JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA<sub></sub> רצפטורים

Published: November 14, 2014
doi:
10.3791/52115
, , , , ,
1UCL School of Pharmacy,University College London

Summary

המנגנונים המולקולריים הלתאם את ההיווצרות של סינפסות GABAergic המעכבת במהלך ontogeny אינם ידועים. ללמוד את התהליכים האלה, שפיתחנו מערכת מודל שיתוף תרבות אשר משלבת נוירונים GABAergic הקוצנית בינונית עובריים בתרבית יחד עם תאי הכליה עוברית אנושית 293 (HEK293) transfected ביציבות להביע קולטני GABA פונקציונלי.

Abstract

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (γ-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials.

During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other.

To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Introduction

GABA הוא אחד מהנוירוטרנסמיטרים הקדומים ביותר שנמצאו במוח העוברי, שקדמה להנוירוטרנסמיטר גלוטמט מעורר הנפוץ ביותר 1. במהלך פיתוח, GABA depolarizes ומרגש את תאי עצב לא בוגרים, ששיחק תפקיד מפתח בויסות התפשטות תאים, הגירה והיווצרות של רשתות נוירונים ללא גרימה להפעלת יתר רעיל. במוח הבוגר, פוטנציאל ההיפוך לערוצי קולטן GABA מוסט לפוטנציאל שלילי יותר כתוצאה מירידה בריכוז תאית של כלוריד. שינוי זה נגרם על ידי עד-רגולציה של שיתוף טרנספורטר אשלגן כלורי (KCC2), אשר מעביר כלוריד מחוץ לתא, ובמקביל, את תקנה של טרנספורטר נתרן-אשלגן כלורי (NKCC1), שבו יש ההשפעה ההפוכה 2.

במוח, GABA נקשר בעיקר לאו GABA או GABA-B קולטנים לתווך עיכוב הסינפטי מהיר או איטי, בהתאמהly. Rs GABA הוא קבוצה של קולטנים המכונים גם ionotropic heteropentameric או תעלות יונים Cys לולאה מגודרת ליגנד. שתי מולקולות של GABA נדרשות להפעלה של הקולטן, אשר הוא חדיר ליוני כלוריד ובמידה פחותה יותר, יונים ביקרבונט. העלייה במוליכות כלוריד מקטינה את היעילות של depolarizing, אירועים מעוררים בהפעלת תא עצב הפוסט-סינפטי 3.

גיוון מבני של RS GABA כבר זמן רב מוכר כגורם מפתח בקביעת מגוון הרחב שלהם מאפיינים פונקציונליים ותרופתיים. Rs ילידי GABA הוא הטרו-pentamers המורכב מיחידות משנה עם isoforms מרובה סווגה כ: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π וθ 3, עם משותף טופולוגיה הטרנסממברני הכוללת תחום גדול N- מסוף תאי, ארבעה תחומים הטרנסממברני (TMS), ותחום תאיים עיקרי בין זיכרונות 3 ו -4 4.β3 וγ2 תת-יחידות חיוניות לעיכוב הסינפטי והישרדות האורגניזם, כי עכברים שנשאו מחיקה גנטית של תת-יחידות אלה למות לאחר לידת 5,6. בניגוד לכך, isoforms הבודד של מקטע α הם חשוב לתפקוד של קשרים סינפטיים ספציפיים במוח הקשורים להתנהגויות שונות כגון חרדה, הרגעה, גירוי, ואחרים, אבל הם לא, בנפרד, חיוניים לחיים 7-9. Rs GABA הם האתרים העיקריים של פעולה עבור מגוון רחב של תרופות עם תרופת הרגעה חזקה, היפנוטי, טיפול בחרדות ותופעות פרכוסים, כגון בנזודיאזפינים, ברביטורטים, neurosteroids והרדמת 7,10,11.

Rs Synaptic GABA מכיל בדרך כלל תת-יחידת γ2, שתי תת-יחידות β (הנפוץ ביותר β2 או β3) ושתי תת-יחידות α (α1, α2, α3 או α5) 12,13. המעמד הדומיננטי של קולטנים נוספים סינפטי מכיל מקטע δ בשילובעם שתי תת-יחידות α (α4 או α6), ושתי תת-יחידות β (β2 או β3) 14. לוקליזציה subcellular של GABA R כדי אקסונים, דנדריטים או סומה, והחדרה לתוך קרום הפלזמה תלויה בנוכחות של β-יחידות משנה 15,16. עם זאת, שילוב סלקטיבי של GABA שונה R תת לסוגים שונים של סינפסות וקושר היטב עם הנוכחות של תת-יחידות α ספציפיים (α1, α2, α3 או α5) 7,17,18. חשוב לציין, מחיקה של מקטע α1 או α2 בעכברים גורמת לשינויים ultrastructural בסינפסות מעכבות 19. הדבר מצביע על כך GABA RS עצמם עשויים למלא תפקיד ישיר בויסות היווצרות הסינפסה.

ראיות מצביעות על כך שהתפתחות סינפסה GABAergic היא רצף בדיוק-מתואם של אירועים, בם שתי המטרות עצבי קשר סוגים שונים של אקסונים המעכבים וקולטנים המקובצים בכל כיתה של סינפסה המעכבת הנן סלקטיביים, ופונקציונלי קשובים 17,20-22. עיקרון יסוד זה של ייחוד בסינפסות GABAergic מעלה את השאלה, כיצד השותפים טרום postsynaptic להכיר אחד את השני במהלך הייזום של קשרים סינפטיים.

במבחני חוץ גופית התרבות המשותפת יושמו בהצלחה ללמוד על כמה מהמנגנונים של היווצרות הסינפסה ועל מנת לבחון את תפקידם של חלבונים פורשי שסע הסינפטי בודדים בתהליך הזה. אחד השילובים הנפוצים טרנס-סינפטי האינטראקציה החלבון המתפקדים דו directionally לתווך היווצרות הסינפסה והתבגרות, הם Neurexins (Nrxns) וNeuroligins (NLS). Nrxns הם חלבוני סינפטי כי תערוכת שחבור חלופי בתוך תחומים החלבון שלהם laminin-neurexin-המיני מחייב הורמון, והוליד isoforms שונים 23. בעוד Nrxns גם אינטראקציה עם חלבונים אחרים, NLS נחשב לרשות הפוסט-סינפטי בכל מקום שלהםrtners 24. יחד חלבונים אלה תורמים למחזיקים קרומי סינפטי ופוסט-סינפטי בפרד קרוב ונוקשה 25. שני isoforms הנפוץ ביותר הוא NL-1 וNL-2 אשר נמצא בסינפסות מעוררות ומעכבות, בהתאמה 26. אחת ממערכות מודל שיתוף התרבות הקדומות ביותר, שנועדו לחקור אינטראקציות חלבון טרנס-סינפטי, מועסק סוגים שונים של תאים שאינם עצביים, שורות תאים הנפוצות ביותר האלמותיות כגון כליה העוברית האנושי (HEK) 293 תאים, לNL–Express על 2. כאשר התאים אלה בתרבית עם תאי עצב pontine, הצטברות של חלבוני סינפטי בקרבת פני השטח של תאי HEK נצפתה, המצביעה על היווצרותו של קשר כמו סינפסה. תוספת של β-neurexin המסיס לשיתוף תרבויות אלה עכבה את הקמתה של אנשי קשר, המצביעה על כך אינטראקציות הטרנס-סינפטי בין Nrxns וNLS נחוצות למגע הסינפטי היווצרות 27. יתר על כן, ביטוי חולףשל β-neurexin בCOS תאים (V-1 C (קופי) בrigin O, ונושא את החומר הגנטי S V40) שיתוף תרבותי עם glutamatergic ניתק בהיפוקמפוס ונוירונים GABAergic ביטוי מושרה של gephryin חלבון הפוסט-סינפטי ושל תת-יחידות GABA R γ2 וα2 בנקודות מגע בין שני סוגי התאים אלה 28. דוגמא נוספת של מודל שיתוף תרבות משמש ללמוד היווצרות הסינפסה מעורבת HEK293 תאים, זמני transfected עם GABA R תת-יחידות α2 / β3 / γ2 וNL-2, ואוכלוסייה מעורבת של תאי עצב ההיפותלמוס 29. מחקר זה הגיע למסקנה כי הביטוי של NL-2 הוא דרישה הכרחית להיווצרות של סינפסות מעכבות.

