JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

تقييم التفاعلات الكريات البيض البطانية تحت ظروف التدفق في<em> فيفو السابقين</em> الفحص Autoperfused غرفة Microflow

Published: December 30, 2014
doi:
10.3791/52130
, ,
1Angiogenesis Laboratory, Department of Ophthalmology,Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary, 2St. Elizabeth’s Medical Center

Summary

هنا، نقدم البروتوكول الذي يسمح للمحقق لتقييم ديناميات التوظيف الكريات البيض خارج الحي من خلال ربط غرفة المغلفة مع المستمدة البطانية جزيئات الالتصاق لنظام الدورة الدموية على فأرة الحاسوب. ويوفر هذا الأسلوب مزايا هامة لأنه يسمح لتقييم الكريات البيض في ظل الظروف البيولوجية النسبية.

Abstract

التفاعلات الكريات البيض البطانية هي الأحداث في وقت مبكر والحاسمة في الالتهاب الحاد والمزمن، ويمكن، عندما dysregulated، توسط إصابة الأنسجة مما يؤدي إلى تلف المرضي الدائم. المقايسات التقليدية الحالية تسمح للتحليل الكريات البيض جزيئات الالتصاق إلا بعد استخراج الكريات البيض من الدم. وهذا يتطلب الدم على الخضوع لعدة خطوات قبل الكريات البيض الدموية المحيطية (PBLs) يمكن أن يكون جاهزا للتحليل، والتي بدورها يمكن أن تحفز PBLs التأثير على نتائج البحوث. وautoperfused فحص غرفة التدفق الصغيرة، ومع ذلك، يسمح للعلماء لدراسة الكريات البيض في وقت مبكر ديسريغولاتيون الوظيفي باستخدام تدفق النظامية على فأرة الحاسوب الحية في حين وجود حرية التلاعب غرفة المغلفة. من خلال نموذج المرض، والتعبير الوظيفي للالكريات البيض جزيئات الالتصاق يمكن تقييم وكميا في غرفة الزجاج الصغيرة المغلفة مع يجمد جزيئات الالتصاق البطانية خارج الحي. في هذا النموذج، يتدفق الدمبين الحق العام الشريان السباتي الأيسر والوريد الوداجي الخارجي للماوس يعيش تحت التخدير، والسماح للتفاعل PBLs الأم في الغرفة. ويتحقق في الوقت الحقيقي التحليل التجريبي بمساعدة مجهر حيوي داخلي وكذلك جهاز ضغط جهاز هارفارد. تطبيق منظم تدفق عند نقطة المدخلات من الغرفة الزجاجية يسمح ظروف تدفق الفسيولوجية للمقارنة بين التجارب. سرعة الكريات البيض المتداول هي النتيجة الرئيسية ويتم قياسها باستخدام المعاهد الوطنية للصحة الوصول المفتوح البرمجيات يماغيج. وباختصار، يوفر autoperfused الجزئي فحص غرفة التدفق بيئة الفسيولوجية المثلى لدراسة الكريات البيض البطاني التفاعل ويسمح للباحثين لرسم استنتاجات دقيقة عند دراسة الالتهاب.

Introduction

الالتهاب هو استجابة الجسم للإصابة والعالمية هو خطوة حاسمة في كل وظيفة نظام المناعة الفطرية والتكيفية. ردا على إصابة و / أو محفزات للالتهابات، والخلايا البطانية upregulate جزيئات الالتصاق محددة؛ هذا يؤدي إلى تسرب للكريات البيض من خلال البطانة الاوعية الدموية الدقيقة، وخاصة في الأوردة الشعرية بعد. وتبدأ هذه العملية مع الربط من الكريات البيض الحرة المتدفقة في مجرى الدم على البطانة. المتداول مستقر وراسخ التصاق الكريات البيض، وهذا بدوره يؤدي إلى التهجير وإفراز العوامل السامة للخلايا، متابعة هذه يربطون 1،2. ومن المعروف Selectins للتوسط في الخطوات الأولى من سلسلة 3-5. integrins هي المسؤولة عن خطوات لاحقة من التصاق شركة والتهجير 1،6-8.

وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير الكريات البيض وجزيئات الالتصاق البطانية لها أدوار حيوية في النماذج الحيوانية للإصابة نقص التروية ضخهوالربو والصدفية، والتصلب المتعدد، والضمور البقعي المرتبط بالعمر 9-12. في ظل هذه الظروف، وأساء توجيه الاستجابة الالتهابية لمهاجمة الجسم المرء، مما أدى إلى انهيار الأنسجة السليمة. القائمة الأدوية المضادة للالتهابات (مثل غير الستيرويدية المضادة للالتهابات المخدرات، القشرية، أو وكلاء العلاج الكيميائي آخر) تحمل خطر الآثار الجانبية الشديدة مع استخدام على المدى الطويل 13. ولذلك، فإنه من مصلحة كبيرة لديهم الأدوات المناسبة، مع القدرة على تحديد جزيئات بأمراض محددة، والتي يمكن في نهاية المطاف أن تستهدف لها تأثير مضاد للالتهابات المطلوب في حين تبقى غير سامة 14.

استخدمت الموجودة في أساليب المختبر مثل ثابت التصاق الكريات البيض فحص في وقت مبكر عام 1976 15. وقد استخدمت غرفة تدفق موازية لأول مرة في المختبر في عام 1987 لدراسة التفاعلات الكريات البيض البطانية تحت ظروف التدفق. في هذه التجارب، وحفز هومان تم perfused لالكريات البيض النوى (PMNs) من الدم الوريدي على أحادي الطبقة من الخلايا الأولية الإنسان الوريد السري البطانية (HUVECs). للسيطرة على الأوضاع تدفق الدورة الدموية، كان يعمل في جامعة هارفارد مضخة جهاز حقنة 16. بدلا من ذلك، لتجنب عزلة مصطنعة الكريات البيض، تم استخدام الدم كله في مزيج مع الغرفة الزجاجية المغلفة مع جزيئات الالتصاق يجمد 17.

لتجنب التحفيز الكريات البيض ودراسة ميكانيكيا تفاعلها مع جزيئات الالتصاق في ظل الظروف الفسيولوجية تقريبية، وهو خارج الحي autoperfused، خارج الجسم، وقد وضعت الدائرة الشريانية 16. في هذه الدائرة، يتدفق الدم بين الحق العام الشريان السباتي الأيسر والوريد الوداجي الخارجي للماوس يعيش تحت التخدير، مما يسمح للتفاعل PBLs الأم داخل غرفة زجاجية microflow المغلفة مع جزيئات الالتصاق واحدة أو يجمد المشترك. والميزة الرئيسية لهذا التنفسيم هو القدرة على توظيف الفئران المعدلة وراثيا، والتي يتم التلاعب مسارات التهابات مباشرة أو غير مباشرة. بالإضافة إلى ذلك، هناك القدرة على تحديد مساهمة معزولة من جزيئات التصاق الكريات البيض إلى التهاب، وخالية من تفعيل الخارجي، في ظل ظروف التدفق. تطبيق منظم تدفق عند نقطة مدخلات غرفة التدفق يوفر مجموعة واسعة من الاختلافات التجريبية لقوى القص لتقليد إما الشرياني أو الوريدي أنظمة 18-22. نحن هنا وصف بتفصيل كبير بروتوكول بشأن إعداد وأداء المجراة سابقا autoperfused microflow غرفة الفحص.

