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Biology

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

Published: January 03, 2015
doi:
10.3791/52118
, ,
1Harvard Medical School, 2Division of Hematology/Oncology,Boston Children’s Hospital, 3Department of Pediatric Oncology,Dana-Farber Cancer Institute, 4Howard Hughes Medical Institute

Summary

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Abstract

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

Introduction

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.

The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.

Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.

Protocol

Diseño 1. CRISPR SgRNAs Diseño manualmente o con herramientas en línea de libre disposición 7. Utilice estas herramientas para ayudar a identificar secuencias guía que minimicen partidos genómicas idénticas o casi-partidos para reducir el riesgo de escisión lejos de los sitios de destino (fuera de objetivo efectos). Asegúrese de que las secuencias guía constan de un 20-mer ("secuencia de protospacer") aguas arriba de una secuencia de "NGG" ("protospacer motivo adyacente" o PAM) en el sitio de reconocimiento genómico. NOTA: La figura 1 describe las posibles estrategias de eliminación de genes y elementos no codificantes. Para crear un gen knockout, dos sgRNA ubicados dentro de los exones enriquecerán clones de deleción incluso monoallelic para la pérdida de la función. Esto es debido a la alta frecuencia de indeles formadas en alelos no borrado 12, que son susceptibles de causar mutaciones del marco de lectura que conducen a absurdo mediada por la decadencia de la transcripción de mRNA (Figura 1B). Utilice laejemplo guías para la deleción pretendida de Pim1 en el ratón (Mus musculus; Tabla 1, Figura 2A). NOTA: En este ejemplo, la secuencia de protospacer sgRNA-A y PAM suceden a caer en la cadena inferior (Crick), mientras que la secuencia de protospacer sgRNA-B y PAM caen en la parte superior (Watson) capítulo (Figura 2). Sin embargo, DSB se producirá independiente de la orientación de la secuencia de protospacer / PAM con respecto a la cadena superior o inferior. Determinar el complemento inverso (RC) de cada secuencia guía. Ejemplo revertir secuencias complementarias de la Pim1 sgRNA de la Tabla 1 se encuentran en la Tabla 2. Obtener 24- o 25-mer oligos para cada guía y su complemento inverso asociado incluyendo nucleótidos adicionales para fines de clonación y expresión. NOTA: Aquí se discute el uso de la pSpCas9 (BB) plásmido (pX330) (Addgene plásmido ID 42230). Este plásmido permite la simultáneaexpresión de sgRNA y SpCas9, pero no contiene marcadores para la selección 7. Otras construcciones se pueden utilizar, tales como pX458 (Addgene plásmido ID 48138) o pX459 (Addgene plásmido ID 48139), que incluyen GFP y puromicina como marcadores seleccionables, respectivamente, o construcciones en las que múltiples sgRNAs pueden expresarse a partir de un único plásmido. Añadir "CACC" antes de la secuencia guía de 20-mer y "AAAC" antes de complemento inverso de la guía para la clonación en el vector pX330 usando la enzima de restricción BbsI (Tabla 3). Añadir un nucleótido G después de la secuencia CACC y antes de la 20-mer si la primera posición de la 20-mer no es la expresión de G. sgRNA a partir del promotor U6 del vector pX330 se ve reforzada por la inclusión de un nucleótido G después de la secuencia CACC . Añadir una C en el extremo 3 'del oligo complemento inverso (por ejemplo, sgRNA-A en la Tabla 4). Los oligos resultantes serían oligos 25-mer. Cómoembargo, si la primera posición de la (secuencia protospacer) 20-mer es G, no añadir otro G (por ejemplo, sgRNA-B en la Tabla 4) y no añadir C a la posición final de la oligo complemento inverso. En este caso, los oligos resultantes serían oligos 24-mer (Tabla 4). 