α1 עם זאת, במחקר התרבות המשותפת האחרון, transfected ביציבות / β2 / γ2 GABA Rs בHEK293 תאים נמצאו מספיק כדי לגרום סינפסות הפונקציונלית כאשר שיתוף תרבותי עם מד GABAergicנוירונים ium קוצניים, ללא צורך בחלבוני הדבקת טרנס-סינפטי או פוסט נוספים. עם זאת, עלייה בולטת בהיווצרות הסינפסה וכוח נצפתה כאשר NL-2 היה במשותף עם אותה הביע GABA Rs 30. זה מצביע על כך מערכת מודל שיתוף תרבות זו יש יתרונות על פני מערכות מודל שתוארו לעיל, רוב כנראה רגישות ואמינות של זיהוי קשר הסינפטי מוגברים. שני גורמים חשובים המסייעים לשיפור הכללי בזיהוי של קשרים סינפטיים הם: i) השימוש בשורות תאי HEK293 transfected ביציבות עם ביטוי גבוה ועקבי של תת-יחידות GABA R על פני השטח של תאים בודדים. עקביות זו מאפשרת השוואות כמותיות בין תנאי שיתוף תרבות שונים. ii) השימוש באוכלוסייה טהורה של תאי עצב קוצניים בינוני GABAergic תרבית מסטריאטום העוברי ביום 31 במסיר סיבוכים ואי-בהירויות הנובעות מהשימוש באוכלוסיות עצביות מעורבות וallows, למשל, בחירה של סוגי postsynaptic המתאימים ביותר GABA R שניתן להשוות אחד עם השני במהלך היווצרות הסינפסה.

היווצרות של סינפסות היא חשב לערב הרבה אותות טרנס-סינפטי בתוך מתחמי הידבקות תא טרום postsynaptic. בשל האופי הדו-כיוונית של איתות הסינפטי והמספרים העצומים של מולקולות הידבקות תא, קשה לזהות מרכיבים מרכזיים מעורבים בהיווצרות הסינפסה. כך, transfecting חלבון הידבקות תא בודד לתא הלא-עצבי (במקרה זה, שתי המטרות postsynaptic הנפוצות בעולם לנוירונים קוצניים בינוני GABAergic in vivo, α1 / β2 / γ2 או α1 / β3 / γ2 GABA Rs 32) מאוד מפחית את המורכבות של אותות טרנס-סינפטי זמינים על פני השטח postsynaptic ומאפשר ניתוח כמות מדויק של יעילותו של חלבון זה בקידום היווצרות הסינפסה.

