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Biology

Generazione di Genomic eliminazioni in linee cellulari di mammiferi via CRISPR / Cas9

Published: January 03, 2015
doi:
10.3791/52118
, ,
1Harvard Medical School, 2Division of Hematology/Oncology,Boston Children’s Hospital, 3Department of Pediatric Oncology,Dana-Farber Cancer Institute, 4Howard Hughes Medical Institute

Summary

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Abstract

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

Introduction

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.

The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.

Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.

Protocol

1. CRISPR design SgRNAs design manualmente o utilizzando liberamente disponibili strumenti online 7. Utilizzare questi strumenti per aiutare a identificare le sequenze di guida che riducono al minimo le partite genomiche identiche o quasi le partite per ridurre il rischio di scissione da siti bersaglio (effetti off-target). Assicurarsi che le sequenze di guida sono costituiti da un 20-mer ("sequenza protospacer") a monte di una sequenza "NGG" ("protospacer motivo contiguo" o PAM) presso il sito di riconoscimento genomica. NOTA: La figura 1 descrive le possibili strategie di eliminazione per i geni ed elementi non codificanti. Per la creazione di un knockout gene, due sgRNA situati all'interno esoni arricchiranno cloni di eliminazione anche monoallelic per perdita di funzione. Ciò è dovuto alla elevata frequenza di indels formati su alleli non cancellato 12, che possono causare frameshift mutazioni che portano a dialogo mediata decadimento della trascrizione dell'mRNA (Figura 1B). Utilizzare ilesempio guida per l'eliminazione prevista di PIM1 nel topo (Mus musculus, Tabella 1, Figura 2A). NOTA: In questo esempio, la sequenza di protospacer sgRNA-A e PAM capita di cadere sul filo di fondo (Crick), mentre la sequenza protospacer di sgRNA-B e PAM cadono in alto (Watson) filamento (Figura 2A). Tuttavia, si verificherà DSB indipendente dall'orientamento del protospacer sequenza / PAM rispetto al filo superiore o inferiore. Determinare il complemento inverso (rc) di ciascuna sequenza guida. Esempio invertire sequenze complemento del PIM1 sgRNA dalla tabella 1 si trovano nella tabella 2. Ottenere 24- o 25-mer oligonucleotidi per ogni guida e il suo complemento rovescio associato tra l'altro nucleotidi complementari a scopi di clonazione e di espressione. NOTA: Qui si discute l'uso del pSpCas9 (BB) plasmide (pX330) (Addgene ID plasmide 42230). Questo plasmide permette la simultaneaespressione di sgRNA e SpCas9, ma non contiene marcatori per la selezione 7. Altri costrutti possono essere utilizzati, come ad esempio pX458 (Addgene ID plasmide 48138) o pX459 (Addgene ID plasmide 48.139), che includono GFP e puromicina marcatori selezionabili, rispettivamente, o costrutti in cui più sgRNAs può essere espresso da un singolo plasmide. Aggiungi "CACC" prima della sequenza di guida 20-mer e "AAAC" prima di complemento retromarcia della guida per la clonazione nel vettore pX330 utilizzando BBSI enzima di restrizione (tabella 3). Aggiungere un nucleotide G dopo la sequenza CACC e prima 20-mer se la prima posizione del 20-mer non è espressione G. sgRNA dal promotore U6 del vettore pX330 è migliorata con l'inclusione di un nucleotide G dopo la sequenza CACC . Aggiungere una C all'estremità 3 'del complemento inverso oligo (es sgRNA-A nella tabella 4). Gli oligo risultanti sarebbero oligo 25-mer. Comemai, se la prima posizione del 20-mer (sequenza protospacer) è G, non aggiungere un'altra G (ad esempio, sgRNA-B in Tabella 4) e non aggiungere C alla posizione finale del complemento oligo inverso. In questo caso, gli oligo risultanti sarebbero oligonucleotidi 24-mer (Tabella 4). 