2. Diseño de eliminación Primers Screening Diseño de un conjunto de cebadores internos de la secuencia que se desea borrar ("banda no eliminación") y otro conjunto de cebadores aguas arriba y aguas abajo de los sitios de corte sgRNA ("banda eliminación"; Figuras 1-2). En ausencia de la eliminación, la "banda de supresión" es a menudo demasiado grande para amplificar eficientemente. Típicamente utilizar cebadores de al menos 100 pb desde el sitio de escisión predicho para asegurar la detección no se vería afectada por un pequeño indel en el sitio diana sgRNA. Diseñar cebadores adicionales para analizar la cicatrización (pequeños indeles producidos en el sgRNA cleavage sitio sin la eliminación prevista). Use un par de adelante y atrás primers que flanquean cada sitio de destino sgRNA (a menos de 150-350 pb) para amplificar el sitio de destino sgRNA examinar para las cicatrices. Esto puede ser útil para caracterizar las alelo no suprimido en clones de deleción monoallelic. Para pequeñas deleciones (como la "banda de supresión" todavía puede amplificar), resolver los amplicones en un gel de agarosa para determinar si el tamaño es consistente con la presencia o ausencia de deleción. Para este enfoque, los cebadores internos descritos en el paso 2.1 se pueden omitir. Clonación 3. CRISPR Recocido y fosforilar oligos. Oligos Resuspender a una concentración de 100 mM en ddH 2 O. Prepare una mezcla de 10 l de reacción para cada guía y su complemento inverso: 1,0 l sgRNA de 24 ó 25 oligo-mer (100 M; consulte el paso 1.4), 1,0 l sgRNA de 24 o 25-mer complemen revertirt oligo (100 M; véase el paso 1.4), 1,0 l 10x T4 Ligadura Buffer, 6,5 l ddH 2 O, y 0,5 l T4 polinucleótido quinasa (PNK) (10.000 U / ml). NOTA: fosforilada oligos se pueden pedir en su lugar. Para este enfoque, se omite el uso de T4 PNK. Recocido en un termociclador con los siguientes parámetros: 37 ° C durante 30 minutos; 95 ° C durante 5 min y luego la rampa hasta 25 ° C a 5 ° C / min. Diluir oligos 01:10 en ddH 2 O (por ejemplo, 1,0 l recocidos oligos + 9,0 l ddH 2 O para obtener una concentración de 1 mM). Oligos ligan los recocidos en pX330 utilizando una estrategia de clonación asamblea Golden Gate 26. Preparar una mezcla de reacción de 50 l: 100 ng del vector circular pX330, 1,0 l oligos hibridados (1 M; véase la etapa 3.1.4), 5,0 l de tampón de enzima de restricción (10x), 4,0 l (20 U) de enzima de restricción BbsI (5000 U / ml), 5,0 μl ATP (10 mM), 0,25 l (5 g) BSA (20 mg / ml), 0.375 l (750 U) de ADN ligasa T4 (2.000.000 U / ml), y H 2 O hasta un volumen final de 50 l. Esta reacción puede reducirse a un volumen final más pequeño si es necesario. Las muestras se ejecutan en un termociclador usando los siguientes parámetros: Ciclos 1-20 (37 ° C durante 5 min, 20 ° C durante 5 min); Ciclo 21 (80 ° C durante 20 min). Estas condiciones de ciclado permiten para la digestión y ligación a ocurrir en una reacción (véase el paso 3.2). Transformar 10 l de DH5 E. coli células con 1 l de reacción (de 3.2.1 – 3.2.2). Placa sobre una placa de agar de caldo de lysogeny (LB) con 100 g / ml de ampicilina e incubar O / N a 37 ° C. Escoja 2-3 colonias e inocular en una cultura-mini prep. Realizar mini-prep para cada muestra y secuenciar cada colonia utilizando un cebador directo promotor U6: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Esto es arcebador de secuenciación epresentante; otros cebadores flanqueantes pueden ser utilizados. Elija una colonia secuencia verificada e inocular en una cultura maxi-prep. Prep tamaño puede hacerse a escala basado en el rendimiento de ADN requerida. Realizar maxi-prep para cada CRISPR / Cas9 constructo. 4. Transfecting CRISPRs en células de interés NOTA: Este protocolo consiste en la entrega de CRISPR plásmidos / Cas9 por electroporación 27. Este protocolo se describe en detalle para células de eritroleucemia murina (MEL), una línea celular de suspensión. El medio de cultivo en todos los pasos consiste en DMEM suplementado con 2% de penicilina / estreptomicina y 1% de L-glutamina, que se utiliza para las células MEL. Sin embargo, la transfección transitoria de CRISPR / plásmidos Cas9 puede ser adaptado con éxito a numerosos tipos de células usando las condiciones de cultivo preferidas y estrategias de transfección para cada tipo de célula. Mientras que las células MEL son células en suspensión, de instrucciones de células adherentes hTambién ave sido incluido. Asegúrese de que hay 2 x 10 6 células por par