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Geração de Genomic Eliminações em linhas celulares de mamíferos através CRISPR / Cas9

Published: January 03, 2015
doi:
10.3791/52118
, ,
1Harvard Medical School, 2Division of Hematology/Oncology,Boston Children’s Hospital, 3Department of Pediatric Oncology,Dana-Farber Cancer Institute, 4Howard Hughes Medical Institute

Summary

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Abstract

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

Introduction

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.

The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.

Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.

Protocol

1. Projeto CRISPR Projeto sgRNAs manualmente ou através de ferramentas on-line disponíveis gratuitamente 7. Use essas ferramentas para ajudar a identificar as sequências de guia que minimizem partidas genômicas idênticas ou quase partidas para reduzir o risco de clivagem longe de sites de destino (efeitos fora do alvo). Certifique-se de que as sequências de guia consistem de um 20-mer ("sequência protospacer") a montante de um "NGG" sequência ("protospacer motivo adjacente" ou PAM), no sítio de reconhecimento genómico. NOTA: A Figura 1 descreve as possíveis estratégias de exclusão para genes e elementos não-codificantes. Para a criação de um nocaute gene, duas sgRNA localizados dentro exons irá enriquecer clones de deleção mesmo monoalélicos para perda de função. Isto é devido à alta freqüência de indels formados em alelos que não são apagados 12, que são susceptíveis de causar mutações que levam ao quadro de leitura mediada por nonsense decadência do mRNA (Figura 1B). Use aexemplo orienta para a supressão pretendida do Pim1 no rato (Mus musculus; Tabela 1, Figura 2A). NOTA: Neste exemplo, de sgRNA-A seqüência protospacer e PAM acontecer cair na cadeia de baixo (Crick), enquanto seqüência protospacer de sgRNA-B e PAM cair no topo (Watson) cadeia (Figura 2A). No entanto, a DSB ocorrerá independentemente da orientação da sequência protospacer / PAM em relação à cadeia de topo ou de fundo. Determine o complemento reverso (rc) de cada seqüência de guia. Exemplo sequências do complemento reverso do Pim1 sgRNA a partir da Tabela 1 encontram-se na Tabela 2. Obter 24 ou 25-mer oligos para cada guia e seu complemento inverso associado incluindo nucleotídeos adicionais para fins de clonagem e expressão. NOTA: Aqui vamos discutir o uso do pSpCas9 (BB) plasmídeo (pX330) (Addgene plasmídeo ID 42230). Este plasmídeo permite a simultâneaexpressão de sgRNA e SpCas9, mas não contém marcadores para seleção 7. Outras construções podem ser utilizadas, tais como pX458 (Addgene plasmídeo ID 48138) ou pX459 (Addgene plasmídeo ID 48139), que incluem GFP e puromicina como marcadores seleccionáveis, respectivamente, ou construções, nas quais múltiplos sgRNAs podem ser expressas a partir de um único plasmídeo. Adicionar "CACC" antes da sequência guia de 20-mer e "AAAC" antes complemento inverso da guia para clonagem no vector utilizando enzimas de restrição pX330 Bbsl (Tabela 3). Adicionar um nucleótido G após a sequência CACC e antes do 20-mer se a primeira posição do 20-mer é não G. sgRNA expressão a partir do promotor U6 do vector pX330 é aumentada pela inclusão de um nucleótido G após a sequência CACC . Adicionar um C na extremidade do oligo complemento inverso 3 '(por exemplo, sgRNA-A na Tabela 4). Os oligos resultantes seriam os oligos 25-mer. Comocada vez, se a primeira posição do 20-mer (sequência protospacer) é G, não se adicionar outro G (por exemplo, sgRNA-B na Tabela 4) e não acrescentam C para a posição final do oligo complemento inverso. Neste caso, os oligonucleótidos resultantes seriam os oligos 24-mer (Tabela 4). 