2. Progettazione di eliminazione Primer screening Disegno un set di primer interni alla sequenza da cancellare ("banda non-soppressione") e un'altra serie di primer a monte ea valle dei siti sgRNA scissione ("soppressione banda"; Figure 1 – 2). In assenza di soppressione, "banda eliminazione" è spesso troppo grande per amplificare in modo efficiente. Tipicamente utilizzare primer almeno 100 bp dal sito di taglio previsto per garantire il rilevamento non essere influenzato da una piccola indel presso il sito di destinazione sgRNA. Progettare primer supplementari da analizzare per sfregio (piccole indels prodotti nello sgRNA csito leavage senza la soppressione prevista). Utilizzare un paio di avanti e indietro primer fiancheggianti ogni sito di destinazione sgRNA (entro 150-350 bp) per amplificare il sito di destinazione sgRNA esaminare per sfregio. Questo può essere utile per caratterizzare i allele non eliminati in cloni di eliminazione monoallelic. Per piccole delezioni (come "banda eliminazione" può ancora amplificare), risolvere ampliconi su gel di agarosio per determinare se la dimensione è coerente con la presenza o l'assenza di eliminazione. Per questo approccio, i primer interni descritti al punto 2.1 possono essere omesse. 3. CRISPR Clonazione Ricottura e fosforilare oligonucleotidi. Oligo Risospendere una concentrazione di 100 mM in DDH 2 O. Preparare una miscela di 10 ml di reazione per ogni guida e il suo complemento inverso: 1,0 microlitri sgRNA 24 o 25-mer oligo (100 micron; vedere il punto 1.4), 1,0 ml sgRNA 24 o 25-mer invertire complement oligo (100 micron; vedere il punto 1.4), 1,0 ml 10x T4 Ligation Buffer, 6,5 ml DDH 2 O, e 0,5 microlitri T4 Polynucleotide Kinase (PNK) (10.000 U / ml). NOTA: fosforilata oligos possono essere ordinati invece. Per questo approccio, l'uso di PNK T4 viene omesso. Anneal in un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: 37 ° C per 30 min; 95 ° C per 5 minuti e poi rampa fino a 25 ° C a 5 ° C / min. Diluire oligo 1:10 in DDH 2 O (ad esempio, 1,0 microlitri ricotti oligo + 9,0 ml DDH 2 O per ottenere una concentrazione di 1 mM). Legare oligo ricotto in pX330 con un Golden Gate assemblea strategia clonazione 26. Preparare una miscela di reazione 50 microlitri: 100 ng vettore circolare pX330, 1.0 ml oligos ricotto (1 micron; vedere il punto 3.1.4), 5,0 ml di buffer enzima di restrizione (10x), 4,0 ml (20 U) BBSI enzima di restrizione (5.000 U / ml), 5.0 μl ATP (10 mM), 0,25 ml (5 mg) BSA (20 mg / ml), 0,375 ml (750 U) DNA ligasi T4 (2.000.000 U / ml) e H 2 O al volume finale di 50 pl. Questa reazione può essere ridotta ad un volume finale inferiore se necessario. Campioni eseguito in un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: Cicli 1-20 (37 ° C per 5 minuti, 20 ° C per 5 min); Ciclo 21 (80 ° C per 20 min). Queste condizioni consentono di ciclismo per la digestione e legatura a verificarsi in una reazione (vedi punto 3.2). Trasformare 10 ml di DH5α E. coli con 1 ml di reazione (da 3.2.1 – 3.2.2). Piatto su una lisogenia brodo (LB) piastra di agar con 100 mg / ml di ampicillina e incubare O / N a 37 ° C. Scegli 2 – 3 colonie e inoculare in una cultura mini-prep. Eseguire mini-preparazione per ogni campione e sequenziare ogni colonia con un primer forward promotore U6: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Questo è arepresentative sequenziamento Primer; altri primer fiancheggianti possono essere utilizzati. Scegli una colonia sequenza verificata e inoculare in una cultura maxi-prep. Dimensioni Prep può essere scalata in base alla resa DNA richiesto. Eseguire maxi-prep per ogni CRISPR / Cas9 costrutto. 4. trasfettando CRISPRs in cellule di interesse NOTA: Questo protocollo prevede la consegna di CRISPR / Cas9 plasmidi mediante elettroporazione 27. Questo protocollo è descritto in dettaglio per eritroleucemiche murina (MEL) cellule, una linea cellulare di sospensione. Il mezzo di coltura in tutti i passaggi consiste di DMEM supplementato con 2% di penicillina / streptomicina e 1% di L-glutammina, che viene utilizzato per le cellule MEL. Tuttavia, trasfezione transitoria di CRISPR / Cas9 plasmidi può essere adattato con successo a numerosi tipi di cellule utilizzando condizioni di coltura preferite e le strategie di trasfezione per ogni tipo di cellula. Mentre le cellule MEL