Protocol

ספראג-Dawley חולדות או העכברים מולדים BAB / ג (הרלן, בריטניה; מספר הנשים בהריון בשימוש היה 30) שוכנו והקריבו על פי משרד בריטניה בית [והוראת מועצת הקהילות האירופית יום 24 בנובמבר 1986 (86/609 / EEC) ] הנחיות. הפרויקט אושר באופן רשמי על ידי בית הספר לUCL של ועדת אתיקה בית המרקחת. 1. הכנת מכשירים, תרבות בינונית, ומנות הפעל ולנקות את הזרימה למינרית עם אתנול 70% כדי לעבוד בתנאים סטריליים בכל העת. להכין מדיום תרבות תא HEK293, המכיל הנשר בינוני pH השתנה Dulbecco 7.4 (DMEM, 500 מיליליטר), L- גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין (50 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר), וסרום שור העובר (10 %). הערה: פניצילין וסטרפטומיצין הם חומרים מגרים. הכן את מדיום התרבות העצבי הסרום ללא, המכיל pH Neurobasal הבינוני 7.4 (500 מיליליטר), תוסף B27 (25 מיליליטר), L- גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין(50 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר), וגלוקוז (6 מ"מ). להכין 500 מיליליטר של תמיסת מלח HEPES שנאגר (HBSS), המכילים מניות HBSS 10x (50 מיליליטר), HEPES (1 M) (5 מיליליטר) ומים (445 מיליליטר), pH 7.4. פתרון ופר פוספט החיטוי (PBS, pH 7.4; 1 ליטר), מים (1 ליטר), coverslips זכוכית (13 מ"מ קוטר) וטפטפות פסטר זכוכית לעקר אותם. 2. הכנה של שורת תאים יציבה HEK293 הבעת α1 / β3 Rs / γ2-GABA צלחת 2×10 6 HEK293 תאים לתוך צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים סטרילי ולדגור על 37 מעלות С בשיעור של 5% פחמן דו חמצני humidified (CO 2) אווירה (CO 2 באינקובטור) כדי להגיע confluency 70-90% בין לילה. למחרת, transfect HEK293 תאים עם cDNA המקטע α1 GABA R בוקטור 3.1 הביטוי (+) pcDN שילוב disulfate G418 גן התנגדות (טבלה 1),וcDNA מקטע β3 GABA R בוקטור ביטוי שילוב phleomycin D1 (טבלת 1) גן התנגדות (שניהם תחת הרגולציה של אמרגן ציטומגלווירוס האנושי מיידי-מוקדם (CMV)), תוך שימוש בניסוח יפוזום קטיוני, שקומפלקסים עם לרעה מולקולות טעונות חומצות גרעין (טבלה 1) על פי הפרוטוקול של היצרן. בקצרה, להוסיף 500 μl של מדיום סרום מופחת (pH 7.4; טבלת 1) ו- 7.5 מיקרוגרם של כל cDNA לבנות צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות סטרילי, ואחריו 15 μl של מגיב חציצת transfection liposomal, ולערבב בעדינות לפני שעזבתי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. לתערובת זו, להוסיף 8.75 μl של מגיב transfection liposomal ולערבב בעדינות לפני שעזבתי בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. בעקבות זאת, להוסיף 3 מיליליטר של מדיום תרבות תא HEK293 (ללא אנטיביוטיקה), פיפטה את התוכן של צינור צנטריפוגות למעלה ולמטה פעמיים, transfer ירידה מבחינת על גבי תאי גידול בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים, ודגירה במשך 48 שעות על 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור). שטוף את HEK293 התאים בעדינות עם PBS סטרילי, pH 7.4, ולדלל את תאי HEK293 transfected למנות בתרבית רקמת 10 סנטימטרים חדשים, ביחסים הבאים: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 ו1:20. הדבר מבטיח כי התאים לא יהפכו ליותר מדי מחוברים. התחל בחירה של HEK293 התאים המבטאים את שני תת-יחידות GABA R על ידי הוספת 800 מיקרוגרם / מיליליטר של כל סמן בחירת אנטיביוטיקה, G418, וPhleomycin D1, עד בינוני התרבות. דגירה התאים ב 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור) ולהחליף את המדיום המכיל אנטיביוטיקה (10 מיליליטר) כל 2 ימים. כאשר מושבות הלבנות קטנות מתחילות טופס (בדרך כלל לאחר כ -7 ימים), בחר בזהירות מושבה אחת מכל אחת מהמנות ולאסוף אותו באמצעות P1000 סטריליפיפטה קצה. להעביר אותו לאחד היטב צלחת תרבית רקמת 24 גם מכילה 500 μl של מדיום ובזהירות resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה הבינוני. ודא שבדיוק אחד מושבה מועברת לתוך כל טוב (כולל של 5-20 מושבות מומלץ). דגירה התאים ב 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור) ולהחליף את המדיום המכיל אנטיביוטיקה כל 2 ימים. ברגע שהפכו למושבות 70-80% ומחוברות, בעדינות פיפטה בינוני למעלה ולמטה כדי לסלק את התאים מהחלק התחתון של צלחת תרבית רקמת 24 גם. העבר ולחלק את ההשעיה של תאים בין 2 בארות בצלחת תרבית רקמת 6 היטב. דגירה התאים ב 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור) ולהחליף את המדיום המכיל אנטיביוטיקה כל 2 ימים. ברגע ש70-80% ומחוברות, לאסוף את התאים מיום 1 של 2 בארות המכילות את התאים שמקורם מאותו המעי הגס אחתlysates חלבון y ולהכין. בקצרה, לשטוף את התאים 2x עם PBS, pH 7.4, ולהוסיף 200 μl של 2% סולפט dodecyl נתרן (SDS) ב- PBS, pH 7.4. לאסוף את lysate ולהעביר אותו לצינור microcentrifuge. למדוד את ריכוז החלבון באמצעות מגיב חלבון BCA (ראה טבלה 1) על פי הפרוטוקול של היצרן. לנתח את הביטוי של תת-יחידות α1 וβ3 של GABA קולטנים על ידי SDS / עמוד וimmunoblotting באמצעות נוגדנים למקטע ספציפי (ארנב נגד α1 ספציפיים וארנב נגד β3 ספציפיים נוגדני GABA R, ראה טבלה 1 למידע על אלה נוגדנים). לעקור ולהעביר שיבוטים רק חיוביים מהבארות שנותרות למנות בתרבית רקמת 6 סנטימטר גדולות יותר. דגירה התאים ב 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור) ולהחליף את המדיום המכיל אנטיביוטיקה כל 2 ימים. בהדרגה להרחיב את המושבות של תאי under מבחר האנטיביוטי באמצעות העביר למנות בתרבית רקמת 10 סנטימטרים וסופו של דבר לצלוחיות רקמות תרבות (T-75 צלוחיות). דגירה התאים ב 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור) ולהחליף את המדיום המכיל אנטיביוטיקה כל 2 ימים. פלייט 70,000 תאים מכל מושבה על coverslips זכוכית (13 מ"מ קוטר) ולתקן את התאים כדי לנתח את הביטוי פני תא ולוקליזציה שיתוף של תת-יחידות GABA R ידי immunofluorescence. בחר השיבוט החיובי של תאי HEK293 להביע רמות גבוהות של שני תת-יחידות α1 וβ3 של קולטני GABA, צלחת 2 x 10 6 תאים לתוך צלחת תרבית רקמה סטרילית 10 סנטימטרים ולדגור על 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified ( CO 2 באינקובטור) לילה. ודא שהתאים מודגרת הבמכיל אנטיביוטיקה (G418 וPhleomycin D1) בינוני בכל העת. למחרת, transfect HEK293 תאים עם GABA R γ2s cDNA למקטע בpcDNA ™ 3.1 (+) וקטור ביטוי שילוב גן התנגדות hygromycin B באמצעות מגיב אי שומנים liposomal transfection (טבלת 1). הערה: שיטת transfection זה מאפשרת הישרדות ויעילות ביטוי גבוהה יותר של חלבונים זרים בקווים איטיים גובר יציבים תא שנמצאים תחת בחירה רציפה עם אנטיביוטיקה טובות יותר. בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר סטרילי, להוסיף 250 μl של Enhancer וחיץ עיבוי DNA (טבלת 1) ו- 1.4 מיקרוגרם של GABA γ2s cDNA מקטע הקולטן. להוסיף 11.2 μl של Enhancer מערבולת של 1 שניות לפני