Protocol

تم التعامل مع جميع التجارب على الحيوانات وفقا للجمعية للبحوث في بيان الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية، والمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها في ماساتشوستس العين والأذن المستوصف جنة رعاية الحيوان. قبل يوم من التجربة: 1. إعداد أنابيب لغرفة تدفق لإعداد الجانب الوداجي، ربط 1 سم PE10 أنابيب البولي ايثيلين ل6 سم أنابيب السيليكون تليها 5 سم أنابيب البولي ايثيلين. بالنسبة للجانب السباتي، وإعداد بالمثل إلى الجانب الوداجي مع إضافة T-أنبوب داخل أنبوب السيليكون 6 سم حوالي 1.5 سم بعيدا عن 1 سم أنابيب البولي ايثيلين (الشكل 1A، B). من أجل إدراج T-أنبوب، وتوسيع أنبوب السيليكون باستخدام ملقط غرامة إذا لزم الأمر. قم بتوصيل أحد طرفي من 10 سم من أنابيب السيليكون إلى محول الضغط ثم أدخل الطرف T من ليالي السباتيبيئة تطوير متكاملة T-أنبوب إلى الطرف الآخر. ضمان الاتصال مواقع ضيقة وتسرب مجانا. تطبيق قطعة مستطيلة صغيرة من parafilm حول المكان الذي يناسب أنابيب معا، وإذا لزم الأمر، لمنع تسرب (الشكل 1C). 2. طلاء الغرفة إعداد البروتين طلاء السطح البطانية (على سبيل المثال، P selectin، التصاق بين الخلايا جزيء-1 (ICAM-1)، الأوعية الدموية التصاق الخلية البروتين-1 (VCAM-1)) في 0.1٪ BSA. كمبدأ توجيهي، 1 ميكروغرام من البروتين في 200 ميكرولتر BSA يكفي لمعطف 4-5 غرف. باستخدام حقنة 1 مل متصلة إبرة 25 G، ولبث كل غرفة (0.04 X 0.4 × 50 ملم) مع بروتين طلاء السطح البطانية. تخزين غرف المغلفة في أنبوب 15 مل عند 4 درجات مئوية خلال الليل. في يوم من التجربة: 3. إعداد غرفة إزالة غرف المغلفة من 4 ° C وتوصيل أنابيب الوداجي والسباتي على كل جانب. ختم connectiالإضافات التي تمتد بعناية قطعة مستطيلة صغيرة من parafilm حول المكان الأنابيب يلتقي الغرفة. باستخدام حقنة، وملء الغرفة وأنابيب بنسبة 0.1٪ BSA (تحقق من وجود تسرب). احتضان لمدة 45 دقيقة. إعداد طبق بيتري 35 ملم لعقد الغرفة عن طريق قطع الشقوق على كل جانب من الطبق. تحقيق الاستقرار في غرفة في الشقوق. ثم استخدم قطرة صغيرة من السيليكون ليضعوا الغرفة إلى الطبق في موقع حقق. تأكد من أن الغرفة هو مستوى من خلال النظر تحت المجهر. السماح للسيليكون لتجف لمدة 15 دقيقة على الأقل. ملء 60 مل قفل المحاقن مع الهيبارين والاتصال إلى محول الضغط. قم بتوصيل محول الضغط على أنابيب السباتي في الترتيب التالي: محول، وأنابيب السيليكون، وT-الأنبوب. استخدام 1 سم PE50 بين أنابيب السيليكون متصلا محول وT-أنبوب لتأمين الاتصال. تمرير أنابيب السيليكون الشريان السباتي عن طريق المشبك الضغط (1D الشكل). تشغيل 100USP الهيبارين ترولاف أنابيب وغرفة حتى عدم وجود فقاعات الهواء. 4. إعداد البرامج لإعداد البرنامج، قم بتشغيل الكمبيوتر، المجهر، وجهاز مختبر مفتوح. انقر مرتين على تطبيق جناح لايكا (LAS) (أو ما يعادلها) وإعداد مجلد لحفظ الفيديو: تصفح → → اكتساب فيلم → تحديد تسلسل من لقطات (لقطات = 15، وقت التسجيل = 30 ثانية، وفترات = 15 ثانية) ثم انقر فوق علامة "+" للتأكيد. لتسجيل ضغط تدفق فتح LabChart (أو ما يعادلها) ملف وتنسيق اسم الملف إلى مجلد التسجيل في الخطوة 4.1 أعلاه. 5. إجراء العمليات الجراحية تخدير الماوس القديم الأسبوع 8-10 باستخدام مزيج من الكيتامين (60 ملغ / كلغ) وزيلازين (6 ملغ / كلغ) حقن داخل peritoneally (IP). تأكد من أن يتم تحقيق التخدير العميق في غضون 5-10 دقيقة عن فقدان دواسة الانسحاب لا ارادي. إذا لزم الأمر، الأيزوفلورينتسليمها عن طريق قناع الوجه يمكن أن تعطى حسب الحاجة. في حين تحت التخدير، ضع وسادة تحت الاحترار القفص وتعيين إلى 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة الجسم. بمجرد تأكيد التخدير السليم، ضع الماوس في موقف بطني ومعطف العينين مع مرهم باسيتراسين لمنع جفاف العين. بعد ذلك، حلق الشعر في موقع شق باستخدام شفرة حلاقة وتنظيف شامل للموقع مع الكحول. مرة واحدة تخدير كامل تأمين الحيوان مع الشريط حفظ الماوس في موقف بطني. فضح منطقة الرقبة مع مقص وإزالة الغدة الدرقية لفضح القصبة الهوائية والأوعية (الشكل 2A). تنظيف الشريان السباتي حتى يتعرض بشكل كامل مع الحرص على عدم تلف