CRISPR. Resuspender 2 x 10 6 células en 100 l de solución de electroporación y añadir a la cubeta de electroporación. Añadir 5 g de cada uno CRISPR / Cas9 construcción (10 mg en total). Añadir 0,5 g de constructo de expresión de GFP. Células electroporar con 250 voltios durante 5 ms en una cubeta de 2 mm utilizando un sistema de electroporación. NOTA: Como alternativa, utilice otro método de transfección como catiónico transfección basada en liposomas. Optimizar las condiciones de transfección para cada línea celular con un constructo indicador para asegurar la entrega plásmido robusta antes de intentar la edición genoma. Inmediatamente transferir solución desde la cubeta en 1 ml de medio de cultivo después de la electroporación. Reducir al mínimo el tiempo entre la electroporación y la transferencia de la solución en los medios de comunicación para mejorar la viabilidad celular. Incubar a 30 – 37 ° C durante 24-72 horas. 30 ° C puede mejorar genomaedición de la eficiencia, pero 37 ° C es aceptable. 5. Fluorescencia clasificación de células activadas (FACS) de células transfectadas Preparar las células para FACS mediante la filtración a través de un filtro de 50 micras en un tubo de FACS. FACS ordenar la parte superior ~ 3% de células GFP positivas con el fin de enriquecer para las células que recibieron altos niveles de la CRISPR / Cas9 construye. Placa de células clasificadas individualmente en placas de fondo redondo de 96 pocillos usando clasificador o mediante el uso de dilución limitante en 30 células por 96 pocillos de fondo redondo de placa. Optimizar chapado en el tipo de célula utilizado a dilución limitante antes de realizar este paso para obtener de manera fiable aproximadamente 30 células por placa de 96 pocillos. Incluir 100 l por pocillo de medio de cultivo celular. Para las células restantes ordenados ("a granel") que no se colocaron en placas, congelar medio de las células para el chapado futuro. Placa de la otra mitad para la detección y la validación de imprimación (consulte el paso 6). NOTA: Este pROTOCOLO es para células en suspensión. Las células adherentes pueden crecer ya sea como células individuales en la placa de 96 pocillos de fondo plano o en un plato de 10 cm a baja concentración de modo que una sola célula individuo clones derivados pueden ser recogidos y se trasladaron a una placa de 96 pocillos de fondo plano. Permita que las células granel a incubar a 37 ° C durante 3-7 días, y permiten a los clones para incubar a 37 ° C durante 7 – 14 días. Vary estos tiempos en función del tiempo de duplicación de la línea celular utilizada. NOTA: Este tiempo de incubación permite la proliferación de células suficiente para la detección de ADN genómico (ADNg) para la supresión prevista por PCR (consulte los pasos 6.1 y 7.1). Las células a granel han proliferado suficientemente cuando la concentración supera ~ 100.000 células / ml o para las células adherentes, las células han llegado a ~ 80% de confluencia. Los clones suficientemente han proliferado una vez macroscópicamente visible con ~ 2 mm de diámetro. 6. Primer Validación y detección de CRISPR / Supresión Mediada-Cas9 Aislar gDNA de células clasificadas padres ya granel resuspendiendo los sedimentos celulares parentales ya granel en 50 l de solución de extracción de ADN. NOTA: Generalmente ~ 100.000 células se utilizan para la extracción de ADN, aunque una amplia gama de número de células es aceptable. Las células a granel según se componen de una población policlonal expuesto a sgRNA-A y sgRNA-B (ver paso 5). El propósito de la siguiente PCR es validar cebadores y verificar la presencia de la deleción genómica previsto. Ejecute muestra en termociclador y ejecute el siguiente programa: 65 ° C durante 6 minutos, 98 ° C durante 2 min para extraer gDNA. Mida la concentración de ADN. NOTA: Mientras los pasos 6.1 y 6.2 recomiendan un método eficiente para la extracción de ADN, cualquier método para el aislamiento de ADN genómico se puede utilizar para poder llevar a cabo PCR en el paso 6.3. Montar un 20 l de PCR con los siguientes componentes: 10 l de la mezcla 2x PCR, cebador directo 0,5 l (10 _6; M), 0,5 l de