CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

1. CRISPRデザインデザインsgRNAs手動または自由に利用できるオンラインツール7を使用。離れて標的部位（オフターゲット効果）からの切断の危険性を減らすために、同一のゲノム一致またはほぼ一致を最小化するガイド配列を特定するためにこれらのツールを使用してください。ガイド配列は、ゲノムの認識部位での「NGG」配列（「protospacer隣接モチーフ」またはPAM）の上流の20マー（「protospacer配列」）で構成されていることを確認してください。 メモ： 図1は、遺伝子と非コード要素の削除の可能性戦略を説明します。遺伝子ノックアウトを作成するための、エクソン内にある2 sgRNAは機能の損失に対してもアレル欠失クローンを豊かにします。これは、mRNA転写物（ 図1B）のナンセンス媒介崩壊をもたらすフレームシフト変異を引き起こす可能性があり、非削除対立12上に形成されたインデル、高周波によるものである。 使用してください例は、マウスにおけるPIM1の意図削除（; 表1、図2A ハツカネズミ ）のためにガイドします。 注：この例では、sgRNA-Aのprotospacer配列と、PAMはsgRNA-Bのprotospacer配列と、PAMは、トップ（ワトソン）鎖（ 図2A）上に落下しながら、ボトム（クリック）鎖上に落下してしまった。しかし、DSBは、上部または下部の鎖にprotospacerシーケンス/ PAMの向きとは無関係に発生します。 各ガイド配列の逆相補（RC）を決定します。例を表2に発見された表1からPIM1 sgRNAの相補配列を逆転。 クローニングおよび発現の目的のために追加のヌクレオチドを​​含む、各ガイドおよびそれに関連する逆補完のために24または25-merのオリゴを取得します。 注：ここでは、pSpCas9（BB）プラスミド（pX330）（AddgeneプラスミドID 42230）の使用を検討する。このプラスミドは、同時を可能にするsgRNAとSpCas9の発現が、 ​​選択の7用のマーカーが含まれていません。他の構築物は、GFPおよびピューロマイシン選択マーカーとして、それぞれ、または複数sgRNAsは単一のプラスミドから発現することが可能な構築物を含むpX458（AddgeneプラスミドID 48138）またはpX459（AddgeneプラスミドID 48139）として、利用することができる。 のBbsI制限酵素（ 表3）を用いてpX330ベクターへのクローニングのためのガイドの逆相補体の前に20-merのガイド配列と「AAAC「前」CACC」を追加する。 20量体の最初の位置はCACCシーケンス後Gヌクレオチドを​​含めることによって強化されるpX330ベクトルのU6プロモーターからではないG. sgRNA式がある場合にCACCシーケンス後と20-merの前にGヌクレオチドを​​追加します。 。逆相補オリゴ（ 例えば、 表4のsgRNA-A）の3 '末端にCを追加する。結果として得られるオリゴは、25-merのオリゴだろう。 どうやってこれまでに、20マー（protospacer配列）の最初の位置がGであれば、別のG（ 表4の例、sgRNA-B）を追加しないと逆相補オリゴの最終位置にCを追加しないでください。この場合、得られたオリゴは、24-merのオリゴ（ 表4）である。 2.デザイン削除のスクリーニングプライマーデザイン削除される配列に対する内部プライマーの一組（「非削除バンド」）および他の上流のプライマーのセットとsgRNA切断部位の下流（「削除バンド」; 図1 – 2）。欠失が存在しない場合には、「削除バンド」は、しばしば効果的に増幅するには大きすぎる。通常、検出はsgRNAの標的部位での小インデルの影響を受けれないことを確認することが予測切断部位からのプライマー、少なくとも100bpのを使用しています。 瘢痕化のために分析するために、追加のプライマーを設計（sgRNA Cで生産小さなインデル意図削除せずにleavageサイト）。前方のペアを使用し、（150内 – 350 bp）の各sgRNA標的部位に隣接するプライマーをリバース瘢痕のため調べるsgRNA標的部位を増幅する。