العصب المبهم (الشكل 2B). أضعاف قطعة من الخيط وتمرير ينحني تحت الشريان السباتي ثم قطع في منعطف لذلك هناك الآن 2 قطعة من الخيط تحت الشريان السباتي. حلقة كل خياطة في عقدة (لا تشديدعقدة). كرر نفس الإجراء لفضح حبل الوريد الأيسر (الشكل 2C)، وإعداد الغرز بنفس الطريقة (الشكل 2D). قم بتوصيل أنابيب إلى الأوعية الدموية الماوس. يعالج بالهيبارين الماوس عن طريق حقن 1 مل من الهيبارين IP. تشديد خياطة العليا على الشريان السباتي. وضع المشبك سفينة منخفضة كما يمكن أن تذهب على الشريان السباتي (الشكل 3A). استخدام ملقط لعقد الشريان عن طريق خياطة العليا وإجراء شق صغير، حوالي 1/8 من محيط الشريان، وذلك باستخدام microscissors (الشكل 3B). تمرير أنابيب الشريان السباتي من خلال العقدة الثانية في خياطة العليا وإلى شق المحرز في الشريان. ربط قبالة أقل خياطة بحيث يتم اغلاق الشريان حول أنابيب (ينبغي بذل عدة عقدة لضمان وجود ختم ضيق، الشكل 3C). كرر نفس الإجراء لإدخال الوريد الوداجي أنابيب (السفينةليست هناك حاجة المشبك للجانب الوداجي، الشكل 3D). اختبار تدفق عن طريق الإفراج عن المشبك السفينة. إذا كان هناك أي تسرب تحريك الماوس لالمجهر وتوصيل أنابيب السباتي والوريد الوداجي إلى أنابيب الغرفة (انظر الفيديو المرفق للتظاهر من إجراء العمليات الجراحية). 6. تسجيل المتداول السرعة فتح المشبك السباتي لملء غرفة، مما يجعل الدائرة مع نظام الدورة الدموية الماوس. يسمح الدم أن تعمم لمدة 3-5 دقائق حتى يتسنى للظروف تدفق استقرار. وخلال فترة الانتظار من 3-5 دقائق، وضبط مرحلة المجهر بحيث الغرفة هو مستوى واحدة من نهاية إلى أخرى مع الهدف المجهر وحافته موازية مع تسجيل الفيديو نافذة على الشاشة. ملء طبق بيتري المعدلة تحتوي على غرفة الزجاج مع الماء ثم خفض الهدف الغمر بالماء 10X في طبق حتى أن الخلايا التي تتدفق من خلال غرفة مرئية.قد يكون شدة الضوء إلى تعديل للعرض كاف من الخلايا. عموما أقل كثافة هو أفضل. ضبط المشبك على أنابيب بحيث محول يقرأ ثابت 30 ملم زئبق، ربط لضغط تدفق الفسيولوجية المتوسط، أو كما تريد. اضغط على "ابدأ" لبدء تسجيل كل من الفيديو والضغط مع أول مرور الوقت على مقربة من نهاية الوريد والتحرك ضد تدفق نحو نهاية السباتي حتى الانتهاء. ملاحظة: العديد من الشروط طلاء باستخدام جزيئات الالتصاق مختلفة يمكن دراستها في نفس الماوس باستخدام غرف متعددة. فقط يتم تسجيلها غرفة واحدة في وقت واحد. عندما يتم الانتهاء من التسجيل، وإغلاق صمام في موقع المدخلات، ووقف تدفق الدم. إزالة غرفة وتناسب غرفة جديدة (المغلفة مع جزيء التصاق مختلفة) إلى الدائرة باستخدام ملقط غرامة في يد واحدة وملقط مخدد في اليد الأخرى. استئناف تسجيل للغرفة جديدة كما هو موضح في الخطوات6،1-6،4. الموت ببطء كل الفئران عن طريق CO 2 الاختناق تليها خلع الحبل الشوكي في نهاية التجربة. والمحطة، وبالتالي، والموت الرحيم الإجراء الفئران عن طريق خلع الحبل الشوكي في نهاية التجربة. 7. تفسير نتائج لتحليل البيانات المسجلة استخدام "M TrackJ" البرنامج المساعد لبرنامج يماغيج 23. تحويل الملف إلى تدرج الرمادي التي حدد ملف → استيراد → → تحويل AVI إلى تدرج الرمادي. توحيد الأطر التي حدد → → صورة الملكية → أدخل الفترات الزمنية الإطار (ط) → العالمية. حساب فترات إطار بقسمة مجموع مدة الفيديو (عادة 30 ثانية) من قبل عدد من الإطارات في فيديو واحد (كما هو موضح في الزاوية العليا من صورة J نافذة الفيديو). قياس تدفق كل الكريات البيض التي حدد البرنامج المساعد → M TrackJ → اضافة مسارات → اختيار الكريات البيض→ تتبع ذلك مع كل إطار لمدة 15 – 20 ثانية → دمج. كرر الخطوة 7.4 لجميع الكريات البيض في الرأي. تحديد متوسط ​​المتداول سرعة من الكريات البيض التي حدد مقياس → تظهر عمودين → نسخ كافة M TrakJ: اليسروع في جدول بيانات. العمود المسمى "يعني V" هو المتداول الكريات البيض تقاس بالبكسل / ثانية. تحويل إلى ميكرون / ثانية عن طريق قسمة 2/3. لتحليل البيانات تسليط الضوء على الضغط والتصدير في جدول بيانات وإجراء العملية الحسابية التالية: ΔP (ملم زئبق) و ر (داين / سم 2) للمقارنة بين كل المجموعة التجريبية. مرة واحدة محسوبة، نسخ البيانات إلى برنامج موشور عن الرسوم البيانية.