sono cellule di sospensione, le istruzioni per le cellule aderenti have stato anche incluso. Assicurarsi che non ci sono 2 x 10 6 cellule per paio CRISPR. Risospendere 2 x 10 6 cellule in 100 ml di soluzione di elettroporazione e aggiungere al elettroporazione cuvetta. Aggiungere 5 mg di ogni CRISPR / Cas9 costrutto (10 mg totali). Aggiungere 0,5 mg di GFP espressione costrutto. Cellule elettroporazione con 250 volt per 5 msec in una provetta 2 millimetri che utilizzano un sistema di elettroporazione. NOTA: In alternativa, usare un altro metodo di trasfezione come cationico transfezione a base di liposomi. Ottimizzare le condizioni di trasfezione per ciascuna linea cellulare con un costrutto giornalista per garantire la consegna plasmide robusta prima di tentare la modifica del genoma. Trasferire immediatamente soluzione dalla cuvetta in 1 ml di coltura dopo elettroporazione. Minimizzare il tempo tra elettroporazione e trasferire la soluzione in media per migliorare la vitalità cellulare. Incubare a 30 – 37 ° C per 24-72 ore. 30 ° C possono migliorare genomamodifica l'efficienza, ma 37 ° C è accettabile. 5. Fluorescence Activated Cell ordinamento (FACS) di cellule trasfettate Preparare cellule per FACS filtrandoli attraverso un filtro 50 micron in un tubo FACS. FACS ordinare il top ~ 3% di cellule GFP positive per arricchire le cellule che hanno ricevuto alti livelli di CRISPR / Cas9 costruisce. Piatto cellule ordinati individualmente in piastre a fondo rotondo da 96 pozzetti con sorter o utilizzando diluizione limite a 30 cellule per 96 pozzetti a fondo tondo piastra. Ottimizzare placcatura tipo di cellula usato in diluizione limite prima di eseguire questa procedura per ottenere in modo affidabile circa 30 cellule per piastra da 96 pozzetti. Include 100 ml per pozzetto di coltura cellulare multimediale. Per le restanti cellule ordinati ("bulk") che non sono stati placcati, congelare la metà delle cellule per il futuro la placcatura. Piatto l'altra metà per lo screening e la validazione di fondo (vedi punto 6). NOTA: Questo pROTOCOLLO è per cellule in sospensione. Cellule aderenti possono sia crescere le cellule individuali in piastra inferiore da 96 pozzetti piatto o in un piatto di 10 centimetri a bassa concentrazione in modo che unicellulari individuo cloni derivati ​​possono essere raccolti e trasferiti in un fondo piastra a 96 pozzetti piatta. Lasciare le cellule rinfusa ad incubare a 37 ° C per 3 – 7 giorni e permettere ai cloni di incubare a 37 ° C per 7 – 14 giorni. Vary questi tempi a seconda del tempo di raddoppio della linea cellulare utilizzata. NOTA: Questa volta incubazione consente per la proliferazione cellulare sufficiente per lo screening del DNA genomico (gDNA) per la cancellazione previsto mediante PCR (vedere i passi 6.1 e 7.1). Le cellule di massa hanno sufficientemente moltiplicate quando la concentrazione supera ~ 100.000 cellule / ml o per cellule aderenti, le cellule hanno raggiunto ~ 80% di confluenza. I cloni sono sufficientemente proliferato volta macroscopicamente visibili di diametro ~ 2 mm. 6. Primer Convalida e Screening per CRISPR / Soppressione Cas9-mediata Isolare gDNA da cellule ordinati parentali e sfusi risospendendo pellet cellulari parentali e di massa in 50 ml di soluzione di estrazione del DNA. NOTA: Generalmente ~ 100.000 cellule sono utilizzati per l'estrazione del DNA, anche se una vasta gamma di numero di cellule è accettabile. Le cellule bulk filtrate sono composti da una popolazione policlonale esposta a sgRNA-A e sgRNA-B (vedere la fase 5). Lo scopo del seguente PCR è validare primer e verificare la presenza di destinato delezione genomica. Eseguire campione termociclatore ed eseguire il seguente programma: 65 ° C per 6 min, 98 ° C per 2 minuti per estrarre gDNA. Misurare la concentrazione di DNA. NOTA: Mentre fasi 6.1 e 6.2 suggeriscono un metodo efficiente per l'estrazione del DNA, qualsiasi metodo per l'isolamento del DNA genomico può essere utilizzato per essere in grado di effettuare PCR nel passo 6.3. Assemblare un 20 microlitri PCR con i seguenti