2. Projeto de Exclusão Primers de Triagem Projeto um conjunto de primers internos para a sequência a ser excluído ("não-eliminação band") e outro conjunto de primers a montante ea jusante dos locais sgRNA de clivagem ("supressão da banda"; Figuras 1-2). Na ausência de uma eliminação, a "eliminação da banda" é muitas vezes demasiado grandes para amplificar eficientemente. Normalmente, utilizam primers pelo menos 100 pb a partir do local de clivagem previsto para garantir a detecção não seria impactado por uma pequena indel no site de destino do sgRNA. Projete primers adicionais para analisar de cicatrizes (pequenas indels produzidos na sgRNA cleavage local sem a exclusão intencional). Use um par de primers para a frente e de acompanhamento de cada site de destino sgRNA (dentro de 150-350 bp) reverter para amplificar o site de destino sgRNA para examinar para cicatrizes. Isto pode ser útil para caracterizar os alelo não suprimido em clones de deleção monoalélicos. Para pequenas deleções (como a "eliminação da banda" ainda pode amplificar), resolver amplicões sobre um gel de agarose para determinar se o tamanho é consistente com a presença ou ausência da eliminação. Para esta abordagem, os iniciadores internos descritos no passo 2.1 pode ser omitido. 3. CRISPR Clonagem Anele e phosphorylate oligos. Oligos Ressuspender a uma concentração de 100 uM em ddH 2 O. Prepare uma mistura de 10 mL de reação para cada guia e seu complemento inverso: 1,0 ul sgRNA de 24 ou 25 oligo-mer (100 M; veja o passo 1.4), 1,0 ul sgRNA de 24 ou 25-mer reverter complementaçãot oligo (100 uM; ver passo 1.4), 1,0 ul de 10x tampão de T4 Ligadura, 6,5 ul ddH2O, e 0,5 jil de quinase de polinucleótidos de T4 (PNK) (10.000 U / ml). NOTA: fosforilada oligos podem ser encomendados em seu lugar. Por esta abordagem, a utilização de T4 PNK é omitido. Hibridar num termociclador utilizando os seguintes parâmetros: 37 ° C durante 30 min; 95 ° C durante 5 min e, em seguida, rampa até 25 ° C a 5 ° C / min. Diluir 1:10 em oligos ddH2O (por exemplo, 1,0 ul recozido oligos + 9,0 ul ddH2O para obter uma concentração de 1 | iM). Oligos recozidos ligar para pX330 usando uma estratégia de clonagem montagem Golden Gate 26. Prepara-se uma mistura reaccional de 50 ul: 100 ng de vector circular pX330, 1,0 ul oligos hibridados (1 uM; ver passo 3.1.4), tampão de enzima de restrição de 5,0? L (10x), 4,0 mL (20 L) da enzima de restrição Bbsl (5,000 L / ml), 5,0 μl de ATP (10 mM), 0,25 ul (5 ug) de BSA (20 mg / ml), 0,375 ul (750 U) de ligase de ADN de T4 (2.000.000 U / ml), e H 2 O para um volume final de 50 ul. Esta reacção pode ser reduzida para um volume final menor, se necessário. Amostras em um termociclador utilizando os seguintes parâmetros: Ciclos 1-20 (37 ° C durante 5 min, 20 ° C por 5 min); Ciclo 21 (80 ° C durante 20 min). Estas condições de ciclismo permitir que para a digestão e ligação de ocorrer em uma reacção (ver passo 3.2). Transformar 10 ul de DH5a de E. células de E. coli com 1 ul de reacção (a partir de 3.2.1 – 3.2.2). Placa para um caldo de lisogenia (LB) placa de agar com 100 ug / ml de ampicilina e incubar O / N a 37 ° C. Escolha 2-3 colônias e inocular em uma cultura mini-prep. Executar mini-prep para cada amostra e sequenciar cada colônia usando um U6 promotor primer forward: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Este ar éiniciador de sequenciação epresentative; Podem ser utilizados outros iniciadores de f lanqueamento. Escolha uma colônia verificou-sequência e inocular em uma cultura maxi-prep. Prep tamanho pode ser dimensionado com base no rendimento de DNA necessária. Execute maxi-prep para cada CRISPR / Cas9 construto. 4. CRISPR transfecção em células de interesse NOTA: Este protocolo envolve a entrega de CRISPR plasmídeos / Cas9 por eletroporação 27. Este protocolo é descrito em detalhe por células de eritroleucemia murina (MEL), uma linha de células em suspensão. O meio de cultura consiste em todas as etapas de DMEM suplementado com 2% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina, que é usado para células MEL. No entanto, a transfecção transiente de CRISPR / Cas9 plasmídeos podem ser adaptadas com sucesso para vários tipos de células usando as condições de cultura preferidas e estratégias de transfecção para cada tipo de célula. Enquanto