これは、アレル欠失クローン非削除対立遺伝子を特徴づけることが有用であり得る。 小さな欠失のために（「削除バンド「静止増幅することができるように）、サイズは欠失の存在または非存在と一致しているかどうかを決定するために、アガロースゲル上でのアンプリコンを解決する。このアプローチでは、 ステップ2.1に記載された内部プライマーを省略してもよい。 3. CRISPR遺伝子クローニングアニールし、オリゴをリン酸化する。 のddH 2 O中の100μMの濃度で再懸濁オリゴ各ガイドとその逆相補のために10μlの反応ミックスを調製する：1.0μLsgRNA 24または25-merのオリゴ（100μM; 工程1.4を参照）、1.0μLsgRNA 24または25-merのはcomplemenリバースTオリゴ（100μM; 工程1.4を参照）、1.0μlの10倍のT4ライゲーションバッファー、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）（10,000 U / ml）をμlの6.5μlののddH 2 O、および0.5。 注：リン酸化オリゴは、代わりに注文することがあります。このアプローチのために、T4 PNKの使用が省略されている。 以下のパラメータを使用して、サーモサイクラー中でアニーリング：30分間37℃で、 95°Cで5分間、次いで5℃/分で25℃まで下降。 オリゴのddH 2で1:10 O（ 例えば、1.0μlのアニーリングしたオリゴ+ 1μMの濃度を得9.0μLのddH 2 O）を希釈します。 ゴールデンゲートアセンブリクローニング戦略26を使用してpX330にライゲートアニールしたオリゴ。 （; ステップ3.1.4を参照1μM）、5.0μlの制限酵素バッファー（10倍）、4.0μL（20 U）のBbsI制限酵素（5,000 U / 100ngの円形pX330ベクトル、オリゴをアニーリングさ1.0μL：50μlの反応ミックスを調製するml）を、5.0μLのATP（10mM）を、0.25μlの（5μgの）BSA（20 mg / ml）で、0.375μlの（750 U）のT4 DNAリガーゼ（200万U / ml）を加え、H 2 O50μlの最終体積に。必要であれば、この反応は、小さな最終容量にスケールダウンすることができる。 次のパラメータを使用して、サーモサイクラー中で実行したサンプル：サイクル1-20（5分間、37℃、5分間、20℃）。 21サイクル（20分間、80℃）。これらのサイクル条件は一つの反応（ ステップ3.2を参照）で発生する消化および連結を可能にします。 DH5αE.10μlのトランスフォーム（ – 3.2.2 3.2.1からの）反応の1μlの大腸菌細胞 。 37℃でO / Nを100μg/ mlのアンピシリンをLB培地（LB）寒天プレート上でプレートとインキュベートする。 3個のコロニーとミニプレップ文化に接種する – 2を選択してください。 CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC：U6プロモーターフォワードプライマーを使用して、各サンプルおよびシーケンスの各コロニーをミニプレップを行います。これはARですepresentative配列決定プライマー。他の隣接するプライマーを利用することができる。 配列検証されたコロニーを選択し、マキシプレップ文化に接種する。準備サイズが必要とされるDNAの収量に基づいてスケーリングすることができる。 各CRISPR / Cas9の構築物についてマキシプレップを行います。 4.目的の細胞にCRISPRsをトランスフェクション注：このプロトコルは、エレクトロポレーション27によるCRISPR / Cas9プラスミドの送達を含む。このプロトコルは、マウス赤白血病（MEL）細胞は、懸濁細胞株について詳細に説明する。全ての工程中の培養培地は、MEL細胞のために使用される2％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミンを補充したDMEMから成る。しかし、CRISPR / Cas9プラスミドの一過性トランスフェクションに成功し、各細胞型に好適な培養条件およびトランスフェクションストラテジーを使用して、多数の細胞タイプに適合させることができる。 