المثبطة تشكيل المشبك في الثقافة المشارك نموذجي يتضمن المتوسطة GABAergic شائك الخلايا العصبية وخلايا HEK293 وإذ يعرب ستابلي GABA<sub> و</sub> المستقبلات
Summary
الآليات الجزيئية التي تنسق تشكيل نقاط الاشتباك العصبي GABAergic المثبطة أثناء تطور الجنين غير معروفة الى حد كبير. لدراسة هذه العمليات، قمنا بتطوير نظام نموذجي المشارك الثقافة التي تضم الخلايا العصبية الجنينية المتوسطة GABAergic شائك مثقف مع ستابلي الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) معربا عن الخلايا الوظيفية مستقبلات GABA A.
Abstract
Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (γ-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials.
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other.
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.
Introduction
GABA هو واحد من أقدم النواقل العصبية الموجودة في المخ الجنينية، التي سبقت العصبي مثير الأكثر وفرة الغلوتامات 1. خلال التنمية، GABA depolarizes ويثير الخلايا العصبية غير الناضجة، ولعب دورا رئيسيا في تنظيم تكاثر الخلايا والهجرة وتشكيل الشبكات العصبية دون إحداث التحفيز الزائدة. في الدماغ الكبار، وتحول احتمال انعكاس لمستقبلات GABA A قنوات لإمكانات أكثر سلبية بسبب انخفاض في تركيز الخلايا كلوريد. يحدث هذا التحول بنسبة تصل التنظيم من البوتاسيوم كلوريد المشارك نقل (KCC2)، الذي ينقل كلوريد خارج الخلية، وبالتوازي، أسفل تنظيم نقل الصوديوم والبوتاسيوم والكلوريد (NKCC1)، التي لديها تأثير معاكس 2.
في الدماغ، GABA يرتبط في المقام الأول إما GABA A أو B مستقبلات GABA للتوسط سريع أو بطيء تثبيط متشابك، الخاصة بكللاي. GABA A روبية هي فئة من المستقبلات التي تعرف أيضا باسم ionotropic heteropentameric أو السيستئين حلقة القنوات الأيونية يجند بوابات. مطلوبة جزيئين من GABA لتفعيل مستقبلات، وهو نفاذا إلى أيونات الكلوريد وإلى درجة أقل، أيونات البيكربونات. الزيادة في كلوريد تصرف يقلل من فعالية إزالة إستقطاب، أحداث مثير في تفعيل عصبون بعد المشبكي 3.
منذ فترة طويلة معترف بها التنوع الهيكلي للGABA A روبية باعتباره عاملا رئيسيا في تحديد مداها واسعة من الخصائص الفنية والدوائية. مواطن GABA A-روبية هي pentamers مغاير مكونة من وحدات فرعية مع الإسوية متعددة تصنف على أنها: α (1-6)، β (1-3)، γ (1-3)، δ، ε، وπ θ 3، مع شيوعا طوبولوجيا الغشاء يتكون مجال كبير N-محطة خارج الخلية، أربعة مجالات الغشاء (ذاكرات)، ومجال الخلايا الرئيسي بين ذاكرات 3 و 4 4. وβ3 وγ2 مفارز ضرورية لتثبيط متشابك وبقاء الكائن الحي، لأن الفئران الحاملة الحذف الجيني لهذه مفارز تموت بعد الولادة 5،6. في المقابل، الإسوية الفردية α فرعية مهمة لوظيفة من الاتصالات متشابك محددة في الدماغ مرتبطة مع سلوكيات مختلفة مثل القلق، والتخدير، والإثارة، وغيرها، ولكن ليست، بشكل فردي، ضرورية لحياة 7-9. GABA A روبية هي المواقع الرئيسية لعمل لمجموعة متنوعة من العقاقير المهدئة مع قوي، منوم، مزيل القلق وآثار مضاد، مثل البنزوديازيبينات، الباربيتورات، والمسكنات neurosteroids 7،10،11.