Representative Results

أثناء التسجيل كل الكريات البيض التفاعل فقط هي واضح على الغرفة. ويمكن رؤية النتائج من تجربة تمثيلية في الشكل (4). وتشير السهام البيضاء إلى الكريات البيض الفردية التي تم التقاطها بواسطة جزيء التصاق الفائدة والمتداول على طول الغرفة بين تلك التدفق الحر أخرى داخل تدفق الدم. وهناك قطعة أثرية مشتركة خارج الغرفة ويمكن رؤية مع الأجواء المظلمة الكبيرة في جميع الصور. المجالات المظلمة تساعد القارئ نقدر حركة الكريات البيض في ما يتعلق نقطة ثابتة. ويمكن رؤية الكريات البيض التقدم على مدى فترة من 22 ثانية فيما يتعلق المجالات. الرسم البياني في الشكل نفسه يظهر المؤامرة الأخيرة من البيانات حيث يقلل TX1 سرعة المتداول (التحول إلى اليسار) وTX2 يزيد من سرعة (التحول إلى اليمين) مقارنة بالكنترول. 0 "/> الشكل 1: إعداد أنابيب للغرفة التدفق. (A) الأدوات اللازمة لأنابيب والتجمع غرفة (غرفة زجاجية صغيرة 0.4 X 0.04 × 50 مم، أنابيب البولي ايثيلين PE10، PE60 أنابيب البولي ايثيلين، والسيليكون أنبوب 002، أنبوب Y، T أنبوب، طبق بيتري 35 ملم، ملقط غرامة، مقص غرامة، حامل أنبوب، المشبك الأوعية الدموية، 7-0 خياطة الحرير. (ب) إعداد الشريان السباتي والوريد الوداجي أنابيب لإعادة توجيه تدفق الدم-الماوس من خلال غرفة المغلفة. (C) ربط الشريان السباتي أنابيب إلى محول الضغط. (D) وتمرير أنابيب من محول من خلال المشبك لضبط معدل تدفق الدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <bص /> الشكل 2: كشف الشريان السباتي والوريد الوداجي (A) قطع بعناية منطقة الرقبة لفضح القصبة الهوائية (B) تنظيف الشريان السباتي الصحيح بحيث يمكن تمرير قطعة من الخيط تحت السفينة (منقط الأصفر. ويحدد خط الشريان السباتي). (C) تنظيف حبل الوريد الأيسر بحيث يمكن تمرير قطعة من الخيط تحت السفينة (يحدد خط أصفر منقط حبل الوريد). (D) الترتيب المرتبطة بشكل فضفاض الغرز في المناطق العلوية والسفلية من الشريان السباتي والوريد الوداجي (وأشارت سهام المناطق العلوية والسفلية من السفن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: توصيل الأنابيب إلى tانه الشريان السباتي والوريد الوداجي. (A) تشديد عقدة العليا على الشريان السباتي ووضع المشبك دون أدنى عقدة. (ب) استخدام microscissors، وجعل شق صغير في الشريان السباتي، حوالي 1/8 محيط (منقط دائرة صفراء تشير إلى شق). ( C) إدراج أنابيب في الشريان السباتي وآمنة مع اثنين على الاقل من الغرز (يظهر خط منقط الأخضر أنابيب وخط منقط الأصفر الشريان السباتي). (D) وبالمثل إدراج أنابيب في الوداجي (ويظهر خط منقط الأخضر أنابيب و الأصفر خط منقط حبل الوريد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: دوام الممثل من الكريات البيض المتداول من خلال تدفق شامنوفمبر (مقياس بار = 100 ميكرون) (السهام البيضاء تشير إلى الكريات البيض المتداول). يصور الرسم البياني نتائج ممثلة بعد تصدير إلى برنامج الرسوم البيانية (TX1 وTX2 هي مجموعات العلاج التجريبية ونسبة النقر إلى الظهور هو مجموعة المراقبة). TX1 يمثل العلاج في الكريات البيض التي تبطئ مما يؤدي إلى نقص في الكريات البيض المتداول السرعة والتحول الأيسر من الرسم البياني مقارنة مع مجموعة غير المعالجة (CTR)، في حين TX2 يؤدي إلى تحول الصحيح مما يعكس زيادة في الكريات البيض المتداول السرعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