MEL細胞は接着細胞時間浮遊細胞、説明書ですがAVEも含まれて。 CRISPRペア当たり2×10 6個の細胞が存在することを確認してください。エレクトロポレーション溶液100μlで2×10 6個の細胞を再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに追加します。 各CRISPR / Cas9構築物（10μgの全）を5μgを追加します。 GFP発現構築物の0.5μgのを追加します。 エレクトロポレーションシステムを使用して、2mmのキュベット中で5ミリ秒のために250ボルトで電気穿孔細胞。 注：またはそのようなカチオン性リポソームベースのトランスフェクションのような別のトランスフェクション法を使用します。ゲノムの編集を行う前に、堅固なプラスミド送達を確実にするために、レポーター構築物で、各細胞株についてのトランスフェクション条件を最適化する。 すぐにエレクトロポレーション後の培地の1ミリリットル中にキュベットからソリューションを転送する。エレクトロポレーション及び細胞生存率を向上させるために培地中に溶液を移す間の時間を最小にする。 72時間 – 24 37℃ – 30でインキュベートする。ゲノムを高めることができる30℃で効率を編集するが、37℃で許容される。 トランスフェクションされた細胞の5蛍光活性化細胞選別（FACS） FACSチューブに50μmのフィルターを介してそれらをフィルタリングすることにより、FACSのために細胞を準備します。 FACSは、CRISPR / Cas9構築物の高レベルの受信細胞を濃縮するために、GFP陽性細胞の最上部〜3％を並べ替える。 プレートは、セルソーターを用いて、96ウェル丸底プレートに、または96ウェル丸底プレートあたり30個の細胞を限界希釈法を用いて個々に細胞を選別した。前に確実に96ウェルプレート当たり約30細胞を得るためにこのステップを実行することに限界希釈で使用した細胞型をメッキ最適。 細胞培養培地のウェル当たり100μlのを含めます。 メッキされていない残りのソートされた細胞（「バルク」）については、今後のメッキのための細胞の半分を凍結する。 （ ステップ6を参照） をスクリーニングし、プライマーの検証のための他の半分はプレート。 注：このProtocolは浮遊細胞用です。個々の単一細胞由来クローンを採取し、平底96ウェルプレートに移動させることができるように、接着細胞を、96ウェル平底プレート中、または低濃度で10cmディッシュ内の個々の細胞として成長することができます。 7日とクローンは7、37℃でインキュベートすることができます – – 14日バルク細胞は3、37℃でインキュベートすることを許可する。これらの時間は、使用される細胞株の倍加時間に応じて変化する。 注：このインキュベーション時間（ ステップ6.1および7.1を参照）PCRによる意図した削除のために、ゲノムDNA（gDNAを）をスクリーニングするための十分な細胞増殖を可能にします。濃度〜100,000細胞/ mlまたは接着細胞超えるとバルク細胞が十分に増殖し、細胞が~80％のコンフルエンスに達した。クローンは十分〜2mmの直径を有する一回の肉眼で見える増殖している。 6.プライマー検証とCRISPR / Cas9介在欠失のスクリーニング DNA抽出溶液50μlに親およびバルク細胞ペレットを再懸濁することによって、親及びバルク選別した細胞からのgDNAを分離します。 注：細胞数の広い範囲が許容されるが、一般〜100,000個の細胞を、DNA抽出のために使用されている。バルクソート細胞はsgRNA-AとsgRNA-Bにさらされるポリクローナル集団で構成されている（ ステップ5を参照）。次のPCRの目的は、プライマーを検証し、意図されたゲノム欠失の存在を確認することである。 サーモでサンプルを実行し、次のプログラムを実行します。65℃を6分間、98℃を2分間のgDNAを抽出する。 DNA濃度を測定します。 注： ステップ6.1および6.2は、DNA抽出のために効率的な方法をお勧めしますが、ゲノムDNAを単離するための任意の方法は、 ステップ6.3でPCRを行うことができるように利用することができる。 