as células são células MEL suspensão, instruções para células aderentes hav também foram incluídos. Certifique-se de há 2 x 10 6 células por par CRISPR. Ressuspender 2 x 10 6 células em 100 ul de solução de electroporação e adicionar à cuvete de electroporação. Adicionam-se 5 ug de cada CRISPR / Cas9 construção (10 mg no total). Adicionar 0,5 ug de construção de expressão da GFP. Células electroporate com 250 volts para 5 ms em uma tina 2 milímetros utilizando um sistema de eletroporação. NOTA: Como alternativa, use outro método de transfecção como catiônica transfecção à base de lipossomas. Optimizar as condições de transfecção para cada linha de células com uma construção repórter para garantir a entrega plasmídeo robusto antes de tentar edição genoma. Transfira imediatamente solução da tina em 1 ml de meio de cultura após a eletroporação. Minimizar o tempo entre a electroporação e a transferência da solução para os meios para melhorar a viabilidade celular. Incubar a 30-37 ° C durante 24-72 horas. 30 ° C podem melhorar genomaedição eficiência, mas a 37 ° C é aceitável. 5. A fluorescência celular Activado Sorting (FACS) de células transfectadas Preparar células para FACS, filtrando-os através de um filtro de 50 um para um tubo de FACS. FACS classificar o topo ~ 3% de células positivas para GFP, a fim de enriquecer em células que receberam níveis elevados de CRISPR / Cas9 constrói. Placa células separadas individualmente em placas de fundo redondo de 96 poços, utilizando classificador ou por diluição limitante, utilizando a 30 células por 96 poços de fundo redondo de placa. Optimizar chapeamento do tipo de célula utilizada a diluição limitante, antes de realizar este passo de forma fiável para obter cerca de 30 células por placa de 96 poços. Incluir 100 ul por poço de meio de cultura celular. Para os restantes células classificadas ("a granel") que não foram banhados, congelar metade das células para a futura chapeamento. Placa a outra metade para a seleção e validação de primer (veja o passo 6). NOTA: Este protocolo é para as células em suspensão. As células aderentes podem crescer como células individuais na placa de 96 poços de fundo plano ou em uma placa de 10 cm em baixa concentração de modo a que os clones derivados de uma única célula individual pode ser colhidos e transferido para um fundo de placa de 96 poços plana. Permitir que as células a granel a incubar a 37 ° C durante 3-7 dias, e permitir que os clones a incubar a 37 ° C durante 7 – 14 dias. Estes tempos variar dependendo do tempo de duplicação da linhagem celular utilizada. NOTA: O tempo de incubação permite a proliferação de células suficientes para o rastreio de ADN genómico (ADNg) para a supressão pretendida por PCR (ver passos 6.1 e 7.1). As células têm a granel suficientemente proliferaram quando a concentração excede ~ 100.000 células / ml ou de células aderentes, as células chegaram a ~ 80% de confluência. Os clones foram suficientemente proliferaram uma vez macroscopicamente visível com ~ 2 mm de diâmetro. 6. Primer Validação e Triagem para CRISPR / Exclusão Cas9-Mediated Isolar gDNA de células classificadas parentais ea granel por ressuspensão pelotas de células progenitoras e granel, em 50 ml de solução de extração de DNA. NOTA: Geralmente ~ 100000 células são utilizadas para a extracção do ADN, embora uma grande variedade de números de células é aceitável. As células são classificadas em massa composta de uma população policlonal expostos a sgRNA-A e sgRNA-B (ver passo 5). O objectivo da seguinte PCR é validar iniciadores e verificar a presença de deleção genómica pretendido. Execute amostra em termociclador e executar o seguinte programa: 65 ° C durante 6 min, 98 ° C por 2 min para extrair gDNA. Medir a concentração de ADN. NOTA: Enquanto os passos 6.1 e 6.2 recomendar um método eficiente para a extracção do ADN, qualquer método para o isolamento de DNA genómico pode ser utilizado para ser capaz de realizar PCR no passo 6.3. Montar um 20 ul de PCR com os seguintes componentes: 