cebador inverso (10 mM), 50-100 ng gDNA, y H 2 O hasta 20 l. Utilice los cebadores diseñados en el paso 2 anterior. Llevar a cabo la PCR para "banda no eliminación" y "banda de supresión" en distintas reacciones. NOTA: Numerosos polimerasas se pueden utilizar para el paso 6.3. Las muestras se ejecutan en un termociclador usando los siguientes parámetros: 95 ° C durante 15 min, 35 ciclos de (95 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min) y 72 ° C durante 10 minutos . Optimizar las condiciones de PCR para cada par de primers diseñados sobre la base de pruebas de las células a granel ordenados. Ejecutar las muestras en un 2% en gel de agarosa a 10 V / cm utilizando 1x Tris-EDTA buffer acetato (TAE). Examinar muestras para la presencia / ausencia de la no eliminación y bandas de deleción (Figura 2). Considere la posibilidad de multiplexación la "eliminación" y "no-eliminación" pares de cebadores de PCR en una sola reacción. Optimizar multiplexaciónen una población policlonal (es decir, mayor células clasificadas) antes de cribado de clones individuales. Es crítico que los amplicones de deleción y no de deleción pueden resolver fácilmente en un gel de agarosa para la multiplexación. 7. Proyección CRISPR / Cas9 Clones para supresiones y Selección Clone Para las células en suspensión, la transferencia de todos los clones a una placa de 96 pocillos único que ya contiene 50 l de medios de cultivo de células por pocillo para un volumen final de 150 microlitros. Esto facilita la detección al permitir una pipeta multicanal que se utilizará para el resto de los pasos en el paso 7. Transferencia de 50 l de cada pocillo (dejando 100 l en cada pocillo) a una placa de 96 pocillos PCR usando una pipeta multicanal. Centrifugar la placa de PCR a 400 xg durante 5 min y retirar el sobrenadante accionando la placa de PCR sobre un fregadero. Añadir 50 l de solución de extracción de ADN por pocillo y resuspender. Continúe con el paso 7.3 para células en suspensión. </li> Para las células adherentes, medios de aspirado. Añadir 20 l de 0,05% de tripsina-EDTA a cada pocillo con un clon presente. Resuspender las células en 200 l de medios de comunicación. Pipetear la mezcla para separar las células. Plate 100 l cada uno en dos placas de 96 pocillos de fondo plano de separadas. Mantenga una placa para permitir clones crezcan y utilizan la otra placa para detectar cada clon de eliminaciones. Añadir un adicional de 100 l a cada pocillo para un volumen total de 200 l. Espere 24 a 72 horas para permitir que las células crezcan. Aspirar los medios de comunicación. Añadir 50 solución de extracción de ADN l por pocillo, resuspender y transferencia a placas de 96 pocillos PCR. Continúe con el paso 7.3. Extraiga el gDNA de clones. Ejecute muestra en termociclador: 65 ° C durante 6 minutos y 98 ° C durante 2 min para extraer gDNA. Pantalla de cada clon usando los mismos cebadores de PCR y condiciones de reacción optimizadas en las células a granel (consulte el paso 6). Seleccione la iden clonestificados con la supresión deseada y pasar al plato más grande o frasco para el crecimiento. 8. Validación de bialélicos de deleción Clones Con el fin de caracterizar clones obtenidos y validar un knockout éxito, evaluar clones en el ADN, así como los niveles de ARN y / o proteína. Para evaluar el ADN, amplificar bandas de deleción de clones de deleción bialélicos con una corrección de la polimerasa y clonar los amplicones (por ejemplo, con un kit de clonación PCR) en un vector plasmídico. Transformar el plásmido en E. DH5a coli células y placa sobre placas de agar LB con el antibiótico correspondiente. Seleccione varias colonias, mini-prep cada uno, y someter cada clon de secuenciación de Sanger para caracterizar cada eliminación alelo 28-30. La repetición de la prueba de PCR para su eliminación después de la pantalla inicial asegura que fue seleccionado y reproducibilidad de los resultados del clon correcto. Para evaluar el ARN, realizar RT-qPCR para generacióne la expresión del gen relevante 30,31. Para evaluar la proteína, lleve a cabo una inmunotransferencia usando un anticuerpo contra la proteína relevante 33.