يحتوي متشابك GABA A روبية عادة فرعية γ2، وهما مفارز β (الأكثر شيوعا β2 أو β3) واثنين من مفارز α (α1، α2، α3 أو α5) 12،13. الطبقة السائدة من مستقبلات خارج متشابك تحتوي الوحيدات δ في تركيبةمع اثنين من مفارز α (α4 أو α6)، واثنين من مفارز β (β2 أو β3) 14. توطين التحت خلوية من GABA A روبية لمحاور عصبية، التشعبات أو سوما، والإدراج في غشاء البلازما تعتمد على وجود β-مفارز 15،16. ومع ذلك، دمج انتقائي من مختلف GABA A R فرعية في أنواع متميزة من نقاط الاشتباك العصبي يرتبط بشكل جيد مع وجود مفارز α محددة (α1، α2، α3 أو α5) 7،17،18. الأهم من ذلك، حذف أو α2 α1 الوحيدات في الفئران يسبب تغيرات التركيبية في نقاط الاشتباك العصبي المثبطة 19. هذا يشير إلى أن GABA روبية أنفسهم قد تلعب دورا مباشرا في تنظيم تشكيل المشبك.
الأدلة تشير إلى أن التنمية المشبك GABAergic هو تسلسل المشارك منسقة بدقة من الأحداث، والتي على حد سواء الأهداف العصبية اتصلت من قبل أنواع مختلفة من المحاور العصبية المثبطة والمستقبلات التي تتجمع فيكل فئة من المشبك المثبط انتقائية وانسجاما وظيفيا 17،20-22. هذا مبدأ أساسي من خصوصية في نقاط الاشتباك العصبي GABAergic يثير تساؤلا عن كيفية الشركاء قبل وبعد المشبكي تعترف بعضها البعض أثناء بدء الاتصالات متشابك.
في المختبر تم تطبيقها المقايسات شارك في ثقافة بنجاح لدراسة بعض الآليات لتشكيل المشبك واختبار دور الفرد البروتينات التي تغطي شق متشابك في هذه العملية. واحد من عبر متشابك التفاعل تركيبات البروتين المشتركة التي تعمل ثنائي إتجاهي للتوسط تشكيل المشبك والنضج، هي Neurexins (Nrxns) وNeuroligins (NLS). Nrxns هي البروتينات التي تظهر قبل المشبكي الربط البديلة داخل laminin-نيوريكسين الجنس هرمون ملزم المجالات البروتين، مما أدى إلى العديد من الأشكال الإسوية المختلفة 23. بينما Nrxns أيضا تتفاعل مع بروتينات أخرى، ويعتقد أن NLS أن تكون السلطة الفلسطينية بعد المشبكي في كل مكان منrtners 24. معا تسهم هذه البروتينات لعقد الأغشية قبل المشبكي وبعد المشبكي في وثيقة وجامدة بدل 25. والإسوية الأكثر وفرة هما NL-1 وNL-2 والتي هي موجودة في نقاط الاشتباك العصبي مثير والمثبطة، 26 على التوالي. استخدمت واحدة من أقدم النظم نموذج التعاون الثقافة، وتهدف إلى تحقيق التفاعل البروتين عبر متشابك، وأنواع مختلفة من الخلايا غير العصبية، وخطوط الخلايا الأكثر شيوعا الخالدة مثل الكلى الجنينية البشرية (كلوة) 293 الخلايا، لNL- عبر صريح 2. عندما كانت هذه الخلايا المستزرعة مع الخلايا العصبية جسري، لوحظ تراكم البروتينات قبل المشبكي على مقربة من سطح الخلايا كلوة، مشيرا إلى تشكيل الاتصالات مثل المشبك. إضافة للذوبان β-نيوريكسين لهذه الثقافات المشتركة تحول دون تشكيل الاتصالات، مما يشير إلى أن التفاعلات العابرة للمتشابك بين Nrxns وNLS ضرورية لتشكيل اتصال متشابك 27. وعلاوة على ذلك، والتعبير عابرةمن β-COS نيوريكسين في خلايا (C V-1 (قرد) في يا rigin، وتحمل المادة الوراثية S V40) شارك في تربيتها مع glutamatergic الحصين فصلها وGABAergic الخلايا العصبية التي يسببها التعبير من البروتين gephryin بعد المشبكي ومفارز GABA A R γ2 وα2 في نقاط الاتصال بين هذه الخلايا النوعين 28. مثال آخر على نموذج التعاون ثقافة المستخدمة لدراسة تشكيل المشبك تشارك HEK293 الخلايا، عابر مع GABA A مفارز α2 R / β3 / γ2 وNL-2، والتي يقطنها خليط سكاني من الخلايا العصبية طائي 29. وخلصت هذه الدراسة إلى أن التعبير عن NL-2 هو شرط مطلق لتشكيل الوصلات العصبية المثبطة.