componenti: 10 ml mix 2x PCR, 0,5 microlitri primer forward (10 _6, M), 0,5 ml di primer inverso (10 micron), 50-100 ng gDNA, e H 2 O fino a 20 ml. Utilizzare i primer disegnati al punto 2. Condurre PCR per "banda di non-soppressione" e "banda cancellazione" in reazioni separate. NOTA: Numerose polimerasi possono essere utilizzati per passo 6.3. Campioni eseguito in un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: 95 ° C per 15 minuti, 35 cicli di (95 ° C per 30 sec, 60 ° C per 1 min, 72 ° C per 1 min), e 72 ° C per 10 min . Ottimizzare le condizioni di PCR per ciascuna coppia di primer progettato sulla base di test delle celle di massa ordinato. Eseguire campioni su 2% gel a 10 V / cm utilizzando 1x Tris-acetato-EDTA (TAE) buffer. Esaminate campioni per la presenza / assenza di non-delezione e bande di cancellazione (Figura 2). Considerare il multiplexing "eliminazione" e "non-cancellazione" PCR coppie di primer in una singola reazione. Ottimizzare multiplexingin una popolazione policlonale (cioè, bulk cellule allineati) prima di screening singoli cloni. È fondamentale che l'eliminazione e non cancellazione amplificati essere facilmente risolti su un gel per multiplexing. 7. Screening CRISPR / Cas9 cloni per Cancellazioni e Clone selezione Per le cellule di sospensione, trasferire tutti i cloni di un'unica piastra a 96 pozzetti che contiene già 50 microlitri colture cellulari per pozzetto per un volume finale di 150 microlitri. Questo facilita lo screening consentendo una pipetta multicanale da utilizzare per il resto dei passaggi nel passaggio 7. Trasferire 50 microlitri di ciascun pozzetto (100 pl lasciando in ciascun pozzetto) ad una piastra a 96 pozzetti PCR usando una pipetta multicanale. Centrifugare piastra PCR a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante muovendo la piastra PCR sopra un lavandino. Aggiungere 50 ml di soluzione di estrazione del DNA per bene e risospendere. Passare alla fase 7.3 per cellule in sospensione. </li> Per le cellule aderenti, media aspirare. Aggiungere 20 ml di 0,05% tripsina-EDTA ad ogni pozzetto con un clone presente. Risospendere le cellule in 200 l di media. Pipetta mix di staccare le cellule. Piatto 100 ml ciascuna in due 96-ben lastre piane-bottom separati. Mantenere una piastra per consentire cloni di crescere e utilizzare l'altra piastra per lo screening ogni clone per le eliminazioni. Aggiungere ulteriori 100 microlitri di ciascun pozzetto per un volume totale di 200 microlitri. Attendere 24-72 ore per permettere alle cellule di crescere. Aspirare il terreno. Aggiungere 50 ml di soluzione di estrazione di DNA per pozzetto, risospendere e trasferimento a 96 pozzetti PCR. Passare al punto 7.3. Estrarre il gDNA da cloni. Eseguire campione termociclatore: 65 ° C per 6 minuti e 98 ° C per 2 min per estrarre gDNA. Schermo ogni clone utilizzando lo stesso primer PCR e condizioni di reazione ottimizzate sulle cellule massa (vedi punto 6). Selezionare la cloni identificata con la cancellazione desiderato e passare al piatto più grande o pallone per la crescita. 8. La convalida di biallelici di eliminazione Clones Al fine di caratterizzare cloni ottenuti e validare un ko di successo, di valutare i cloni del DNA, così come i livelli di RNA e / o proteine. Per valutare il DNA, amplificare bande cancellazione da cloni delezione biallelici con polimerasi revisione e clonare le amplificati (ad esempio, con un kit di clonazione PCR) in un vettore plasmide. Trasforma il plasmide in DH5α E. coli cellule e piastra su piastre di agar LB con antibiotico in questione. Selezionare più colonie, mini-prep ciascuno, e sottoporre ogni clone di Sanger sequenziamento di caratterizzare ogni cancellazione allele 28 – 30. Ripetendo la prova PCR per l'eliminazione dopo la schermata iniziale assicura che il clone corretto è stato selezionato e riproducibilità dei risultati. Per valutare l'RNA, eseguire RT-qPCR per gene l'espressione del gene corrispondente 30,31. Per valutare la proteina, eseguire un immunoblot usando un anticorpo contro la proteina rilevante 33.