שעזבתם בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. להוסיף 35 μl של מגיב transfection שומנים שאינם liposomal מערבולת של 10 שניות לפני היציאה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. הוסף 3 מיליליטר של מדיום G418 / Phleomycin D1 המכיל ו פיפטה התוכן של צינור צנטריפוגות למעלה ולמטה פעמיים befבצר העברתו טיפה חכמה על גבי תאי גידול בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. דגירה התאים במשך 48 שעות על 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור). לשטוף את התאים בעדינות עם PBS סטרילי ולדלל אותם למאכלי תרבית רקמת 10 סנטימטרים חדשים, ביחסים הבאים: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 ו1:20. התחילו בחירה של α1 תאים /-β3 HEK293 מבטאים את מקטע γ2s על ידי הוספת 800 מיקרוגרם / מיליליטר של סמן בחירת האנטיביוטיקה hygromycin B לG418 / Phleomycin D1 המכיל בינוני. החלף את המדיום הישן עם G418 הטרי / D1 הבינוני Phleomycin / hygromycin B המכיל (10 מיליליטר) כל 2 ימים. חזור על שלבים 2.7-2.12, תחת בחירה רציפה בG418 / Phleomycin D1 / hygromycin B המכיל מדיום תרבית תאים. אחסן את השיבוטים החיוביים ב-140 מעלות צלזיוס במדיום תרבות תא ללא אנטיביוטיקה ו -10% sulfoxide דימתיל (DMSO) לשימוש העתידי. בדוק את הרמהביטוי של α1, β3 וγ2s יחידות משנה GABA R על ידי immunoblotting וimmunofluorescence בכל שיבוט הבא הפשרה, כי הביטוי יכול להשתנות עקב הישרדות מופחתת של תאים תחת בחירה אנטיביוטיות. 3. תחזוקה של שורות תאי HEK293 להפשיר בקבוקון של שליטת HEK293 תאים או RS אלה מבטאים גם α1 / β2 / γ2-GABA (הטבלה 1) או α1 / γ2-GABA Rs β3 / (כמתואר לעיל) לתוך 10 מיליליטר של מדיום תרבות תא 15 מיליליטר סטרילי צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה ב 440 XG למשך 5 דקות כדי להסיר DMSO העודף. הסרת תאי supernatant וגלול ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות תא טרי. להוסיף ראשון 9 מיליליטר של מדיום תרבות תא טרי לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים מצופים בפולי-D ליזין (0.1 מ"ג / מיליליטר) ולאחר מכן 1 מיליליטר של תאי resuspended. להתסיס בעדינות, מצד לצד, כדי לפזר את התאים ולדגור על 37 מעלות С בhumidifiedאווירת 5% CO 2 (CO 2 באינקובטור). למחרת, לשאוב את המדיום כדי להסיר כל פסולת תא ולהחליף עם 10 מיליליטר של מדיום תרבות תא הטרי HEK293. בחר שורות תאי יציבות באנטיביוטיקה כדי להסיר את כל תאים שאינם מבטאים יחידות משנה GABA R ולכן גם חוסר הביטוי של סמני עמידות לאנטיביוטיקה. עבור הקו / β2 / γ2 תאי יציבות α1, להחליף בינוני רגיל עם מדיום תרבות תא טרי המכיל G418 (800 מיקרוגרם / מיליליטר). עבור קו α1 / β3 / התא γ2, להחליף עם מדיום תרבות תא טרי המכיל G418 (800 מיקרוגרם / מיליליטר), Phleomycin D1 (800 מיקרוגרם / מיליליטר) וhygromycin B (800 מיקרוגרם / מיליליטר). זהירות! G418 הוא גירוי ו Hygromycin B הוא מאכל, רעיל ומגרים. מעבר התאים לתוך צלחת תרבית רקמה חדשה על ידי זריעה בצפיפות נמוכה יותר ברגע שהם להשיג confluency> 70%. לשאוב 10 מיליליטר של מדיום תרבות תא ולשטוף פעמיים לזמן קצר עםPBS, pH 7.4. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת טריפסין-EDTA, פתרון של טריפסין פרוטאז (טריפסין 0.05%) וEDTA Ca 2 + chelator (0.02%) ב- PBS, pH 7.4, לנתק את התאים מהצלחת. זהירות! טריפסין-EDTA פתרון הוא מטרד. להוסיף 10 מיליליטר של מדיום תרבות תא המכיל את האנטיביוטיקה הנכונה, למנה ולשאוב את התאים. צנטריפוגה התאים ב 440 XG למשך 5 דקות וresuspend אותם ב 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא. מעבר התאים באמצעות דילול 1:10 לתוך בקבוק חדש תרבית רקמה (בקבוק T-75) המכיל תרבית תאים בינונית טריות ואנטיביוטיקה הנכונה. דגירה התאים ב 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור) ולהחליף את המדיום כל יומיים. מעבר התאים כאשר מחוברות> 70% (ראה שלב 2.8). 4. הכנת GABAergic בינונית קוצנית Neuron התרבות בתנאים סטריליים להכין 24צלחת ll עם poly-L- ליזין (0.1 מ"ג / מיליליטר) -coated coverslips (13 מ"מ קוטר) ולדגור על 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור). למחרת, לשאוב עם טפטפת poly-L- ליזין העודף ולשטוף coverslips עם שתי קצרות 10 שניות ושתי שטיפות באורך 5 דקות עם מים סטריליים. להוסיף laminin (0.01 מ"ג / מיליליטר) לילה ולדגור על 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור). לטהר את האזור לנתיחה עם אתנול 70% ולאסוף מגוון של כלים לנתח כגון מלקחיים רקמות מעוקלות וישרות, מספריים ופינצטה, ומקום לתוך אתנול 70% לעקר באופן מלא את המכשירים לנתח. מניחים את החולדה / העכבר בהריון מורדמים עם CO 2 על הגב שלה ולנקות את העור בבטן שלה עם 70% אתנול. לצבוט את העור עם פינצטה ולחתוך סביב הבטן דרך העור, השרירים וצפק, כדי לחשוף את האיברים ורחם הפנימייםעם עוברים באופן ברור. חלץ את העוברים (E16-17) מהרחם ומניח אותם בצלחת פטרי עם PBS המקורר. מניחים את העוברים בזרימה למינרית ולערוף את ראשם, איסוף הראשים בצלחת פטרי חדשה עם HBSS המצונן. תחת מיקרוסקופ לנתח, לנתח את המוח באמצעות המלקחיים המעוקלים וישרים. הנח את המוח לתוך צלחת פטרי המכילה HBSS חדש המקורר. להפריד בין שתי אונות המוח ולהסיר בזהירות את קרומי המוח. לחתוך לאורך הקו של ההיפוקמפוס ולקלף את הקליפה כדי לחשוף את סטריאטום. שים לב לסטריאטום כמבנה לבן מפוספס בקדמי של האונה. לנתח סטריאטום ולחתוך אותו לחתיכות קטנות מאוד (1 – 2 מ"מ בקוטר) ולהשתמש פיפטה פסטר אש המלוטשת כדי לאסוף את החומר לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מיליליטר עם נפח כולל של 1 מיליליטר. אש ליטוש מבטיח החומר שנאסף מבלי להיות פגום. באמצעות ti האש המלוטשתp של פיפטה פסטר, לשאוב את התאים ולשחרר אותם 8-10 פעמים. לוקח פיפטה חדשה עם קצה אש-הפולנית של כ -30% מהקוטר המקורי (1 מ"מ), triturate פתרון נוספת 4 – 6 פעמים עד להופעתה הומוגנית. סנן את התאים באמצעות מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי טרי. ספירת התאים עם hemocytometer וצלחת 70,000 תאים לתוך 500 μl של מדיום התרבות העצבי בכל טוב בצלחת תרבית רקמת 24 גם. להתסיס את בארות שמאל לימין ולדגור על 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור) במשך 14 ימים במבחנה (DIV). לאחר 7 ימים, לבדוק את טוהר של תרבויות עצביות ו, אם תאי גליה נמצאים, להוסיף β-D-arabinoside ציטוזין (Ara-C; 5 מיקרומטר) לבארות כדי לעצור את התפשטותם. כדי לעשות זאת, להסיר 250 μl של מדיום תרבות העצבי (pH 7.4) מכל טוב ולהוסיף 250 μl של מדיום טרי מכילהing ערה-C. זהירות! ערה-C הוא מטרד. 5. עמית תרבות הכנה ביום 11 לתרבות העצבית, מעיל צלחת 6-היטב עם poly-D- ליזין (0.1 מ"ג / מיליליטר) בתנאים סטריליים ודגירת לילה בשעה 37 ° С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור). למחרת (היום 12 של תרבות העצבית), לשאוב poly-D- ליזין העודף ולשטוף בארות 2x בקצרה ו2x עבור 5 דקות עם מים סטריליים לפני הוספת תרבית תאים בינוניים טריות (ללא אנטיביוטיקה) למעייל הבארות עם כמות קטנה סרום מהמדיום. לשאוב את מדיום התרבות מהבקבוק תרבית רקמה (T-75). יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS לפני הוספת 1 ​​מיליליטר של Ca 2 + / Mg 2 + סוכן -chelating EDTA (0.48 מ"מ) אשר בעדינות ולא אנזימים dissociates תאים. להתסיס את התאים לנתק אותם מהחלק התחתון של בקבוק הרקמה. להוסיף 10 מיליליטר של מדיום תרבות תא (ללא אנטיביוטיקה מכיוון שהדבר עלולה להפריע לtransfection), לשאוב את התאים ומקום בצינור צנטריפוגות סטרילי. גלולה תאים ב 440 XG למשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגות ספסל עליונה במהירות נמוכה. הסר את supernatant ו resuspend התאים ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות תא טרי. באמצעות hemocytometer, לספור את התאים וצלחת בצפיפות של 3 x 10 5 תאים לכל גם בצלחת 6-היטב. להתסיס בעדינות דגירה במשך 24 שעות על 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור). למחרת (היום 13 של תרבות העצבית) זמני transfect HEK293 תאים עם mCherry cDNA במבנה ביטוי pcDNA3 באמצעות מגיב transfection liposomal. בקצרה, בצינור microcentrifuge סטרילי, להוסיף 500 μl של מדיום סרום מופחת ו5 מיקרוגרם של mCherry cDNA. הוסף 5 μl של מגיב חציצת liposomal ולערבב בעדינות לפני שעזבתי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. להוסיף 8.75 μl של reag transfection liposomalאף אוזן גרון ולערבב בעדינות לפני שעזב בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. פיפטה את התוכן של צינור microcentrifuge למעלה ולמטה פעמיים, ירידה מבחינת העברה היטב כל אחד בצלחת תרבית רקמת 6 היטב ולדגור על 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור). למחרת (היום 14 של תרבות העצבית), לשאוב את מדיום תרבות תא HEK293 מכל אחד 6 הבארות ולשטוף כל בקצרה גם פעמיים עם PBS (pH 7.4). להוסיף 300 μl של Ca 2 + / Mg 2 + סוכן -chelating EDTA (0.48 מ"מ) ו -200 μl של טריפסין EDTA (0.02-0.48 מ"מ) פתרון לכל טוב ולדגור על 37 מעלות С למשך 5 דקות. הוסף 1 מיליליטר של מדיום תרבות תא הטרי HEK293 בכל טוב (זה מרווה את טריפסין) ולשאוב את התאים מנותקים לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 440 XG למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולהסיר את supernatant. Resuspend גלולה ב 500 μl של מדיום העצבי תרבות (pH 7.4). </ Li> באמצעות hemocytometer, לספור את תאי זרע בצפיפות של 30,000 תאים לכל גם בצלחת תרבית רקמת 24 גם מכילה תאי עצב. להתסיס את הצלחת לפזר את תאי דגירה שיתוף תרבויות על 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור) למשך 24 שעות. 6. ניתוח של קשרים סינפטיים ופעילותם אחרי 23 שעות בשיתוף התרבות, לחקור את היווצרותם של קשרים "פעילים" בין הנוירונים קוצניים בינוני GABAergic וHEK293 תאים באמצעות ספיגה תלויה-פעילות של הנוגדן ספציפי לתחום luminal אנטי-synaptotagmin מצומדות עם צבע פלואורסצנטי (Cy5, ראה טבלה 1) . הערה: הנוגדן רק לקבל גישה לתחום luminal של synaptotagmin, אליו הוא נקשר כאשר יש המשכיות בין לומן שלפוחית ​​הסינפטית ומרחב החוץ תאי. זה במיוחד מתרחש במהלך שחרור הנוירוטרנסמיטר, מה שהופך את antib זהody סמן מצוין של מסופי presynaptic הפעילים. ראשית לשטוף את שיתוף תרבויות עם מדיום עצבי (Neurobasal בינוני, pH 7.4; ראה טבלת 1) ולהוסיף נוגדן עכבר שכותרתו Cy5 אנטי-synaptotagmin, בדילול מלא 01:50 במדיום עצבי (Neurobasal בינוני, pH 7.4), ל תרבויות, למשך 30 דקות. דגירה התאים בתקופה זו על 37 מעלות С באווירת 5% CO 2 humidified (CO 2 באינקובטור). כדי להסיר את הגישה של הנוגדן, לשטוף את שיתוף התרבויות בקצרה שלוש פעמים: ראשון עם PBS הקר רגיל (pH 7.4), שני עם PBS הקר (pH 7.4) המכיל 200 מ"מ NaCl, ושלישית עם PBS הנורמלי הקר (pH 7.4) תקן את התאים עם 300 μl של 4% סוכרוז paraformaldehyde / 4% PBS (PFA, pH 7.4) במשך 10 דקות עם תסיסה. שוטף את התאים בקצרה פעמיים עם PBS (pH 7.4) ולאחר מכן עם שתי שטיפות 10 דקות ארוכות. להוסיף גליצין (0.3 מ ') זה טוב במשך 10 דקות עם תסיסה כדי להרוות PFA. שוטף את התאים briefly פעמיים עם PBS (pH 7.4) ולאחר מכן עם שתי שטיפות 10 דקות עוד לפני הוספת 300 μl של פתרון חסימה (1% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ב- PBS, pH 7.4) כדי להפחית את הלא ספציפי המחייב של נוגדנים. לשאוב את פתרון החסימה ולהוסיף פן ניסיונות נוגדן אנטי GABA R-γ2 המכוון נגד γ2 N- מסוף תחום 33 (1: 3,000 ב- PBS, pH 7.4) הלילה ב 4 ° С. למחרת, לשאוב את הנוגדן הראשוני מהבארות ולשטוף את התאים בקצרה פעמיים עם PBS ולאחר מכן עם שתי שטיפות 10 דקות ארוכות. Permeabilize התאים באמצעות טריטון X-100 (0.1%) בחסימת פתרון במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. שוטף את התאים בקצרה פעמיים עם PBS (pH 7.4) ולאחר מכן עם שתי שטיפות 10 דקות עוד לפני הוספה או decarboxylase החומצה גלוטמית אנטי-העכבר (GAD) 65 נוגדן (1: 4,000, טבלת 1) או שאני עכבר אנטי synapsin הנוגדן ( 1: 1,000, טבלת 1) 120 דקות ב t החדרemperature. שוטף את התאים בקצרה פעמיים עם PBS (pH 7.4) ולאחר מכן עם עוד שתי 10 שטיפות דקות ולאחר מכן להוסיף פתרון חסימה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. צנטריפוגה הנוגדנים משני המתאימים (בדרך כלל תיש IgG אנטי-פן הניסיונות מצומדת לCy5, עז אנטי העכבר IgG מצומדת לאלקסה פלואוריד 488 או עז אנטי עכבר IgG אלקסה פלואוריד 405, בבת 2 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי להסיר אגרגטים של נוגדנים ב 21,910 XG במשך 10 דקות, ולהוסיף נוגדנים (1: 750) לפתרון חסימה. החל לנכס בארות עבור שעה 1 ומכסים בנייר אלומיניום כדי להגן fluorophores מהחשיפה לאור וכתוצאה מכך photobleaching. לבסוף, לשטוף את התאים בקצרה פעמיים עם PBS (pH 7.4) ולאחר מכן עם עוד שתי 10 שטיפות דקות כדי להסיר כל נוגדנים משני מאוגד והר coverslips באמצעות מגיב הרכבה (להאריך זהב, טבלת 1) כ -10 μl לכל coverslip. הרשה שעה 24 להגדיר בטמפרטורת חדר תוך מוגן מפני אור לפני העברה ל4° С עבור אחסון לטווח ארוך. ניתוח דגימות באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר עם מטרת נפט טבילה 63X. להבטיח רמות האור ורווח גלאי מותאם כדי למנוע הרוויה. שים לב אנשי קשר כמו סינפסה-פוטנציאליים כאזורים של לוקליזציה שיתוף בין מסופי presynaptic החיוביים לGAD65, synapsin אנטי-synaptotagmin אני או Cy5 שכותרתו וHEK293 תאי הפוסט-סינפטי דמיינו ידי דסק"ש או על ידי indictor ניאון mCherry. Count אנשי קשר כמו סינפסה-פוטנציאל סדרת Z-ערימת חלקים אופטיים (8 – 10), תוך שימוש בעומק של 4 – 5 מיקרומטר לכל תא באמצעות תוכנת ההדמיה.