Representative Results

El objetivo de este experimento fue la supresión del Pim1 en células MEL. El uso de múltiples pares que no se solapan sgRNA (es decir, secuencias protospacer independientes) puede ayudar a controlar los efectos fuera de la meta (Figura 1). Un fenotipo coherente sería más probable que el resultado de un efecto en el blanco en oposición a un efecto fuera del objetivo común compartido por múltiples secuencias protospacer independientes. Cada par daría lugar a la producción de una supresión de corte único. Si juntos (es decir, n menos de ~ 150 pb), los mismos cebadores de detección podrían utilizarse para detectar deleciones producidas por cada conjunto de sgRNAs. Deleciones genómicas pueden alterar genes mediante el uso de pares sgRNA en diversos lugares con respecto al gen (Figura 1B). Por ejemplo, el par sgRNA puede flanquear un gen para la supresión de todo el cuerpo de genes; el par podría estar situado dentro de dos exones, con el potencial de crear indeles marco de lectura, incluso si uno o ambos alleles que no se han suprimido; o el par puede flanquear un exón específico para permitir la interrupción de una isoforma particular. La estrategia de eliminación utilizado para Pim1 era diseñar flanqueando sgRNAs para eliminar todo el cuerpo gen, una deleción 8 kb (Figura 2). Esta estrategia fue elegido en parte debido a la relativamente pequeño tamaño del gen Pim1. Este ejemplo muestra una PAM (verde) en la parte superior (Watson) capítulo y uno PAM en la (Crick) cadena inferior; Sin embargo, DSB es independiente de la secuencia de localización PAM a la cadena superior o inferior. pares sgRNA pueden tener ambas secuencias de PAM en la cadena superior, tanto en la cadena inferior, o uno de cada uno. Utilizando el protocolo descrito anteriormente, dos sgRNA fueron diseñados, se clonaron en el vector de expresión pX330, y entregados a células MEL por electroporación, junto con un reportero GFP (Figura 2A). El 3% más alto de células GFP + se clasificaron dos días de él electroporación y chapada por clonación a dilución limitante. Pantallaing cebadores se diseñaron tal como se describe en el paso 2 y como se muestra en la Figura 2. Las condiciones de PCR se optimizaron utilizando gDNA aisladas a partir de células MEL parentales y de células clasificadas "a granel". 10 días después de la siembra, gDNA quedara aislado de los clones y se tamiza para su eliminación a través de PCR, que demuestre la no supresión, monoallelic y clones de deleción bialélicos de acuerdo con los patrones de la no eliminación (ND) y eliminación (D) los amplificados (Figura 3) . Clones de deleción no fueron identificados como contar con la presencia del amplicón no eliminación y la ausencia del amplicón eliminación. Monoallelic clones fueron identificados como teniendo la presencia tanto de la no eliminación y amplicones de deleción. Bialélicos clones fueron identificados como teniendo la ausencia del amplicón no eliminación y la presencia del amplicón eliminación. Por esta eliminación, se seleccionaron 400 clones que se identificaron 126 clones de deleción monoallelic y 32 delet bialélico clones de iones (es importante tener en cuenta que la frecuencia de eliminación varía con el tamaño deleción 12). Se seleccionaron clones de deleción bialélicos y se trasladaron a frascos con 8 ml de medios de comunicación. Después de 5 días para permitir la expansión, cada clon se repitió la prueba por PCR de gDNA para confirmar la eliminación y borrado amplicones bialélicos se sometieron a secuenciación de Sanger para identificar la deleción precisa (Figura 2B). La heterogeneidad dentro de los amplicones de deleción refleja indel de formación imperfecta NHEJ reparación. La secuenciación del alelo no deleción en clones de deleción monoallelelic descubiertas indeles en la mayoría de los casos, lo que demuestra que incluso el alelo no eliminado se frecuencia editado por CRISPR / Cas9, que puede ser importante para aplicaciones donde se requieren ambos clones de deleción monoallelic y bialélicos . Se aisló el ARN a partir de clones de deleción bialélicos y se analizó por RT-qPCR para confirmar la pérdida de expresión Pim1 (Figura 4). formas "> Figura 1. Esquema de