عملية التوظيف الكريات البيض هي خطوة حاسمة في الاستجابة الالتهابية. أنه ينطوي على هجرة الكريات البيض من الدورة الدموية نحو الأنسجة المستهدفة، حيث أنها قادرة على ممارسة وظيفة المستجيب الخاصة بهم. تجنيد الكريات البيض هو جزء لا يتجزأ في مجموعة متنوعة من الحالات الالتهابية مثل ويحات تصلب الشرايين، واحتشاء عضلة القلب، ونقص التروية / ضخه، وجراحة زرع 1، وكذلك متعددة العصبية التهابات الجهاز العصبي المركزي الشروط المتعلقة 10-12،20،24،25. نظرا لتنوع الظروف المرض الذي يمتد التوظيف الكريات البيض، توفر غرفة microflow autoperfused أداة لا غنى عنها والسماح للمحقق القدرة على دراسة ديناميكيات الهجرة الكريات البيض.

على مدى العقود القليلة الماضية، تم تطوير مجموعة متنوعة من فحوصات في المختبر لدراسة ديناميات الكريات البيض خلية التصاق 26. للأسف، كل هذه المقايسات تتطلب استخراجالكريات البيض من الدم، وإدخال تفعيل الميكانيكية. للحصول على أقرب إلى البيئة في الجسم الحي، أدلى التعديلات لجمع عينات الدم الكامل والسيطرة على ظروف تدفق الدورة الدموية 16،17. هنا، نحن تمديد التقدم السابقة في هذا المجال من خلال ربط غرفة المغلفة لنظام الدورة الدموية الماوس. ونحن قادرون على تنظيم تدفق الدم إلى مجموعة وفيزيولوجي ودراسة ديناميات الكريات البيض المتداول. غرفة المغلفة يعطينا القدرة على دراسة التفاعلات الكريات البيض مع جزيئات الالتصاق محددة. لأن النظام يعمل كوحدة تشغلها الماوس الحية، فإنه يحاكي بشكل وثيق بالبيئة الطبيعية، مما يسمح لنا لدراسة التفاعلات الكريات البيض البطانية في مجموعة متنوعة من نماذج الماوس المناعية. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام يتيح لنا الاستفادة من عدة نماذج الماوس الوراثية المتاحة. في حين أن النظام لا تكرار تماما البيئة في الجسم الحي، لأنها توفر منبرا لدراسة specifiعناصر ج من الكريات البيض في ظل الظروف الفسيولوجية، وهو إنجاز لم يكن ممكنا في السابق. على الرغم من هذا يأخذنا خطوة أقرب إلى بيئة أكثر الفسيولوجية هناك قيود على النظام. فإنه لا تكرار تماما مصفوفة 3D معقدة من الأوعية الدموية لذلك نحن قادرون فقط لتقييم عناصر معينة من التفاعلات الكريات البيض التي تقتصر على طلاء الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تؤخذ بعناية كبيرة لضمان وجود نظام مغلق لتداول الماوس وذلك باتباع جميع الخطوات المذكورة في البروتوكول. سوف إدخال فقاعات الهواء تؤثر بشكل كبير على دقة واستنساخ التجارب.