Representative Results

הפרוטוקול עבור מערכת מודל שיתוף תרבות תאי נוירון HEK293 זה כבר מכוון היטב כדי לאפשר את הישרדות תא אופטימלית. במערכת זו, היווצרות של אנשי קשר כמו סינפסה-וניתוחם מסתמך על ביטוי יציב ועקבי של כל שלוש יחידות משנה GABA R שיותכו קולט פונקציונלי. לכן חשוב להשתמש בניתוח immunocytochemical למבחן לביטוי למקטע על פני השטח של תא HEK293 לפני הוספתן לתרבויות עצביות. בניסויים אלה, ביטוי פני תא של α1, β2 ותת-יחידות γ2 (איור 1 א), או α1, β3 וγ2 יחידות משנה (איור 1), זוהה באמצעות נוגדנים למקטע ספציפי שנקשרים לאפיטופים תאיים של תת-יחידות אלה. רמה גבוהה של שיתוף לוקליזציה בין תת-יחידות אלה על פני השטח HEK293 הודגמה. לאחר אישור הביטוי על פני השטח ושיתוף הלוקליזציה של GABAתת-יחידות R בתאים, שיתוף תרבויות HEK293 הוכנו באמצעות HEK293 תאים לבטא יחידות משנה α1 / β2 / γ2 GABA R ונוירונים קוצניים בינוני בתרבית למשך 14 ימים (14 ימים במבחנה (DIV)). תאים בשיתוף התרבות הודגרו למשך 24 שעות, קבועים ונותחו באמצעות immunocytochemistry ומיקרוסקופיה confocal. ניתוח של קשר ציין כי מסופי האקסון GAD65 חיובי GABAergic נוצרו רק אנשי קשר סדירים עם שליטת HEK293 התאים (איור 2 א, 2 ב). מספר אנשי הקשר שזוהו בשעה 4 שעות היה 7.3 ± 0.9 לכל תא HEK293, ומספר זה ירד לרמה של 5.5 ± 0.5 חיבורים (ממוצע ± SEM) לכל תא HEK293 ב 24 שעות לאחר הוספת תאי HEK293 לנוירונים בתרבית. בניגוד לכך, מסופי האקסון GABAergic GAD65 החיוביים נוצרו קשר כמו סינפסה-רב עם HEK293 תאים המבטאים Rs GABA. מספר אנשי הקשר שהושג ב 4 שעות לאחר הוספת תאי HEK293 היה 28.3 ± 4.7 לכל תא HEK293, ומספר זה היה עלייה נוספתד ל52.1 ± 6.3 (ממוצע ± SEM) לכל תא HEK293 ב 24 שעות בשיתוף התרבות (איור 2A, 2B). כדי לקבוע אם מגעים הללו כמו סינפסה-היו 'פעילים', כלומר נתמך לשחרר משדר לפוחי, נוגדן Cy5 מצומדות- אנטי-synaptotagmin תחום ספציפי שלפוחית-luminal התווסף למדיום התרבות המשותפת לאחר 23 שעות של דגירה. נוגדן זה משולב רק למסוף עצב presynaptic כאשר צורות נקבוביות בין לומן שלפוחית ​​הסינפטית ונוזל החוץ תאי במרווח הסינפטי בשחרור הנוירוטרנסמיטר. לאחר שחרור, הנקבובית נסגר, עוזב את synaptotagmin נוגדן פלואורסצנטי Cy5 מצומדות- מצורף לsynaptotagmin בתוך השלפוחית. בדרך זו, רק שלפוחית ​​מעורבת באופן פעיל בשחרור הנוירוטרנסמיטר מסומנים עם הנוגדן. בניסויים אלה כמה אם אנשי קשר או אי התאמה בין השליטה HEK293 תאים ומסופי נוירון הקוצני הבינוני היו 'פעיל & #8217; כפי שמוצג על ידי חוסר שיתוף הלוקליזציה בין GAD65 / הקרינה סינפטי synaptotagmin וקרינת mCherry בHEK293 תאים (איור 3 א). בניגוד לכך, אנשי קשר "פעילים" רבים נוצרו בין המסופים בינוני נוירון הקוצני וα1 / β2 / γ2 להביע תאי HEK293, כפי שנחשף ברמה גבוהה של שיתוף לוקליזציה בין GAD65 / synaptotagmin וmCherry, הביע באופן ספציפי בתאי HEK293 ( איור 3 ב). α1 כדי לבדוק אם תת-סוג של GABA R שונה גם יכול לקדם היווצרות כמו סינפסה-במבחנה, יש לנו שיתוף תרבותי / β3 / γ2 לבטא בתאי HEK293 עם הנוירונים קוצניים בינוניים. שוב, HEK293 תאי שליטה לעתים רחוקות קיבלו קשר עם מסופי presynaptic synapsin חיובי לכת 10.8 ± 0.48 (ממוצע ± SEM) אנשי קשר לכל תא HEK293 לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות (משמאל איור 4 א, ​​4 ב). עם זאת, תאי HEK293 להביעα1 / β3 / γ2 צורת GABA Rs יותר באופן משמעותי אנשי קשר כמו סינפסה-עם מסופי synapsin החיובי presynaptic של נוירונים הקוצניים בינוני לכת 25.3 ± 0.27 אנשי קשר (ממוצע ± SEM) לכל תא HEK293 לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות (מימין איור 4 א, 4 ב). זה מצביע על כך α1 / β3 / γ2 GABA Rs לידי ביטוי בתאי HEK293 גם יכול לקדם היווצרות קשר הסינפטי, אם כי העוצמה שלהם היא נמוכה יותר מהעצמה של α1 / β2 / RS GABA המכילים γ2. ניסויים אלה מצביעים על כך שמערכת מודל שיתוף התרבות שפותחה במעבדה שלנו מאפשרת ניתוח כמותי של קשר היווצרות הסינפטי במבחנה, כמו גם הערכה של יעילותן של תת-סוגים שונים של RS GABA בתהליך זה. ניסויים אלה מראים עוד כי GABA R, בנוסף להיותו רכיבים פונקציונליים קריטיים של סינפסות GABAergic, עשוי לשחק תפקיד מפתחבתהליך של הכרה ויצירת קשרים סינפטיים בין נוירונים מעכבים ותאי המטרה עצביים המתאימים, באופן עצמאי של חלבוני הדבקה הסינפטי אחרים. איור 1. Immunocytochemical ניתוח ביטוי של α1 GABA R / β2 / γ2 או α1 / β3 / γ2 בשורות תאי HEK293 יציבים. נוגדנים הכרה בתחומים תאיים של תת-יחידות GABA R שמשו לקולטנים תווית הביעו על פני התא. ( ) Α1 להביע שורת תאי HEK293 (אלקסה פלואוריד 488), β2 (אלקסה פלואוריד 555) וγ2 (Cy5) ברמות גבוהות. (Α1 שורת תאי B) HEK293 להביע (אלקסה פלואוריד 488), β2 (אלקסה פלואוריד 555) וγ2 (Cy5)תת-יחידות ברמות גבוהות. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. נוירונים קוצניים בינוני איור 2. GABAergic יצירת קשרים כמו סינפסה-עם α1 / β2 / γ2- לבטא בתאי HEK293 בשיתוף התרבות. (א) תיוג של פלורסנט מסופי presynaptic עם אנטי GAD65 נוגדנים (בירוק) וHEK293 תאים עם mCherry (באדום, משמאל) γ2 מקטע או GABA R (בכחול, מימין), חשפו נקודות של לוקליזציה שיתוף בין אלה סמנים המצביעים על היווצרותו של קשר כמו סינפסה-אחרי 4 או 24 שעות בשיתוף התרבות. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר (ב) ניתוח כמותי של שיתוף כמו סינפסה- ntacts. HEK293 תאים זוהו על פי צורתם כפי שנחשפו על ידי הדמיה דסק"ש ו / או ביטוי mCherry, ומספר אנשי הקשר בין GAD-65 puncta החיובית (בירוק) ואת פני השטח של תאי HEK293 נספר על ידי העין בכל חלק אופטי של סדרת Z-מחסנית (8 – 10) לכל תא באמצעות תוכנת ההדמיה, ומתבטאות במספר אנשי קשר / תא. הגרף מציג את מספר אנשי הקשר בין הנוירונים בינוניים קוצניים ושליטה HEK293 תאים (אפור בהיר) או α1 / תאים / γ2-HEK293 β2 (שחור) לאחר 4 ו 24 שעות בשיתוף התרבות (ממוצע ± SEM, n = 8 בכל אחד מצב משני ניסויים בלתי תלויים). נתון זה שונה מפוקס ואח '. (2013) 30. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. מודעה / 52,115 / "width =" 52115fig3highres.jpg 600 "/> Rs 3. GABA איור לקדם היווצרות של אנשי קשר פעילים הסינפטי. Immunolabeling של אנשי קשר כמו סינפסה-נוצרו לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות בין מסופי הנוירון קוצניים הבינוני חיוביים לGAD65 (אלקסה פלואוריד 405 ציאן) ו- (א) בתאים HEK293 שליטה, או / Β2 / γ2 HEK293 תאים-α1 (B), שניהם זמניים transfected עם mCherry לבנות (אדום). אנשי קשר פעילים מזוהים על ידי שיתוף לוקליזציה בין הנוגדן לומינל שלפוחית ​​תחום ספציפי נגד synaptotagmin (Cy5) ונוגדן GAD65 הספציפי הן במסופי presynaptic, וmCherry לידי ביטוי בתאי HEK293. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. igure 4 "FO: = תוכן רוחב" "src =" 6in / קבצים / ftp_upload / 52,115 / "width =" 52115fig4highres.jpg 600 "/> נוירונים קוצניים בינוני איור 4. GABAergic יצירת קשרים כמו סינפסה-עם α1 / β3 / מקטע γ2- להביע HEK293 תאים בשיתוף התרבות. תיוג פלורסנט של מסופי presynaptic עם אנטי synapsin אני נוגדנים (בירוק), ושליטה HEK293 תאים (משמאל), או α1 () / β3 / γ2 לבטא בתאי HEK293, שני transfected הזמני עם mCherry (באדום), חשף נקודות לוקליזציה שיתוף בין סמנים אלה מעידים על היווצרות קשר כמו סינפסה-לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר (B). ניתוח כמותי של אנשי קשר כמו סינפסה. HEK293 תאים זוהו על ידי ביטוי mCherry, ומספר אנשי הקשר בין synapsin אני חיובי puncta (בירוק) ואת פני השטח של תאי HEK293 נספר על ידי העין בכל חלק אופטי של סדרת Z-מחסנית (8-10) לכל תא באמצעות תוכנת הדמיה, ומתבטא במספר אנשי קשר / תא. הגרף מציג את מספר אנשי הקשר בין הנוירונים בינוניים קוצניים ושליטה HEK293 תאים (אפור בהיר) או α1 / תאים / γ2-HEK293 β3 (שחור) לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות (ממוצע ± SEM, n = 8-12 תאים ב כל מצב, משני ניסויים בלתי תלויים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

למרות שפרוטוקול זה הוא לא קשה מבחינה טכנית לבצע, יש כמה שלבים קריטיים שיש אחריו כדי להשיג את מבחני שיתוף התרבות לשחזור מדויקים ביותר. ראשית, הנוירונים קוצניים בינוני תרבותיים חייבים להיות נזרעו בצפיפות אופטימלית. אם נזרע בדלילות מדי, תאי עצב נוטים לפתח לאט לאט ובהישרדות מופחתת במידה ניכרת. מצד השני, אם זורעים בצפיפות רבה מדי, תאי עצב נוטים לצבור אשר פוגע בניתוח של קשרים עם תאי HEK293. שנית, מומלץ להביע כתב ניאון, GFP או mCherry בHEK293 תאים ביציבות להביע Rs GABA, לפני platting אותם לתרבות המשותפת זמני. זה מאפשר זיהוי אמין של HEK293 תאים, אשר יכולים להיות בסכנה על ידי דמיון בצורה ובגודל בין תאים אלה ותא גליה שרד נדיר בתרבויות עצביות. כדי להשיג transfection יעיל עם GFP או mCherry cDNA, שורות תאי HEK293 צריכים להיות בשלב הצמיחה מעריכית וזורעים בצפיפות המתאימה ב6-גם צלחות. זריעה דלילה ואחרי transfection תגרום לתאים לגדול בצורה גרועה, ואילו ימנע התאים על פני זריעה מתופס cDNA. באופן אידיאלי, צריכים להיות נזרעו תאים, כך שהם בין 70 – ומחוברות 90% ביום transfection. שלישית, transfection חייב להיות מותאם לשורת תאים כל שימוש, כמו כמה שורות תאים רגישות יותר מהאחרים. סיבה לכך הוא GABA המכונן ביטוי R בHEK293 תאים מפחית הישרדות תא ואת יכולתם של תאים להתאושש לאחר transfection. יתר על כן, הישרדות תלויה בסוג של RS GABA לידי ביטוי בתאי HEK293, עם כמה שורות תאים להיות משמעותית יותר רגישות יותר מהאחרים. Transfection באמצעות מגיב liposomal הוא שיטה אופטימלית לביטוי חלבונים זרים בשורות תאים גדלו במהירות, לספק הן יעילות transfection הגבוהה ורמת ביטוי. עם זאת, מגיב זה גורם יותר מדי נזק לשורות תאים גדלו לאט, לבו אנו משתמשים מגיב transfection אינו liposomal באופן קבוע. זה עובד בצורה דומה למגיב liposomal אבל כמות ה- DNA דרושה לtransfection יעיל מצטמצמת משמעותית. זה מאפשר הישרדות תא גדולה יותר (בערך 80-90% בהשוואה ל -60% באמצעות מגיב liposomal) אבל עם יעילות נמוכה transfection (60%). לבסוף, מספר HEK293 שליטה או α1 / β2 / γ2 HEK293 לבטא בתאים הוסיפו לתרבויות עצביות צריכה להיות מותאם. הוספה מעט מדי תאים פוגעת בניתוח המוצלח של מגעים בין תאי HEK293 ותאי עצב, כי הם הופכים להיות מאוד נדירים. לעומת זאת, הוספת תאי HEK293 רבים מדי גורמת למוות של תאים עצביים בתוך כמה שעות.