las posibles estrategias de eliminación. (A) Dos ejemplos de pares sgRNA para deleciones genómicas (mostrado en negro y naranja, respectivamente). Las flechas azules indican cebadores para detectar la amplificación no eliminación y flechas rojas indican cebadores para detectar la amplificación de la eliminación. sgRNA posiciones 17 y 18 se destacan en rojo y azul en sgRNA-Sites-A1 / 2 y se resaltan en color púrpura y naranja en sgRNA-Sites-B 1 / B 2 con una línea roja que indica la disociación Cas9 predicha entre las posiciones 17 y 18. (B) clivajes CRISPR dirigida se muestran como líneas negras verticales. Las flechas azules indican cebadores para detectar la amplificación no eliminación y flechas rojas indican cebadores para detectar la amplificación de la eliminación. Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura. Figura 2. Estrategia para producir y detectar la supresión de Pim1, incluido el borrado secuenciación y alelos no de deleción. (A) Esquema de la estrategia de cribado basado en PCR para identificar clones de deleción Pim1. Un par de cebadores se encuentra interno en la eliminación (flechas azules) y un par de cebadores se localiza externo a la eliminación (flechas rojas). secuencias sgRNA (secuencias protospacer) se muestran en púrpura. Las líneas rojas verticales indican la disociación Cas9 predicho entre las posiciones 17 y 18 de la secuencia de sgRNA. (B) secuenciación de Sanger revela la formación de indel en el sitio de reconocimiento de sgRNA. secuencias sgRNA se muestran en secuencias de púrpura y PAM en verde. Supresión eventos son shpropia por un número equivalente de marcas de guión y las inserciones se resaltan en azul. Líneas rojas verticales indican predijeron sitio de corte, entre las posiciones 17 y 18 de la sgRNA. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Gel Representante identificación no eliminación, monoallelic y clones bialélicos. Para cada clon, el carril de la izquierda representa la amplificación no deleción ("ND" en azul) y el carril de la derecha representa la amplificación de deleción ("D" en rojo ). Clones individuales están separadas por líneas de puntos. Los tres clones de deleción monoallelic son clones 5, 6, y 2. Los tres clones de deleción bialélicos son clones 15, 17, y 13. Como se ve en los datos de secuenciación, la banda de eliminación para c solitario 13 tiene un tamaño más pequeño debido a deleciones grandes en la unión de la deleción. Se calculó la Figura 4. La pérdida de expresión Pim1 en clones de deleción bialélicos. Expresión Pim1 por dos clones de deleción bialélicas por RT-qPCR. Los datos se normalizó a GAPDH utilizando el 2 – método? Ct. Protospacer Secuencia sgRNA-A 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-B 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' Tabla 1. Secuencias protospacer 20 unidades para dos sgRNA la supresión de Pim1. 543 "> Complemento inverso de la secuencia Protospacer sgRNA-A-rc 5'-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Tabla 2. complemento inverso de las secuencias protospacer para los dos sgRNA de la Tabla 1. Secuencias sgRNA-A 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-A-rc 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Tabla 3. secuencias Protospacer y su inverso complementa con "CACC" y "AAAC" añadidos para la clonación en el vector pX330 usando la enzima de restricción BbsI. Secuencias sgRNA-A 5'CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-A-rc 5'AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 ' sgRNA-B 5'CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' sgRNA-B-rc 5'AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Tabla 4. sgRNA la expresión del promotor U6 del vector pX330 se ve reforzada por la adición de un nucleótido G después de la secuencia CACC y antes de la20-mer. La adición de un nucleótido G adicional requiere la adición de un nucleótido C en el extremo 3 'del oligo complemento inverso (por ejemplo, sgRNA-A). Sin embargo, si la primera posición de la (secuencia protospacer) 20-mer ya es un nucleótido G, no hay necesidad de añadir otro G (por ejemplo, sgRNA-B) y no hay necesidad de añadir C a la posición final de la complemento inverso oligo.