α1 ومع ذلك، في دراسة شارك في الثقافة الأخيرة، ستابلي / β2 / γ2 GABA A عثر روبية في الخلايا HEK293 أن تكون كافية للحث على نقاط الاشتباك العصبي وظيفية عندما شارك في تربيتها مع ميد GABAergicالخلايا العصبية الشوكية البوتاسيوم، دون الحاجة للبروتينات التصاق عبر متشابك أو بعد المشبكي إضافية. ومع ذلك، لوحظ وجود زيادة بارزة في تشكيل المشبك وقوة عندما كان يشارك أعربت-NL-2 مع GABA A 30 روبية. هذا يدل على أن هذا النظام نموذج التعاون ثقافة مزاياه على الأنظمة النموذجية التي سبق وصفها، من الواضح أكثر وزيادة حساسية وموثوقية الكشف عن اتصال متشابك. اثنين من العوامل الهامة المساهمة في التحسن الشامل في الكشف عن اتصالات متشابك هي: ط) استخدام ستابلي خطوط الخلايا HEK293 مع التعبير عال وثابت من مفارز GABA A R على سطح الخلايا الفردية. هذا التناسق يسهل مقارنات كمية بين مختلف الظروف المشارك الثقافة. ب) استخدام السكان نقية من GABAergic الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة مثقف من المخطط الجنيني 31 يزيل التعقيدات والالتباسات الناتجة عن استخدام السكان العصبية المختلط وألووفاء سلطان، على سبيل المثال، اختيار الأنسب بعد المشبكي أنواع GABA A R التي يمكن مقارنتها مع بعضها البعض خلال تشكيل المشبك.
ويعتقد تكوين نقاط الاشتباك العصبي لإشراك العديد من الإشارات العابرة للمتشابك داخل المجمعات التصاق الخلية قبل وبعد المشبكي. نظرا لطبيعة ثنائية الاتجاه من إشارات متشابك والأعداد الهائلة من جزيئات التصاق الخلية، فمن الصعب تحديد المكونات الرئيسية المشاركة في تشكيل المشبك. وبالتالي، transfecting واحد بروتين التصاق الخلية إلى خلية غير العصبية (في هذه الحالة، وهما الأهداف بعد المشبكي الأكثر انتشارا لGABAergic الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة في الجسم الحي، α1 / β2 / γ2 أو α1 / β3 / γ2 GABA A روبية 32) إلى حد كبير يقلل من تعقيد الإشارات العابرة للمتشابك المتاحة على السطح بعد المشبكي ويسمح التحليل الكمي الدقيق لفعالية هذا البروتين في تعزيز تشكيل المشبك.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن هذا البروتوكول ليس من الصعب من الناحية الفنية على القيام بها، وهناك العديد من الخطوات الهامة التي يجب اتباعها لتحقيق المقايسات شارك في ثقافة أدق وقابلة للتكرار. أولا، يجب أن يكون المصنف مثقف الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة في كثافة مثلى. إذا المصنف قليلة جدا، الخلايا العصبية تميل إلى تطوير ببطء شديد، وخفضت إلى حد كبير بقاء. من ناحية أخرى، إذا كان المصنف كثيفة جدا، تميل إلى تجميع الخلايا العصبية التي التنازلات تحليل الاتصالات مع خلايا HEK293. ثانيا، فمن المستحسن للتعبير عابر مراسل الفلورسنت، أو GFP mCherry في الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت GABA A روبية، قبل platting لهم