في حين وصفنا استخدام غرفة Autoperfused Microflow لتقييم ديناميات المتداول الكريات البيض الإجراء لديه القدرة على أن يشخص من قبل محققين لدراسة مجموعة متنوعة من الأمراض. على سبيل المثال، الخلايا السرطانية metastasize بالإعراب عن العديد من integrins المشتركة بين الكريات البيض. Studyinز ديناميات المتداول في الإعداد الذي يحاكي بشكل وثيق بيئة في الجسم الحي يمكن أن تساعد في معرفتنا، وربما التنبؤ، لطبيعة الغازية من الخلايا السرطانية معينة. نهج واحد ممكن أن يكون في الجمع بين تقنية وضع العلامات لخلايا السرطان، مثل GFP 27، جنبا إلى جنب مع مقايسة غرفة تدفق لتتبع ديناميات المتداول من الخلايا السرطانية معربا عن GFP. ونظرا لمرونة طلاء الغرفة مع مجموعة متنوعة من المواد وربط غرف متعددة لنفس الماوس سيكون من المثير أن نرى كيف يتم تعديل هذا الإجراء لاستخدامها في مختبرات أخرى في تركيبة مع الفئران المعدلة وراثيا ونماذج المرض. تقنية وصفنا هنا يمس فقط على إمكانية تطبيق أوسع نطاقا التي يقتصر فقط بواسطة إبداع المحقق.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد البحث عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعيون من المعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجائزة: R01EY022084 / S1 (KMC)، T32EY007145 (HS) وP30EY014104. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وقدم دعم إضافي من قبل الليونز صندوق ماساتشوستس العين أبحاث (KMC) والجائزة الخاصة إجابات من البحوث للوقاية من العمى (لKMC).

Materials

Material Vendor Part number
Micro glass chamber 0.4×0.04x50mm VitroCom 2540-050
Polyethylene tubing PE 10 Fisher Scientific 427400
Polyethylene tubing PE 60 Fisher Scientific 427416
 Silicone tubing 002 Fisher Scientific 11-189-15A
Y tube Value Plastics Y210-6
T tube value plastics T410-6
Silicone gel Hardware store – Home Depo
35mm petri dish Corning 430165
Parafilm Pechiney Plastic Packaging PM996
Fine forceps FST 11253-25
Fine scissors FST 15000-08
 Tube holder FST 00608-11
 Clamp applicator FST 18057-14
 Vascular clamp FST 18055-04
6-0 silk sutures George Tiemann & Co 160-1215-6/0
25x1G  needles BD 305125
30×1/2G needles BD 305106
Heparin 100 USP units/ml Hospital pharmacy
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response. Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).
  2. Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).
  3. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).
  4. Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1. The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).
  5. Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1. The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).
  6. Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture. Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).
  7. Shaw, S. K., et al. Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration. The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).
  8. Woodfin, A., et al. JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration. Blood. 110, 1848-1856 (2007).
  9. Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. Adhesion molecules and atherosclerosis. Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).
  10. Parmeggiani, F., et al. Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration. Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).
  11. Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. Molecular pathology of age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).
  12. Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. Para-inflammation in the aging retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).
  13. Peterson, K., et al. Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report. Drug Class Reviews. , (2010).
  14. Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease. Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).
  15. Stamper, H. B., Woodruff, J. J. Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules. The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).
  16. Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
  17. Abbitt, K. B., Nash, G. B. Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro. British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).
  18. Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin. Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).
  19. Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions. BioTechniques. 30, 388-394 (2001).
  20. Moalem, G., et al. Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy. Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).
  21. Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).
  22. Almulki, L., et al. Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  24. Rapalino, O., et al. Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats. Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).
  25. Yoles, E., et al. Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).
  26. Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells. Blood. 62, 889-895 (1983).
  27. Connor, K. M., et al. Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells. Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).

Tags

Leukocyte-endothelial InteractionsEx Vivo Autoperfused Microflow Chamber AssayInflammationPeripheral Blood Leukocytes (PBLs)Adhesion MoleculesIntravital MicroscopyFlow ConditionsLeukocyte Rolling VelocityImageJ

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mulki, L., Sweigard, J. H., Connor, K. M. Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay. J. Vis. Exp. (94), e52130, doi:10.3791/52130 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image