Discussion

El sistema de CRISPR / Cas9 se puede utilizar para generar deleciones genómicas de una gama de tamaños. Aunque hemos observado que la frecuencia de eliminación varía inversamente con respecto al tamaño de la deleción prevista, hemos sido capaces de recuperar deleciones de hasta 1 Mb, y deleciones de hasta 100 kb dió rutinariamente múltiples clones bialélicos eliminado. Hemos observado ninguna pérdida en la eficiencia de deleciones secuencialmente introducir en una línea celular. Esta estrategia se puede utilizar para la creación de eliminación combinatoria de numerosos genes y elementos. El proceso de obtención de clones de deleción bialélicos se puede acelerar mediante la estimación del número mínimo de clones necesarios para someterse a las pruebas basadas en el tamaño de eliminación para obtener el número deseado de clones con la supresión bialélico 12.

La capacidad de obtener deleción monoallelic con la ausencia de deleción bialélico en la distribución probabilística podría indicar la letalidad celular asociada con la pérdida completa de la función. Bajo frecuencia o supresiones ausentes podrían reflejar una serie de escenarios incluyendo pobres transfección, sgRNAs ineficaces o ineficientes cebadores de PCR de cribado (debido a la falta de un control positivo para validar cebadores de PCR para la detección de supresión). Células GFP + se pueden utilizar como un sustituto para la eficacia de transfección (véase el paso 5.2), por lo que una reducción de las células GFP + refleja probablemente pobres de la transfección y una resultante disminuyó la eficiencia de eliminación. El uso de dos pares sgRNA diferentes con cebadores de detección independientes pueden ayudar a controlar sgRNA ineficiente y cribado PCR y maximizar las posibilidades de obtener clones de deleción bialélicos. Clasificación de células de células GFP + enriquece para supresión alelos. Mientras que este paso se puede omitir, omisión es probable que hace necesario el cribado de más clones para identificar aquellos con deleciones monoallelic o bialélicos. En la medida en que la eficacia de transfección se puede optimizar, esperaríamos que la eficiencia de edición genoma para ser mejorada.

<p class = "jove_content"> Los eventos NHEJ que subyacen deleciones y resultado de reparación local en una serie de alelos con una variedad de indeles en los sitios diana. El resultado es predominante pequeñas ~ 1 – 10 inserciones pb o más comúnmente deleciones en el sitio de escisión sgRNA dirigida (Figura 2B). A menudo, estos alelos parecen ser el resultado de la reparación a base de microhomology 34,35. Cabe señalar que la estrategia de detección basada en PCR se describe no identificará inserciones más grandes o más complicadas, deleciones, inversiones, o reordenamientos. Aunque estos eventos son menos comunes, hemos observado clones en el que ni la supresión ni amplicones no deleción se pudieron detectar, y tras una investigación reflejar estos resultados más complejos.