في الثقافة المشتركة. وهذا يسمح بالاعتراف موثوق الخلايا HEK293، والتي يمكن أن يتعرض للخطر من خلال التشابه في الشكل والحجم بين هذه الخلايا والخلايا الدبقية على قيد الحياة نادرة في الثقافات العصبية. لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن مع GFP أو mCherry [كدنا]، وخطوط الخلايا HEK293 يجب أن تكون في مرحلة النمو الأسي والمصنف في الكثافة المناسبة في 6 لوحات جيدا. سوف بذر متفرق تليها ترنسفكأيشن يسبب الخلايا لتنمو بشكل سيئ، في حين أن الإفراط في البذر ومنع الخلايا من تناول [كدنا]. من الناحية المثالية، ينبغي المصنف الخلايا بحيث تكون بين 70-90٪ متكدسة يوم ترنسفكأيشن. ثالثا، يجب أن يكون الأمثل ترنسفكأيشن لكل خط الخلية المستخدمة، وبعض خطوط الخلايا أكثر حساسية من غيرها. هذا لأن GABA التأسيسي تعبير R في الخلايا HEK293 يقلل من بقاء الخلية، وقدرة الخلايا على التعافي بعد ترنسفكأيشن. وعلاوة على ذلك، البقاء على قيد الحياة يعتمد على نوع من GABA A أعرب في الخلايا HEK293 روبية، مع بعض خطوط الخلايا يجري بشكل ملحوظ أكثر حساسية من غيرها. ترنسفكأيشن باستخدام liposomal الكاشف هو الطريقة المثلى للتعبير عن البروتينات الخارجية في خطوط الخلايا سريعة النمو، وتوفير كل ترنسفكأيشن كفاءة عالية ومستوى التعبير. ومع ذلك، وهذا كاشف يسبب الكثير من الضرر لخطوط الخلايا تنمو ببطء، لالتي نستخدمها بانتظام ترنسفكأيشن الكاشف غير liposomal. هذا يعمل بطريقة مشابهة للكاشف liposomal ولكن يتم تقليل كمية الحمض النووي المطلوبة لترنسفكأيشن كفاءة بكثير. وهذا يسمح بمزيد من بقاء الخلية (حوالي 80-90٪ مقارنة مع 60٪ باستخدام liposomal الكاشف) ولكن مع انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن (60٪). وأخيرا، / β2 / γ2 HEK293 معربا عن الخلايا تضاف إلى الثقافات العصبية يحتاج عدد من السيطرة HEK293 أو α1 إلى أن يكون الأمثل. مضيفا قليل من الخلايا التنازلات التحليل الناجح من الاتصالات بين الخلايا HEK293 والخلايا العصبية، لأنها تصبح نادرة جدا. على العكس، مضيفا خلايا كثيرة HEK293 يسبب موت الخلايا العصبية في ساعات قليلة.
ينبغي من الناحية المثالية أن تكون مستعدة الجنينية الثقافات المتوسطة شائك الخلايا العصبية باستخدام أنسجة الجسم المخطط تشريح من عمر الجنين 15 – 17. ومع ذلك، فإنه غالبا ما يحدث أن الأجنة هي أصغر قليلا أو أكبر سنا من سن الأمثل. في هذه الحالة، المصنف على عدد من الخلايا العصبية في الثقافة سوفتحتاج إلى أن تكون متنوعة. الأنسجة التي هي أصغر من E15 قد تحتاج إلى المصنف في مناطق ذات كثافة أقل قليلا، في حين أن الأنسجة أقدم من E17 قد تحتاج إلى المصنف في مناطق ذات كثافة أعلى، للسماح بقاء الخلية الأمثل. وعلاوة على ذلك، الأرابينوزيد السيتوزين (ARA-C) قد تكون هناك حاجة إلى أن تضاف إلى الثقافات القديمة لمنع نمو الدبقية، التي هي أكثر وفرة في الأنسجة القديمة.