Representative Results

L'obiettivo di questo esperimento è stata la cancellazione di PIM1 in cellule MEL. L'utilizzo di più coppie non sovrapposti sgRNA (cioè, sequenze protospacer indipendenti) può aiutare a controllare gli effetti off-bersaglio (Figura 1A). Un fenotipo coerente sarebbe più probabile il risultato di un effetto on-target rispetto a un comune effetto off-obiettivo condiviso da più sequenze protospacer indipendenti. Ogni coppia dovrebbe portare alla produzione di un punto di interruzione delezione unico. Se ravvicinati (cioè, meno di n ~ 150 bp), gli stessi primer di screening possono essere usati per rilevare delezioni prodotte da ciascuna serie di sgRNAs. Delezioni genomiche possono disturbare geni utilizzando coppie sgRNA in diverse posizioni rispetto al gene (Figura 1B). Ad esempio, la coppia sgRNA può affiancare un gene per l'eliminazione di tutto il corpo gene; la coppia potrebbe essere situata all'interno di due esoni, con la possibilità di creare indels frameshift anche se uno o entrambi alleles non sono stati cancellati; o la coppia può affiancare un esone specifico per consentire rottura di un particolare isoforma. La strategia utilizzata per delezione PIM1 era progettare accompagnamento sgRNAs per eliminare tutto il corpo gene, una delezione 8 kb (Figura 2). Questa strategia è stata scelta, in parte a causa delle dimensioni relativamente ridotte del gene PIM1. Questo esempio mostra uno PAM (verde) in alto (Watson) filamento e uno PAM sul fondo (Crick) filamento; Tuttavia, DSB è indipendente sequenza PAM localizzazione al filo superiore o inferiore. coppie sgRNA possono avere entrambe le sequenze PAM sul filamento superiore, sia sul filamento inferiore, o uno di ciascuno. Utilizzando il protocollo sopra descritto, sono stati progettati due sgRNA, clonati nel vettore di espressione pX330, e consegnati alle cellule MEL ​​mediante elettroporazione con un reporter GFP (Figura 2A). La top 3% di cellule GFP + sono stati ordinati due giorni post-elettroporazione e placcato clonale a limitare la diluizione. Schermoprimer ing sono stati progettati come descritto al punto 2 e, come illustrato nella figura 2. condizioni di PCR sono stati ottimizzati utilizzando gDNA isolate da cellule MEL ​​parentali e da "massa" cellule ordinati. 10 giorni dopo la placcatura, gDNA stato isolato da tutti i cloni e proiettato per la cancellazione tramite PCR, che ha individuato non la cancellazione, monoallelic e cloni cancellazione biallelici secondo i modelli di non-delezione (ND) e cancellazione (D) amplificati (Figura 3) . Cloni non-delezione sono stati identificati come aventi la presenza dell'amplicone non-soppressione e l'assenza dell'amplicone eliminazione. Monoallelic cloni sono stati identificati come aventi la presenza sia del non-soppressione e ampliconi cancellazione. Biallelici cloni sono stati identificati come aventi assenza dell'amplicone non-soppressione e la presenza dell'amplicone eliminazione. Per questa soppressione, 400 cloni sono stati sottoposti a screening che ha individuato 126 cloni cancellazione monoallelic e 32 delet biallelic cloni ioni (è importante notare che la frequenza delezione varia con delezione dimensione 12). Cloni cancellazione biallelici sono stati selezionati e spostati palloni con 8 ml di media. Dopo 5 giorni per consentire l'espansione, ciascun clone è stato riprovato mediante PCR di gDNA per confermare biallelici delezione e cancellazione ampliconi sono stati sottoposti a sequenziamento Sanger per identificare il preciso delezione (Figura 2B). L'eterogeneità nei ampliconi eliminazione riflette imperfetta-indel formando NHEJ riparazione. Il sequenziamento del allele non-delezione in cloni di eliminazione monoallelelic indels scoperti nella maggior parte dei casi, a dimostrazione che anche l'allele non-eliminato viene frequentemente modificato da CRISPR / Cas9, che può essere importante per le applicazioni in cui sono richieste due cloni cancellazione monoallelic e biallelici . RNA è stato isolato da cloni di delezione biallelici e analizzato mediante RT-qPCR per confermare la perdita di espressione PIM1 (Figura 4). modi "> Figura 1. Schema di possibili strategie di eliminazione. (A) Due esempi sgRNA coppie di delezioni genomiche (mostrata in nero e arancione, rispettivamente). Le frecce blu indicano primer per rilevare l'amplicon non cancellazione e frecce rosse indicano primer per rilevare l'amplicon eliminazione. sgRNA posizioni 17 e 18 sono evidenziati in rosso e blu a sgRNA-Siti-A 1 / A 2 e sono evidenziati in viola e arancio a sgRNA-Siti-B 1 / B 2 con una linea rossa che indica la scissione Cas9 previsto tra le posizioni 17 e 18. (B) cleavages CRISPR diretto vengono visualizzati come linee nere verticali. Le frecce blu indicano primer per rilevare l'amplicon non cancellazione e frecce rosse indicano primer per rilevare l'amplicon eliminazione. Clicca qui per vedereuna versione più grande di questa figura. Figura 2. Strategia per produrre e rilevare la cancellazione di PIM1, tra cui l'eliminazione di sequenziamento e alleli non-delezione. (A) Schema della strategia di screening basata sulla PCR per identificare PIM1 cloni di eliminazione. Una coppia di primer si trova interno alla cancellazione (frecce blu) e una coppia di primer è localizzato esterna per la cancellazione (frecce rosse). sequenze sgRNA (sequenze protospacer) sono mostrati in viola. Le linee rosse verticali indicano il clivaggio Cas9 previsto tra le posizioni 17 e 18 della sequenza sgRNA. (B) Sanger sequenziamento rivela formazione indel al sito di riconoscimento sgRNA. sequenze sgRNA sono mostrati in sequenza viola e PAM in verde. Eventi di eliminazione sono shproprio da un numero equivalente di marchi precipitare e inserimenti sono evidenziati in blu. Linee rosse verticali indicano predetto sito di taglio, tra le posizioni 17 e 18 della sgRNA. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. Gel Rappresentante individuazione non la cancellazione, monoallelic, e cloni biallelici. Per ogni clone, la corsia di sinistra rappresenta il non-delezione amplicone ("ND" in blu) e la corsia di destra rappresenta la amplicone cancellazione ("D" in rosso ). Cloni individuali sono separati da linee tratteggiate. I tre cloni di delezione monoallelic sono cloni 5, 6, e 2. Le tre cloni di delezione biallelici sono cloni 15, 17, e 13. Come si vede dai dati di sequenziamento, la banda di eliminazione per c solo 13 ha una dimensione inferiore a causa di cancellazioni più grandi allo svincolo eliminazione. Figura 4. Perdita di espressione PIM1 in cloni di eliminazione biallelici. Espressione PIM1 è stato calcolato per due cloni cancellazione biallelici di RT-qPCR. I dati sono stati normalizzati per GAPDH con il 2 – metodo ΔCt. Protospacer Sequence sgRNA-A 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-B 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' Tabella 1. 20-mer sequenze protospacer per due sgRNA per la cancellazione di PIM1. 543 "> Complemento inversione di sequenza Protospacer sgRNA-A-RC 5'-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Tabella 2. complemento inverso delle sequenze protospacer per i due sgRNA dalla Tabella 1. Sequenze sgRNA-A 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-A-RC 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Tabella 3. sequenze Protospacer e l'inversione completa con "CACC" e "AAAC" aggiunto per la clonazione nel vettore pX330 utilizzando BBSI enzima di restrizione. Sequenze sgRNA-A 5'CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-A-RC 5'AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 ' sgRNA-B 5'CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' sgRNA-B-rc 5'AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Tabella 4. sgRNA espressione dal promotore U6 del vettore pX330 è migliorata con l'aggiunta di un nucleotide G dopo la sequenza CACC e prima20-mer. L'aggiunta di un G nucleotide supplementare richiede l'aggiunta di un nucleotide C all'estremità 3 'del complemento oligo inversa (ad esempio, sgRNA-A). Tuttavia, se la prima posizione del 20-mer (sequenza protospacer) è già un nucleotide G, non è necessario aggiungere un'altra G (ad esempio, sgRNA-B) e senza necessità di aggiungere C alla posizione finale del complemento inverso oligo.