Hemos observado extensa CRISPR / Cas9 mediada "cicatrización" de alelos no deleción de monoallelic y no de deleción clones (véase la figura 2B). Estos "cicatrices" consisten enpequeños indeles producidos en el sitio de escisión sgRNA sin la eliminación previsto (es decir, deleción del segmento intermedio entre sgRNAs A y B). Estas cicatrices a menudo cortan el reconocimiento del objetivo por el sgRNA. Por lo tanto instamos precaución en la reorientación de alelos en células previamente expuestas a sgRNAs utilizando los mismos sgRNAs. Una estrategia de reorientación más éxito utilizaría sgRNA única secuencias distintas de sitios de reconocimiento previamente "marcada". En los casos cuando un par de sgRNAs reconoce secuencias exónicas (Figura 1B, parte inferior), los alelos del marco de lectura se puede producir incluso en ausencia de la deleción. Por lo tanto, los clones de deleción monoallelic pueden ser enriquecidas por la pérdida de función debido a la alta frecuencia de mutaciones de cambio en la no-borrado alelo 12.

Una de las preocupaciones con el sistema CRISPR / Cas9 es fuera de objetivo efectos, es decir, la modificación genómica en sitios no deseados 36-38. Rinformes ecientes han sugerido que guía RNAs cortos con 17-19 nucleótidos pueden reducir la frecuencia de CRISPR / Cas9 basado efectos fuera de la meta 39. Además, una estrategia de doble nicking usando dos guías por sitio objetivo con una nickase se puede utilizar para crear DSBs minimizando al mismo tiempo fuera de objetivo efectos 7. Alternativamente, análoga a las estrategias utilizadas para la RNAi, se sugiere que diferentes pares de sgRNAs con la no superposición de secuencias protospacer pueden usar para demostrar que el fenotipo observado es el resultado de la CRISPR / Cas9 modificación en-blanco en oposición a una potencial desviado efecto. Un enfoque conveniente sería diseñar al menos dos pares sgRNA adyacentes, pero que no se solapan de manera que un único conjunto de cebadores de cribado (véase el paso 2) puede ser utilizado para múltiples pares sgRNA (Figura 1A). Además, como complemento de una línea celular de eliminación mediante la reintroducción de la secuencia que falta y / o gen alterado puede fundamentar una relación causal entreuna deleción genómica dada y fenotipo.

Para los biólogos que trabajan con sistemas de modelos celulares, RNAi ha representado una herramienta poderosa para la genómica funcional. Sin embargo, las limitaciones de este enfoque han incluido la reducción incompleta en los niveles de transcripción de ARNm diana, la heterogeneidad del efecto de reactivos independientes dirigidas a un mismo gen, y los efectos conocidos fuera de objetivo, incluyendo los efectos basados ​​en semillas y no de semillas 40-42. Estrategias de edición Genoma prometen abordar muchas de estas preocupaciones y representan un enfoque interesante, complementario de perturbación genética prospectivo 8,36,37. Además, la edición del genoma permite el estudio de la no codificante elementos genéticos de una manera no es posible por RNAi y desafiante por orientación convencional se acerca 25. Animamos a la generación de deleciones genómicas por CRISPR / Cas9 como un método robusto y específico para producir y caracterizar los alelos de pérdida de función.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201S
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) New England Biolabs M0202T
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
BSA, Molecular Biology Grade New England Biolabs B9000S
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) New England Biolabs R0539S
pSpCas9(BB) (pX330) Addgene 42230
S.O.C. Medium Life Technologies 15544-034
BTX ECM 830 Harvard Apparatus 45-0052
BTX Solution and 2mm Cuvettes Harvard Apparatus 45-0803
pmaxGFP Plasmid Lonza VPA-1003
QuickExtract DNA Extraction Solution Epicentre QE09050
HotStarTaq PCR Master Mix Kit Qiagen 203443
Zero Blunt PCR Cloning Kit Life Technologies K2700-20
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Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118, doi:10.3791/52118 (2015).
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