عند إنشاء المشارك الثقافات، فمن المهم أن لوحة العدد الأمثل من HEK293 transfected أو α1 / β2 / γ2 HEK293 الخلايا معربا، على النحو المذكور أعلاه. ومع ذلك، فإنه قد يكون من الضروري تحديد ذلك لكل خط الخلية الفردية، بسبب الاختلافات في بقائهم على قيد الحياة. عادة 30،000 الخلايا في حجم أقصى 50 ميكرولتر ينبغي أن يضاف إلى كل بئر من صحن 24-جيدا، والذي يحتوي بالفعل 500 ميكرولتر من الخلايا العصبية مستنبت، وهذا يضمن أن الخلايا العصبية المتوسطة مكيفة لا تضعف كثيرا وأن الشروط داخل كل تبقى ثابتة بشكل جيد إلى حد ما، على سبيل المثال </em> تركيز عوامل النمو. مضيفا أحجام أكبر من 50 ميكرولتر من كل بئر قتل الخلايا العصبية عموما.
أحد العيوب الرئيسية لهذه التقنية المشارك الثقافة هي أن الثقافات العصبية يتم إنشاؤها من خلايا فصلها كما نمت أحادي الطبقة، وهو ما يعني أن الخلايا العصبية قد أزيلت من المكروية بشكل طبيعي وغير قادرين على تأسيس منظمة التشريحية الطبيعية. ولأنها تفتقر إلى التوصيلات المناسبة والمدخلات والجزيئات يفرز من الخلايا الأخرى التي قد تؤثر على المراحل الأولى للتنمية المشبك. على سبيل المثال، في الجسم الحي ومعصب الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة كثيفة من قبل المدخلات glutamatergic من القشرة، المهاد ومناطق أخرى من الدماغ 34، ومع ذلك، في الثقافات العصبية لدينا نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic لا تشكل بسبب تلف هذه المدخلات أثناء تشريح أنسجة الجسم المخطط. كيف غياب نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic وظيفية في الخلايا العصبية مثقف شائك المتوسطة قسم الشؤون الماليةالنظام الأوروبي قدرتها على تشكيل نقاط الاشتباك العصبي GABAergic مع بعضها البعض و / أو خلايا HEK293 معربا عن GABA A روبية لا تزال مسألة مفتوحة. هذا السؤال يمكن معالجتها بسهولة عن طريق زراعة الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة مع الخلايا العصبية glutamatergic القشرية مما يسمح لهم لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية 35 قبل إضافة خلايا HEK293. وثمة نهج بديل يتمثل في تصميم نظام نموذج التعاون ثقافة تقوم على الثقافات شريحة عضوي النمط، التي تحافظ على بعض من التهندس الخلوي والتي قد تكون مهمة لنضوج وتشكيل المشبك. ومع ذلك، والثقافات شريحة عضوي النمط لها neuropil كثيفة وغير المتجانسة التي يمكن أن تؤثر سلبا على أداء التحليل هنا. آخر العيب المهم استخدام المقايسات المشارك الثقافة هو أن GABA A روبية أعرب على سطح خلايا HEK293 لا تتجمع كما هي الحال في الخلايا العصبية، على الرغم من أن هذا لا يبدو أن تكون ضرورية لتشكيل المشبك إعطاء ما يكفي من التعبير ارتفاع سطح 30. على سبيل المثال، في صodent الدماغ والحصين في الثقافات، وجدت على α1 GABA A R فرعية في معظم نقاط الاشتباك العصبي GABAergic على جميع المجالات بعد المشبكي من الخلايا الهرمية. ومع ذلك، فإن α2 يقع تحديدا في مجموعة فرعية من نقاط الاشتباك العصبي على somata والتشعبات ولكن التخصيب في الجزء الأول محور عصبي، كما كشفت عنها المناعي والمجهر الإلكتروني 36. بالنظر إلى أن تشكيل المشبك في الثقافات المشتركة لا يزال من الممكن الكشف بشكل موثوق وتحليلها 30، وهذا يشير إلى أن كثافة GABA A روبية على سطح خلية من خلايا HEK293 قد تكون مشابهة ل، أو حتى أعلى من كثافة هذه المستقبلات داخل متشابك مجموعات في الخلايا العصبية. وهذا يمكن أن يفسر، جزئيا على الأقل، لماذا البروتينات متشابك التصاق، مثل neuroligin، والبروتينات كثافة بعد المشبكي، مثل gephyrin، ليست ضرورية لتشكيل المشبك في الثقافات المشتركة، إذا توافرت تجميعها بشكل مناسب GABA A روبية في كافية الكثافة.