10 ul de mistura de PCR, 2x 0,5 ul iniciador directo (10 _6; M), 0,5 ul de iniciador reverso (10 pM), 50-100 ng de gDNA, e H2O até 20 mL. Use os primers desenhados no passo 2 acima. Realizar PCR para "não-eliminação band" e "eliminação band" em reações distintas. NOTA: Numerosos polimerases podem ser utilizados no passo 6.3. As amostras são executados em um termociclador utilizando os seguintes parâmetros: 95 ° C durante 15 min, 35 ciclos de (95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min), e 72 ° C durante 10 min . Otimizar as condições de PCR para cada par de primers desenhados com base em testes as células granel ordenados. Processar as amostras em gel de agarose a 2% a 10 V / cm, usando 1x Tris-acetato-EDTA-tampão (TAE). Examinar amostras para detectar a presença / ausência de não-supressão e bandas de deleção (Figura 2). Considere multiplexing o "apagamento" e "não-eliminação" pares de primers de PCR em uma única reação. Otimizar multiplexingem uma população policlonal (isto é, grandes quantidades classificado células) antes do rastreio de clones individuais. É fundamental que a exclusão e não de exclusão amplicons ser facilmente resolvida com um gel de agarose para a multiplexação. 7. Screening CRISPR / Cas9 Clones para supressões e Clone Seleção No caso de células em suspensão, para transferir todos os clones de uma única placa de 96 poços que já contém 50 ul meios de cultura de células por poço, para um volume final de 150 ul. Isto facilita o rastreio, permitindo uma pipeta de canais múltiplos para ser usado para o restante das etapas no passo 7. Transferir 50 uL de cada poço (100 ul deixando em cada poço) para uma placa de 96 poços de PCR utilizando uma pipeta multicanal. Centrífuga placa de PCR em 400 g durante 5 minutos e remover o sobrenadante sacudindo a placa PCR sobre uma pia. Adicionar 50 ml de solução de extração de DNA por poço e ressuspender. Continue até a etapa 7.3 para células em suspensão. </li> Para as células aderentes, mídia aspirado. Adicionar 20 ul de 0,05% de tripsina-EDTA a cada poço com um clone presente. Ressuspender as células em 200 ul de meio. Pipeta misturar para separar células. Placa de 100 ul cada um em duas placas de 96 poços de fundo plano separadas. Manter uma placa para permitir a crescer clones e utilizar a outra placa para cada clone para pesquisar deleções. Adicionar um adicional de 100 ul a cada poço para um volume total de 200 ul. Espera 24-72 h, para permitir que as células cresçam. Media aspirar. Adicionar 50 ul solução de extracção de ADN por poço, e ressuspender transferência para placa de 96 poços de PCR. Continue até a etapa 7.3. Extrai-se a partir de clones de ADNg. Executar amostra em termociclador: 65 ° C durante 6 minutos e 98 ° C durante 2 minutos para extrair ADNg. Tela de cada clone utilizando os iniciadores de PCR e as condições de reacção optimizadas nas células granel mesma (ver passo 6). Selecione a iden clonescadas com a eliminação desejado e passar para maior placa ou frasco para o crescimento. 8. Validação de Bialélicos Exclusão Clones A fim de caracterizar clones obtidos e validar um nocaute bem sucedido, avaliar clones no DNA, bem como os níveis de RNA e / ou proteína. Para avaliar o ADN, amplificam bandas supressão dos clones de deleção bialélicos com uma polimerase prova de leitura e clonar os produtos de amplificação (por exemplo, com um kit de clonagem de PCR) num vector de plasmídeo. Transformar o plasmídeo em DH5a de E. coli e células placa sobre placas de LB-agar com o antibiótico correspondente. Selecione várias colônias, mini-prep cada um, e submeter cada clone de sequenciamento Sanger para caracterizar cada eliminação alelo 28-30. A repetição do teste de PCR para a eliminação após a tela inicial garante que o clone correcto foi seleccionado e reprodutibilidade dos resultados. Para avaliar o RNA, RT-qPCR realizar para gene a expressão do gene relevante 30,31. Para avaliar a proteína, efectuar uma imunotransf erência usando um anticorpo contra a proteína relevante 33.