Discussion

Il sistema CRISPR / Cas9 può essere utilizzato per generare delezioni genomiche di una gamma di dimensioni. Anche se abbiamo osservato che la frequenza di eliminazione varia inversamente rispetto alle dimensioni cancellazione previsto, siamo stati in grado di recuperare le eliminazioni fino a 1 Mb, e le cancellazioni fino a 100 kb di routine resa più biallelici cancellato cloni. Abbiamo osservato alcun calo di efficienza di delezioni sequenzialmente introduzione in una linea cellulare. Questa strategia può essere utilizzato per la creazione di delezione combinatoria di numerosi geni ed elementi. Il processo per ottenere cloni di delezione biallelici può essere accelerato stimando il numero minimo di cloni necessari per essere proiettato in base alle dimensioni delezione per ottenere il numero desiderato di cloni con delezione biallelica 12.

La possibilità di ottenere la cancellazione monoallelic con assenza di delezione biallelica alla distribuzione probabilistica potrebbe indicare letalità cella associata con completa perdita di funzione. Low frequency o delezioni assenti potrebbero riflettere un certo numero di scenari tra cui poveri trasfezione, sgRNAs inefficienti o inefficienti primer di screening PCR (a causa della mancanza di un controllo positivo per convalidare primer PCR per lo screening per l'eliminazione). Cellule GFP + può essere utilizzato come un surrogato per efficienza di trasfezione (vedi punto 5.2), quindi una riduzione delle cellule GFP + probabilmente riflette poveri trasfezione e una risultante diminuita efficienza eliminazione. Utilizzando due diverse coppie sgRNA con primer di screening indipendenti possono contribuire a controllare per sgRNA inefficiente e screening primer PCR e massimizzare le possibilità di ottenere cloni di eliminazione biallelici. Cella di ordinamento per + cellule GFP arricchisce per alleli cancellazione. Anche se questo passaggio può essere omesso, omissioni probabilmente necessitano di screening più cloni per identificare quelli con delezioni monoallelic o biallelici. Nella misura in cui l'efficienza di trasfezione può essere ottimizzato, ci aspetteremmo efficienza editing genoma da valorizzare.

<p class = "jove_content"> Gli eventi NHEJ che sono alla base delezioni e risultato riparazione locale in una serie di alleli con una varietà di indels nei siti di destinazione. Il risultato predominante è di piccole ~ 1 – 10 inserimenti BP o più comunemente delezioni nel sito di scissione sgRNA diretto (Figura 2B). Spesso questi alleli sembrano essere il risultato di base microhomology riparazione 34,35. Va notato che la strategia di rilevamento basato su PCR descriviamo non identificherà inserzioni più grandi o più complessi, delezioni, inversioni o riarrangiamenti. Anche se questi eventi sono meno comuni, abbiamo osservato cloni in cui potrebbero essere rilevate né l'eliminazione né ampliconi non delezione, e dopo ulteriori indagini riflettere questi risultati più complessi.