10μlの2倍PCRミックス、0.5μlのフォワードプライマー（10 _：次のコンポーネントで20μlのPCRを組み立てる6; M）、0.5μlのリバースプライマー（10μM）、50〜100 ngのgDNAを、そしてH 2 O最大20μL。上記の手順2で設計されたプライマーを使用してください。別々の反応における「非削除バンド」と「削除バンド」についてPCRを実施する。 注：多くのポリメラーゼは、 ステップ6.3のために使用することができる。 10分間、15分間、95℃（30秒、1分、60℃、1分間72℃、95℃）の35サイクル、および72℃以下のパラメータを使用して、サーモサイクラー中で実行したサンプル。バルクソートされた細胞をテストに基づいて設計された各プライマーペアのPCR条件を最適化します。 1×トリス – 酢酸-EDTA（TAE）緩衝液を用いて10 V / cmの2％アガロースゲル上で泳動したサンプル。 非削除し、削除バンドの存在/不在（ 図2）のためのサンプルを調べます。多重「削除」および「非削除」とは、単一の反応においてPCRプライマー対を考慮する。多重化を最適化ポリクローナル集団内の個々のクローンをスクリーニングする前に（ すなわち、バルク、細胞をソート）。それは、削除と非削除アンプリコンが簡単に多重化するためのアガロースゲルで分離することが重要です。 7.スクリーニングCRISPR /欠失およびクローン選択のためのCas9クローン懸濁細胞については、既に150μlの最終体積のために、ウェルあたり50μlの細胞培養培地を含む単一の96ウェルプレートに全てのクロー​​ンを転送する。これは、マルチチャンネルピ ​​ペットをステップ7の手順の残りのために使用できるようにすることで、スクリーニングを容易にする。 マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルPCRプレートに、各ウェル（各ウェルに100μlのを残して）からの振替を50μl。 5分間400×gで遠心しPCRプレートとシンクの上にPCRプレートをフリックで上清を除去。よく再懸濁あたりのDNA抽出溶液50μlを追加します。浮遊細胞のための7.3に進みます。 </LI> 付着細胞、培地を吸引してください。クローンが存在して各ウェルに0.05％トリプシンEDTA20μlのを追加します。 メディアの200μlの中で細胞を再懸濁。ピペットは、細胞を剥離するために混ぜる。 二つの別々の96ウェル平底プレートに各μlをプレート100。クローンが成長し、削除の各クローンをスクリーニングするために、他のプレートを使用することを可能にするために一つのプレートを保管してください。 200μlの総体積のために各ウェルに追加の100μlのを追加します。細胞が成長できるように、72時間 – 24を待ちます。 吸引するメディア。よく、再懸濁し、96ウェルPCRプレートへの転送あたり50μlのDNA抽出溶液を追加します。 7.3に進みます。 クローンからのgDNAを抽出します。サーモでサンプルを実行します。6分65℃、2分のgDNAを抽出するための98℃。 画面の各クローンをバルク細胞に最適化された同一のPCRプライマーおよび反応条件を用いて（ ステップ6を参照）。 クローンのiDENはを選択希望する削除をtifiedと成長のためのより大きなプレートまたはフラスコに移動します。 対立遺伝子の削除クローンの8検証得られたクローンを特徴付ける成功ノックアウトを検証するために、DNAにおけるクローンならびにRNAおよび/またはタンパク質のレベルを評価する。 DNAを評価するために、プルーフリーディングポリメラーゼで二対立遺伝子欠失クローンから削除バンドを増幅し、プラスミドベクターにアンプリコン（ 例えば、PCRクローニングキット付き）をクローンする。 DH5αE.にプラスミドをトランスフォーム関連する抗生物質を含むLB寒天プレート上に大腸菌細胞プレート。複数のコロニー、ミニプレップ各1を選択し、各欠アレル28特徴付けるのサンガー配列決定に各クローンを施す- 30。初期画面の後に削除するためのPCR検査を繰り返すこと正しいクローンが選択され、結果の再現されたことを保証します。 RNAを評価するために、GENのためのRT-QPCRを行う関連する遺伝子30,31のE発現。 タンパク質を評価するために、関連するタンパク質33に対する抗体を用いたイムノブロットを行う。