Representative Results

O objetivo deste experimento foi a supressão do Pim1 em células MEL. A utilização de pares múltiplos sgRNA não sobreponíveis (ou seja, sequências protospacer independentes) pode ajudar a controlar os efeitos fora do alvo (Figura 1A). Um fenótipo consistente seria mais provável de resultar de um efeito sobre o alvo, em oposição a um efeito fora do alvo comum partilhada por múltiplas sequências protospacer independentes. Cada par levaria a produção de um breakpoint eliminação única. Se perto em conjunto (isto é, n inferior a ~ 150 pb), os mesmos iniciadores de rastreio pode ser utilizado para detectar deleções produzidas por cada conjunto de sgRNAs. Deleções genómicas podem perturbar genes por meio de pares sgRNA em várias posições em relação ao gene (Figura 1B). Por exemplo, o par pode sgRNA flanqueiam um gene para a eliminação do gene corpo inteiro; o par pode estar localizado dentro de dois exões, com o potencial para criar indels frameshift mesmo se uma ou ambas aleloes não foram excluídos; ou podem flanquear o par de um exão específico para permitir a interrupção de uma isoforma particular. A estratégia utilizada para Pim1 deleção era conceber flanqueando sgRNAs para excluir o corpo inteiro do gene, uma deleção de 8 kb (Figura 2). Esta estratégia foi escolhido, em parte devido ao tamanho relativamente pequeno do gene Pim1. Este exemplo mostra um PAM (verde) na parte superior (Watson) e uma vertente PAM no fundo (Crick) vertente; no entanto, a DSB é independente da sequência de PAM de localização para a cadeia superior ou inferior. pares sgRNA pode ter ambas as sequências PAM na cadeia de cima, tanto na cadeia inferior, ou um de cada. Usando o protocolo acima descrito, foram concebidos dois sgRNA, clonado no vector de expressão pX330, e entregue a células MEL por electroporação, juntamente com um repórter GFP (Figura 2A). O top 3% das células GFP + foram ordenados dois dias pós-eletroporação e banhado por clonagem a diluição limitante. Telaing iniciadores foram concebidos como descrito no passo 2 e, como mostrado na Figura 2. As condições de PCR foram optimizados usando ADNg isoladas a partir de células de ELM parentais e de "a granel" células separadas. 10 dias após o plaqueamento, ADNg foi isolado a partir de todos os clones e rastreados para eliminação através de PCR, que não identificaram-supressão, monoalélicos e clones de deleção bialélicos de acordo com os padrões de não-supressão (ND) e deleção (D) produtos de amplificação (Figura 3) . Os clones de deleção não foram identificados como tendo a presença do produto de amplificação não-eliminação e a ausência de produto de amplificação eliminação. Monoalélicos clones foram identificados como tendo a presença de ambos, o apagamento e não amplicões de deleção. Bialélicos clones foram identificados como tendo a ausência de produto de amplificação não-supressão e a presença do fragmento amplificado eliminação. Por esta eliminação, 400 clones foram selecionados, que identificou 126 clones de deleção monoalélicos e 32 delet bial�ico Os clones de iões (isto é importante notar que a frequência varia com a deleção deleção tamanho 12). Clones de deleção Bialélicos foram selecionados e mudou-se para frascos com 8 ml de mídia. Depois de 5 dias para permitir a expansão, cada um dos clones foi re-testada por PCR de ADNg para confirmar bialélicos de deleção e de deleção amplicões foram submetidos a sequenciação de Sanger para identificar a exacta eliminação (Figura 2B). A heterogeneidade dentro dos amplicons supressão reflete imperfeito formação de indel NHEJ reparo. A sequenciação do alelo não-supressão em clones de deleção monoallelelic indels descoberto na maior parte dos casos, demonstrando que o mesmo alelo não é frequentemente suprimida editado por CRISPR / Cas9, o que pode ser importante para aplicações em que são necessários ambos os clones de deleção monoalélicos e bialélicos . O ARN foi isolado a partir dos clones de deleção bialélicos e analisado por RT-qPCR para confirmar a perda da expressão Pim1 (Figura 4). maneiras "> Figura 1. Esquema de