Abbiamo osservato vasta CRISPR / Cas9-mediata "cicatrici" del non-delezione alleli di monoallelic e non cancellazione cloni (vedi Figura 2B). Questi "cicatrici" sono composti dapiccole indels prodotti nel sito di clivaggio sgRNA senza cancellazione previsto (cioè, soppressione del segmento intercorrente tra sgRNAs A e B). Queste cicatrici spesso interrompono il riconoscimento di destinazione dal sgRNA. Pertanto esortiamo cautela in retargeting alleli in cellule precedentemente esposti a sgRNAs utilizzando le stesse sgRNAs. Una strategia di retargeting più efficace sarebbe utilizzare sgRNA unico sequenze distinte da siti di riconoscimento in precedenza "segnate". In casi in cui una coppia di sgRNAs riconosce sequenze exonic (Figura 1B, in basso), alleli frameshift può essere prodotto anche in assenza di eliminazione. Pertanto, cloni eliminazione monoallelic possono essere arricchiti per la perdita-di-funzione a causa della elevata frequenza di mutazioni frameshift sulla non-eliminato allele 12.

Una preoccupazione con il sistema CRISPR / Cas9 è fuori bersaglio effetti, vale a dire, la modifica genomico in siti non voluti 36-38. Rrapporti alcune recenti hanno suggerito che RNA guida più brevi con 17-19 nucleotidi in grado di ridurre la frequenza di CRISPR / Cas9 basato effetti 39 fuori bersaglio. Inoltre, una strategia doppio intaccare utilizzando due guide per sito bersaglio con un nickase può essere usato per creare DSBs minimizzando effetti 7 off-target. In alternativa, analogo a strategie utilizzate per RNAi, vi consigliamo di diverse coppie di sgRNAs con non sovrapposti sequenze protospacer essere usati per dimostrare che il fenotipo osservato è il risultato della CRISPR / modifica on-target Cas9 al contrario di un potenziale fuori bersaglio effetto. Un approccio pratico sarebbe quello di progettare almeno due coppie sgRNA adiacenti ma non si sovrappongono in modo che un singolo set di primer di screening (vedi punto 2) può essere utilizzato per più coppie sgRNA (Figura 1A). Inoltre, integrando una linea cellulare cancellazione reintroducendo la sequenza mancante e / o gene interrotto può dimostrare una relazione causale traun dato delezione genomica e fenotipo.

Per i biologi che lavorano con sistemi modello cellulare, RNAi ha rappresentato un potente strumento per la genomica funzionale. Tuttavia, i limiti di questo approccio hanno incluso riduzione incompleta in livelli di trascrizione bersaglio mRNA, eterogeneità degli effetti dei reagenti indipendenti destinate lo stesso gene, e sono noti effetti off-target, inclusi gli effetti di semi-based e non-seme 40-42. Strategie di montaggio Genome promettono di risolvere molti di questi problemi e rappresentano un approccio interessante, complementare perturbazione genetico prospettico 8,36,37. Inoltre, la modifica del genoma permette lo studio di non-codificanti elementi genetici in un modo impossibile da RNAi e stimolante di mira convenzionali approcci 25. Incoraggiamo generazione di delezioni genomiche da CRISPR / Cas9 come metodo robusto e specifico per produrre e caratterizzare la perdita-di-funzione alleli.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201S
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) New England Biolabs M0202T
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
BSA, Molecular Biology Grade New England Biolabs B9000S
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) New England Biolabs R0539S
pSpCas9(BB) (pX330) Addgene 42230
S.O.C. Medium Life Technologies 15544-034
BTX ECM 830 Harvard Apparatus 45-0052
BTX Solution and 2mm Cuvettes Harvard Apparatus 45-0803
pmaxGFP Plasmid Lonza VPA-1003
QuickExtract DNA Extraction Solution Epicentre QE09050
HotStarTaq PCR Master Mix Kit Qiagen 203443
Zero Blunt PCR Cloning Kit Life Technologies K2700-20
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Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118, doi:10.3791/52118 (2015).
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