אידיאלי צריכים להיות מוכנות תרבויות נוירון הקוצני הבינוני עובריים באמצעות רקמת striatal גזור מגיל עוברי 15 – 17. עם זאת, זה קורה לעתים קרובות כי הם עוברים מעט צעירים או מבוגרים מהגיל האופטימלי. במקרה זה, את מספר תאי העצב שנזרע בתרבות תהיהצריך להיות מגוון. רקמה שהיא צעיר מן E15 ייתכן שתהיה הצורך נזרעה בצפיפות נמוכה במקצת, תוך רקמה שהיא מבוגר יותר מE17 ייתכן שיהיה הצורך נזרע בצפיפות גבוהה יותר, כדי לאפשר להישרדות תא אופטימלית. יתר על כן, arabinoside ציטוזין (Ara-C) ייתכן שיהיה הצורך להוסיף לתרבויות ישנות יותר כדי למנוע צמיחה של גליה, שהוא יותר בשפע ברקמה בוגרת.

בעת יצירת שיתוף תרבויות, חשוב לצלחת המספר מותאם של HEK293 transfected או α1 / תאים לבטא β2 / γ2 HEK293, כאמור לעיל. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך כדי לקבוע את זה לכל שורת תא בודדת, בגלל הבדלים בהישרדות שלהם. בדרך כלל 30,000 תאים בנפח מרבי של 50 μl יש להוסיף גם כל צלחת 24 גם, שכבר מכילה 500 μl של מדיום תרבות העצבי, כמו זו מבטיחה כי המדיום העצבי המותנה אינו מדוללת יותר מדי וכי התנאים בתוך כל טוב נשאר קבוע למדי, למשל </em> הריכוז של גורמי גדילה. הוספת כמויות גדולות יותר מ -50 μl היטב כל אחד היה בדרך כלל להרוג תאי העצב.

אחד החסרונות העיקריים של שיטת שיתוף התרבות הוא שהתרבויות עצביות נוצרות מהתאים ניתק גדלו כמו monolayer, מה שאומר שהנוירונים הוסרו ממייקרו-הסביבה הרגילה שלהם ואינם מסוגלים להקים את הארגון אנטומי הרגיל שלהם. לכן הם חסרים את הקשרים המתאימים, תשומות ומולקולות מופרשות מהתאים אחרים שעשויים להשפיע על השלבים הראשונים של התפתחות סינפסה. לדוגמא, בvivo נוירונים קוצניים בינוניים מעוצבבים בצפיפות על ידי תשומות glutamatergic מהקליפה, התלמוס ואזורים אחרים במוח 34, לעומת זאת, בתרבויות העצבית שלנו סינפסות glutamatergic לא יוצרות כי תשומות אלה שניזוקו במהלך הנתיחה של רקמת striatal. איך ההיעדרות של סינפסות glutamatergic פונקציונליות בתאי עצב קוצניים בינוניים תרבותיים AFFects היכולת שלהם ליצור סינפסות GABAergic אחד עם השני ו / או HEK293 תאים המבטא GABA Rs נותרת פתוחה. ניתן לטפל בשאלה זו בקלות על ידי נוירונים culturing הקוצניים בינוניים יחד עם נוירונים בקליפת המוח ומאפשרים כך glutamatergic כדי ליצור סינפסות תפקודית 35 לפני התוספת של תאי HEK293. גישה חלופית תהיה לתכנן מערכת מודל שיתוף תרבות המבוססת על תרבויות פרוסה organotypic, אשר לשמור על חלק מcytoarchitecture שעשויה להיות חשוב להתבגרות והיווצרות הסינפסה. עם זאת, יש לי תרבויות הפרוסה organotypic neuropil צפופה והטרוגנית שיכול לסכן את הניתוח שבוצע כאן. חסרון נוסף חשוב של שימוש במבחני התרבות משותפת הוא שGABA Rs הביע על פני השטח של תאי HEK293 לא התקבצו כפי שהם נמצאים בתאי עצב, אם כי נראה שלא יהיה צורך להיווצרות הסינפסה נתנה ביטוי על פני השטח גבוה מספיק 30. לדוגמא, בrמוח אודנט ובתרבויות בהיפוקמפוס, מקטע GABA R α1 נמצא במרבית הסינפסות GABAergic בכל תחומי הפוסט-סינפטי של תאים פירמידליים. עם זאת, α2 ממוקם במיוחד בתת-קבוצה של סינפסות בsomata ודנדריטים אך מועשר במגזר הראשוני האקסון, כפי שנחשפו על ידי immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים 36. בהתחשב בעובדה שהיווצרות הסינפסה בשיתוף התרבויות עדיין יכולה להיות מזוהה באופן מהימן וניתח 30, זה מצביע על כך שהצפיפות של RS GABA על פני התא של תאי HEK293 עשויה להיות דומה ל, או אפילו גבוהה יותר מהצפיפות של קולטנים אלה בתוך הסינפטי אשכולות בתאי עצב. זה יכול להסביר, לפחות חלקית, מדוע חלבונים סינפטיים הידבקות, כגון neuroligin, וחלבוני צפיפות פוסט-סינפטי, כגון gephyrin, אינם נחוצים להיווצרות הסינפסה בשיתוף התרבויות, אם Rs GABA התאסף כראוי נמצאים במספיק צפיפות.

זה מתועד היטב שרופי GABA הן מבחינה מבנית ותפקודי הטרוגנית, ושהרכב מקטע הקולטן קובע לוקליזציה subcellular ותכונות פרמקולוגיות. לדוגמא, שילוב של 2 יחידות משנה ידוע כתנאי מוקדם ללוקליזציה סינפטיים של RS GABA תוך המקטע הוא כמעט אך ורק בהווה בRs GABA extrasynaptic. קולטנים המשלבים רק αβ שילובים הם חשבו גם להיות מקומיים בעיקר לתחומי extrasynaptic 12- 14. בין אם ספציפי הזה נשמר במערכת התרבות המשותפת שלנו, ניתן לבדוק בקלות על ידי זמני transfecting 2 או למקטע cDNAs לשורות תאי יציבות להביע HEK293 תת-יחידות α וβ, לפני שמוסיף אותם לתרבויות עצביות. הניסויים הראשוניים שלנו באמצעות גישה זו הראו כי קשרים סינפטיים נוצרים בקלות ורק בנוכחות של למקטע 2, המציין כי הספציפיficity נצפה in vivo עשוי להישמר במבחנה (מידע לא מוצג).