possíveis estratégias de eliminação. (A) Dois exemplos de pares sgRNA para deleções genômicas (mostradas em preto e laranja, respectivamente). As setas azuis indicam primers para detectar o amplicon não-exclusão e setas vermelhas indicam primers para detectar o amplicon eliminação. sgRNA posições 17 e 18 são destacadas em vermelho e azul na sgRNA-Sites-A 1 / A 2 e são destacadas em roxo e laranja no-sgRNA-Sites B 1 / B 2 com uma linha vermelha que indica a clivagem Cas9 previsto entre as posições 17 e 18. (B) clivagens dirigida-CRISPR são mostrados como linhas pretas verticais. As setas azuis indicam primers para detectar o amplicon não-exclusão e setas vermelhas indicam primers para detectar o amplicon eliminação. Por favor, clique aqui para veruma versão maior desta figura. Figura 2. Estratégia para produzir e detectar deleção de Pim1, inclusive exclusão sequenciamento e alelos não-eliminação. (A) esquemático da estratégia de rastreamento baseado em PCR para identificar clones de deleção Pim1. Um par de iniciadores situa-se à deleção interna (setas azuis) e um par de iniciadores está localizada externo para a supressão (setas vermelhas). sequências sgRNA (sequências protospacer) são mostrados em roxo. As linhas vermelhas verticais indicam a clivagem Cas9 previsto entre as posições 17 e 18 da sequência sgRNA. (B) sequenciamento Sanger revela formação indel no local do reconhecimento sgRNA. sequências sgRNA são mostrados em sequências roxas e PAM em verde. Eventos de deleção são shpróprio por um número equivalente de marcas de traço e inserções são destacadas em azul. Linhas vermelhas verticais indicam previu local de clivagem, entre as posições 17 e 18 do sgRNA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. Gel Representante identificação não exclusão, monoalélicos, e clones bial�icos. Para cada clone, a faixa da esquerda representa o amplicon não-exclusão ("ND" em azul) e na faixa da direita representa o amplicon eliminação ("D" no vermelho ). Os clones individuais que são separadas por linhas tracejadas. Os três clones de deleção monoalélicos são clones 5, 6 e 2. Os três clones de deleção bial�icos são clones 15, 17 e 13. Como visto nos dados de sequenciamento, a banda de eliminação para c solitário 13 tem um tamanho menor, devido a delecções maiores da junção da deleção. Figura 4. A perda da expressão em clones de deleção Pim1 bialélicos. Pim1 expressão foi calculada para dois clones de deleção bialélicos por RT-qPCR. Os dados foram normalizados para GAPDH utilizando o 2 – Método ΔCt. Protospacer Sequence sgRNA-A 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-B 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' Tabela 1. sequências protospacer 20-mer para dois sgRNA a supressão do Pim1. 543 "> Complemento reverso de Protospacer Sequence sgRNA-A-rc 5'-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Tabela 2. complemento reverso das sequências protospacer para os dois sgRNA a partir da Tabela 1. Sequências sgRNA-A 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-A-rc 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Tabela 3. sequências Protospacer e os seus complementos reversa com "CACC" e "AAAC" adicionado para clonagem no vector utilizando enzimas de restrição pX330 Bbsl. Sequências sgRNA-A CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT 5'-3 ' sgRNA-A-rc AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC 5'-3 ' sgRNA-B CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA 5'-3 ' sgRNA-B-rc AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC 5'-3 ' Tabela 4. sgRNA expressão a partir do promotor U6 do vector pX330 é aumentada pela adição de um nucleótido G após a sequência CACC e antes da20-mer. A adição de um nucleótido G adicional requer a adição de um nucleótido C na extremidade 3 'do oligo complemento reverso (por exemplo, sgRNA-A). No entanto, se a primeira posição do 20-mer (sequência protospacer) já é um nucleótido G, não há necessidade de adicionar outro G (por exemplo, sgRNA-B) e não há necessidade de adicionar C para a posição final do complemento reverso oligo.

