageJ 23. Convertir le fichier en niveaux de gris par Sélectionnez Fichier → Importer → → AVI convertir en niveaux de gris. Standardiser les cadres Sélectionnez l'image → → → propriété de pénétrer dans les intervalles de trame (i) → mondiale. Calculer les intervalles de trame en divisant la durée totale de la vidéo (généralement 30 sec) par le nombre de trames dans une vidéo (indiqué dans le coin supérieur de la fenêtre d'image vidéo J). Mesurer le débit de chaque leucocytes par Choisir le plugiciel → M TrackJ → Ajouter pistes → sélectionner un leucocyte→ Suivi avec chaque image pour 15-20 sec → Fusionner. Répétez l'étape 7.4 pour tous les leucocytes en vue. Déterminer la vitesse moyenne de roulement des leucocytes par Select mesure → deux colonnes apparaissent → Copier tous les M TrakJ: Tracks dans un tableur. La colonne intitulée "V signifie" est le roulement des leucocytes mesurée en pixels / seconde. Convertir en um / sec en divisant par 2/3. Pour analyser le point culminant de données de pression et d'exportation dans un tableur et d'effectuer le calcul suivant: AP (mm Hg) et t (dyne / cm 2) pour une comparaison entre chaque groupe expérimental. Une fois calculée, copier les données dans le logiciel de prisme pour le graphisme.