יתר על כן, Rs GABA שילוב תת-יחידות α שונות באופן סלקטיבי מקומי לקשרים סינפטיים נוצרו עם סוגים ספציפיים של תאי עצב presynaptic. לדוגמא, בpallidus גלובוס, Rs α1-GABA נמצאים בדרך כלל בstriatopallidal (STR-GP) וסינפסות palliopallidal (GP-GP), אשר ממוקמות על דנדריטים ואזורים גופניים של נוירונים הקוצניים בינוניים, בהתאמה. Rs α3-GABA נמצא באזורי perisomatic של נוירונים קוצניים בינוניים והם פנו בביטחונות האקסון GP מקומיים, תוך Rs α2-GABA נמצאים על דנדריטים הדיסטלי של הנוירונים האלה ויצרו קשר עם בעיקר על ידי תשומות מסטריאטום 32. ביטוי של תת-יחידות α ספציפיות בסוגים שונים של סינפסות ובתאים עצביים שונים הודגם גם באזורים אחרים במוח כגון hippocampus 21 ו18,20 הניאוקורטקס. ממצאים אלה מעלים את השאלה כיצד סינפסות המעכבות הספציפיות נוצרות במוח. האם ההידבקות של סוג מסוים של מסוף presynaptic לגרום החדרת תת GABA R הספציפי לנקודתי מגע? האם קולטנים נסחרים למקומות subcellular ספציפיים לפי הרכב המקטע שלהם, שבו הכנסת קרום הפלזמה שלהם היא תנאי הכרחי להידבקות של מסופי axonal ממוצא מסוים? עד כה, על השאלות אלה נותרו ללא מענה. השימוש במערכות מודל מופחת כגון מערכת מודל שיתוף התרבות, מאפשרים לנו להתחיל לענות על שאלות מורכבות זה מכיוון שהמערכה היא בקלות נוחה לtransfection של בונה DNA ויישום של חומרים כימיים ו, ​​חשוב מכך, הוא מתאים לניתוח הדמיה תא חי 30. כך, באמצעות מערכת מודל זה אנו יכולים להתחיל בבדיקת התפקיד של מולקולות בודדות, כוללים סוגים שונים של RS GABA, יודעיםn להיות נוכח בקשרים סינפטיים. יתרון נוסף הוא שהסינפסות בצורת מערכת מודל זה במהירות, בתוך דקות עד שעות, צמצום משך טיפול בניסויים. מערכות מודל שיתוף תרבות דומה הועסקו בעבר בהצלחה למסך למולקולות synaptogenic רומן 27,37,38.

הבנה כיצד מערכת העצבים המרכזית מתפתחת, מתבגר וקשרים בין תאי עצב צורות כל כך מסובכים לשליטה, לדוגמא, התנהגות או קוגניציה, הוא בעל חשיבות עליונה. מטרה רחוקה זה תושג רק על ידי התוויית המנגנונים המולקולריים הקובעים את שלביה השונים של הכרה ותקשורת תא אל התא במהלך התפתחות. בשל מורכבות, הפרטים המולקולריים של אינטראקציות תאיות רבות אלה יכולים כיום ללמוד עם דיוק רק במערכות מופחתות. עם זאת, היכולת להגדיל את המורכבות של מערכות אלה בהבעת שילובים מרובים של חלבונים ולומדים כיצדהם פועלים יש כמה יתרונות בהשוואה ל, למשל, גישות מחיקה גנטיות. סיבה לכך הוא הפרשנות מדויקת של ההשפעות של מחיקת גן יחיד נפגעת לעתים קרובות על ידי שינויים הקשורים במנגנונים מפצים מסווים את ההשפעות של נגעים מקוריים, במיוחד במוח המתפתח. טכניקת שיתוף התרבות אך אינפורמטיבי הפשוטה שתוארה כאן אפשרה גילוי של התפקיד המבני של RS GABA בהיווצרות הסינפסה ונפתחה אפשרות לחקור כיצד Rs GABA ומולקולות הידבקות תא אחרות ו / או חלבוני מטריצה ​​הסינפטי לתקשר אחד עם השני במהלך synaptogenesis. חלבוני מטריצת Synaptic הם בעלי עניין המיוחד לאור עובדה שיש להם לאחרונה הוכח לשחק תפקיד מפתח בהיווצרות הסינפסה glutamatergic 39. פיתוח נוסף של דגמי התרבות המשותפת הוא חשוב כי יש להם הפוטנציאל לקדם את הידע של המנגנונים המולקולריים המנחים את 'ורגיל שלנו# 8217; התפתחות מוח ובכך להגביר את ההבנה של איך מנגנונים אלה שינו בהרבה מחלות התפתחותיות, כמו אפילפסיה, סכיזופרניה, הפרעות ספקטרום האוטיסטי ועוד רבים אחרים שלנו.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות תמיכה כספית מMRC בריטניה (G0800498). כמו כן, אנו רוצים להודות לפרופ 'JM Fritschy, אוניברסיטת ציריך, למתן נוגדן GABA -R למקטע ספציפי γ2 ופרופסור ר' הארווי, בית הספר לרוקחות UCL, למתן pcDNA 3.1 (+) וקטורי ביטוי המכיל עמידות לאנטיביוטיקה גנים לייצור שורות תאי HEK293 transfected ביציבות.

Materials

Name Company/Individual Catalog Number Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Serum) Life Technologies 11960-044 Warm in water bath at 37 ° С before use
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Danger: irritant
FBS (Fetal Bovine Serum) Life Technologies 10106-169
Neurobasal Life Technologies 21103-049 Warm in water bath at 37 ° С before use
B27 Supplement Life Technologies 17504-044
Glucose Sigma-Aldrich G8769
HBSS (10X) Life Technologies 14180-046
HEPES (1M) Life Technologies 15630-056
PBS (1X) Life Technologies 10010-031
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) Life Technologies V790-20
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) Life Technologies V860-20
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) Life Technologies V870-20
Stable HEKα1β2γ2 line Sanofi-Synthelabo, Paris
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1149
G418 disulfate salt (Geneticin) Sigma-Aldrich G5013 Danger: irritant
Phleomycin D1 (Zeocin) Life Technologies R25001
Hygromycin B Life Technologies 10687-010 Danger: toxic, irritant and corrosive
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054 Warm in water bath at 37 ° С before use Danger: Irritant.
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P6282
Laminin Sigma-Aldrich L2020
100 μm Nylon Cell Strainer VWR 734-0004
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich C1768 Danger: Irritant
Chelating agent (Versene) Life Technologies 15040-033
liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). Life Technologies 15338-100 Alternative transfection method: Effectene Reagent
Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) Qiagen 301425
Reduced serum medium (Opti-MEM) Life Technologies 11058-021
Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 Synaptic Systems 105311C5
Neurobasal A Life Technologies 10888-022
Sodium Chloride (NaCl) VWR 27810.364
Glycine Sigma-Aldrich G1726
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3294
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody Prof. Jean Marc Fritschy N/A
(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.
J. Comp. Neurol. 359 (1) 154–194 (1995).
Triton X-100 Promega H5141
Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody Merck Millipore MAB351
Mouse anti-synapsin antibody Synaptic Systems 106-011
Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) Merck Millipore MAB341
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody Professor Anne Stephenson N/A
(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.
Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody Merck Millipore AP1085
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Merck Millipore AP124S
Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody Life Technologies A31553
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody Life Technologies A21422
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies A11008
Mounting reagent (Prolong Gold) Life Technologies P36930 Use at room temperature
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Defining the role of GABA in cortical development. J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).
  2. Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).
  3. Structure Sieghart, W. pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes. Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).
  4. Unwin, N. Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels. Cell. 72, 31-41 (1993).
  5. Homanics, G. E., et al. Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).
  6. Gunther, U., et al. Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).
  7. Mohler, H. GABA(A) receptor diversity and pharmacology. Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).
  8. Low, K., et al. Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science. 290, 131-134 (2000).
  9. Rudolph, U., et al. Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes. Nature. 401, 796-800 (1999).
  10. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).
  11. Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles. Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).
  12. Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin. Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).
  13. Schweizer, C., et al. The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses. Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).
  14. Belelli, D., et al. Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).
  15. Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).
  16. Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors. J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).
  17. Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).
  18. Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors. Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).
  19. Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses. Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).
  20. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  21. Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus. Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).
  22. Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat. Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).
  23. Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).
  24. Siddiqui, T. J., Craig, A. M. Synaptic organizing complexes. Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).
  25. Tanaka, H., et al. Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin. Cell reports. 2, 101-110 (2012).
  26. Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses. Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).
  27. Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
  28. Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Cell. 119, 1013-1026 (2004).
  29. Dong, N., Qi, J., Chen, G. Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors. Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).
  30. Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).
  31. Ventimiglia, R., Lindsay, R. . Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 371-393 (1998).
  32. Gross, A., et al. Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses. Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).
  33. Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).
  34. Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).
  35. Lalchandani, R. R., Vicini, S. Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures. Physiological reports. 1, (2013).
  36. Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).
  37. Linhoff, M. W., et al. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron. 61, 734-749 (2009).
  38. Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development. J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).
  39. Wit, J., et al. Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development. Neuron. 79, 696-711 (2013).

Tags

Inhibitory SynapseGABAergicMedium Spiny NeuronsGABAA ReceptorsHEK293 CellsCo-culture ModelSynapse FormationNeurotransmitterChloride InfluxNeurodevelopmentNeuronal TargetingMolecular Mechanisms

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Brown, L. E., Fuchs, C., Nicholson, M. W., Stephenson, F. A., Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors. J. Vis. Exp. (93), e52115, doi:10.3791/52115 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image