Discussion

O sistema CRISPR / Cas9 pode ser utilizada para gerar deleções genómicas de uma gama de tamanhos. Embora tenhamos observado que a freqüência de eliminação varia inversamente com respeito ao tamanho supressão pretendida, temos sido capazes de recuperar as supressões de até 1 Mb e exclusões de até 100 kb rotineiramente produzir vários clones bial�icos excluído. Temos observado nenhuma perda na eficiência de introdução de eliminações sequencialmente numa linha de células. Esta estratégia pode ser usada para a criação de eliminação combinatória de numerosos genes e elementos. O processo de obtenção de clones de deleção bialélicos pode ser acelerada através da estimativa do número mínimo de clones necessário para ser rastreados com base no tamanho de exclusão para obter o número desejado de clones com deleção bialélico 12.

A capacidade de obter supressão monoalélicos com a ausência de supressão bialélico na distribuição probabilística poderia indicar letalidade celular associada com a perda completa de função. Low frequency ou supressões ausentes poderia refletir uma série de cenários, incluindo pobre transfecção, sgRNAs ineficientes ou ineficientes primers de rastreio de PCR (devido à falta de um controle positivo para validar iniciadores de PCR para triagem de supressão). GFP + células pode ser utilizado como um substituto para a eficiência da transfecção (ver passo 5.2), de modo que uma redução nas células GFP + provavelmente reflecte pobre transfecção e uma resultante diminuição da eficácia de eliminação. Usando dois pares sgRNA diferentes com primers de triagem independentes podem ajudar a controlar para sgRNA ineficiente e triagem iniciadores de PCR e maximizar as chances de obtenção de clones de deleção bial�icos. Celular de classificação para as células GFP + enriquece para alelos de eliminação. Embora este passo pode ser omitido, omissão, provavelmente, tornem indispensável a triagem mais clones para identificar aqueles com deleções monoalélicos ou bial�icos. Na medida em que a eficiência de transfecção pode ser otimizado, esperaríamos eficiência edição genoma de ser reforçada.

<p class = "jove_content"> Os eventos NHEJ que fundamentam deleções e reparo local em resultado de uma série de alelos com uma variedade de indels nos locais alvo. O resultado é predominante pequenos ~ 1-10 pb inserções ou deleções mais comumente no local de clivagem sgRNA-dirigida (Figura 2B). Muitas vezes, estes alelos parecem ser o resultado de reparação à base de microhomology 34,35. Deve notar-se que a estratégia de detecção com base em PCR que descrevem não identificará inserções maiores ou mais complicados, deleções, inversões, ou rearranjos. Embora esses eventos são menos comuns, temos observado clones em que possam ser detectados nem supressão nem amplicons não-eliminação, e investigações mais refletem esses resultados mais complexos.

Temos observado grande CRISPR / Cas9 mediada "cicatrizes" de alelos não-supressão de monoalélicos e não clones de deleção (ver Figura 2B). Estes "cicatrizes" consistemindels pequenas produzidas no local de clivagem sgRNA sem a supressão pretendida (isto é, eliminação do segmento interveniente entre sgRNAs A e B). Estas cicatrizes frequentemente interromper reconhecimento do alvo pelo sgRNA. Por isso, gostaria de instar precaução em redirecionamento alelos em células previamente expostas a sgRNAs usando os mesmos sgRNAs. A estratégia de redirecionamento mais bem-sucedida utilizaria sgRNA única seqüências diferentes locais de reconhecimento anteriormente "cicatrizes". Nos casos em que um par de sgRNAs reconhece sequências exônicos (Figura 1B, em baixo), do quadro de leitura alelos podem ser produzidos mesmo na ausência de supressão. Portanto, clones de deleção monoalélicos pode ser enriquecido para a perda de função, devido à alta freqüência de mutações de enquadramento sobre a não-excluído alelo 12.

Uma preocupação com o sistema CRISPR / Cas9 é fora do alvo efeitos, ou seja, a modificação genómica em locais não intencionais 36-38. Rrelatórios ecente sugeriram que mais curtos RNAs guia com 17-19 nucleotídeos pode reduzir a freqüência de CRISPR / Cas9 baseado no off-alvo efeitos 39. Além disso, uma estratégia dupla nicking utilizando duas guias por local de destino com uma nickase pode ser usado para criar LAP enquanto minimiza os efeitos fora do alvo 7. Alternativamente, análogos de estratégias utilizadas para RNAi, sugerimos que diferentes pares de sequências com sgRNAs protospacer não sobrepostos ser usado para demonstrar que o fenótipo observado é o resultado da CRISPR / alteração no alvo Cas9 em oposição a um potencial fora do alvo efeito. Uma abordagem seria conveniente para conceber, pelo menos, dois pares sgRNA adjacentes mas que não se sobrepõem de modo a que um único conjunto de iniciadores de rastreio (ver passo 2) pode ser usado para múltiplos pares sgRNA (Figura 1A). Além disso, complementando a linha de células de eliminação, reintroduzindo a sequência de falta e / ou gene interrompido pode fundamentar uma relação causal entreuma determinada deleção genómica e fenótipo.

Para os biólogos que trabalham com sistemas de modelos celulares, RNAi tem representado uma ferramenta poderosa para a genómica funcional. No entanto, as limitações dessa abordagem incluem redução incompleta nos níveis de mRNA-alvo, a heterogeneidade do efeito de reagentes independentes visando o mesmo gene, e apresentou efeitos fora do alvo, incluindo efeitos baseados em sementes e não sementes 40-42. Estratégias de edição Genome prometem resolver muitos desses problemas e representam uma abordagem interessante, complementar para prospectivo perturbação genética 8,36,37. Além disso, a edição do genoma permite o estudo de não codificação elementos genéticos de uma forma não é possível por RNAi e desafio por direccionamento convencional aproxima-se de 25. Nós encorajamos geração de deleções genômicas por CRISPR / Cas9 como um método robusto e específico para produzir e caracterizar os alelos de perda de função.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201S
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) New England Biolabs M0202T
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
BSA, Molecular Biology Grade New England Biolabs B9000S
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) New England Biolabs R0539S
pSpCas9(BB) (pX330) Addgene 42230
S.O.C. Medium Life Technologies 15544-034
BTX ECM 830 Harvard Apparatus 45-0052
BTX Solution and 2mm Cuvettes Harvard Apparatus 45-0803
pmaxGFP Plasmid Lonza VPA-1003
QuickExtract DNA Extraction Solution Epicentre QE09050
HotStarTaq PCR Master Mix Kit Qiagen 203443
Zero Blunt PCR Cloning Kit Life Technologies K2700-20
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Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118, doi:10.3791/52118 (2015).
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