تم توثيقه جيدا أن GABA A روبية هي هيكليا ووظيفيا غير متجانسة، وأن تكوين مستقبلات فرعية يحدد التعريب من التحت خلوية والخصائص الدوائية. على سبيل المثال، يعرف إدماج مفارز 2 أن يكون شرطا مسبقا لتوطين متشابك من GABA A روبية في حين الوحيدات موجودة بشكل حصري تقريبا في extrasynaptic GABA A روبية. ويعتقد أن المستقبلات التي تتضمن فقط αβ مجموعات أيضا لتكون مترجمة في الغالب إلى المجالات extrasynaptic 12- 14. ما إذا كان الحفاظ على هذه الخصوصية في نظام المشاركة في ثقافتنا يمكن اختبارها بسهولة عليها بنقل عابر 2 أو فرعية cDNAs في خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت α و β مفارز، قبل إضافتها إلى الثقافات العصبية. وأشارت التجارب الأولية لدينا باستخدام هذا النهج أن الاتصالات متشابك تتشكل بسهولة إلا في وجود الوحيدات 2، مشيرا إلى أن SPECIficity وحظ في الجسم الحي من المرجح أن تكون محفوظة في المختبر (لا تظهر البيانات).
وعلاوة على ذلك، تتضمن GABA A مفارز α مختلفة روبية تكون مترجمة بشكل انتقائي لتشكيل اتصالات متشابك مع أنواع معينة من الخلايا العصبية قبل المشبكي. على سبيل المثال، في جلوبس الشاحبة، وجدت α1-GABA A روبية عموما في striatopallidal (STR-GP) وpalliopallidal (GP-GP) نقاط الاشتباك العصبي، التي تقع على التشعبات والمناطق الجسدية من الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة، على التوالي. وتقع على α3-GABA A روبية في المناطق perisomatic من الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة واتصلت قبل الضمانات GP محور عصبي المحلية، في حين أن α2-GABA A روبية تقع على التشعبات البعيدة من هذه الخلايا العصبية والاتصال في المقام الأول من قبل المدخلات من المخطط 32. كما تظاهر تعبيرا عن مفارز α محددة في أنواع مختلفة من نقاط الاشتباك العصبي والخلايا العصبية في الأجزاء المختلفة في مناطق أخرى من الدماغ مثل هيبocampus 21 و 18،20 القشرة المخية الحديثة. هذه النتائج تثير تساؤلا عن كيفية تتشكل المشابك المثبطة محددة في الدماغ. لا التصاق نوع معين من المحطة قبل المشبكي لحث إدخال أنواع فرعية محددة GABA A R إلى نقاط الاتصال؟ والمستقبلات الاتجار بهم إلى مواقع التحت خلوية محددة وفقا لتكوين فرعية لها، حيث من الإدراج غشاء البلازما هو شرط أساسي للالتصاق المحطات محور عصبي المنشأ معين؟ حتى الآن، هذه الأسئلة لا تزال دون إجابة. استخدام نموذج انخفاض أنظمة مثل نظام نموذج التعاون والثقافة، ويسمح لنا لبدء الإجابة عن هذه الأسئلة معقدة لأن النظام هو الانقياد بسهولة إلى ترنسفكأيشن بنيات الحمض النووي وتطبيق الكواشف، والأهم من ذلك، فهي مناسبة للتصوير الخلايا الحية تحليل 30. وهكذا، وذلك باستخدام هذا النظام نموذجا يمكننا البدء باختبار دور الجزيئات الفردية، بما في ذلك أنواع مختلفة من GABA A روبية، ونعرفن أن يكون حاضرا في الاتصالات متشابك. ميزة أخرى هي أن نقاط الاشتباك العصبي في هذا النموذج نموذج النظام بسرعة، في غضون دقائق إلى ساعات، وتخفيض مدة التجارب. تم توظيف أنظمة نموذج مماثل شارك في ثقافة بنجاح في الماضي للكشف عن جزيئات synaptogenic رواية 27،37،38.
فهم كيفية تطور الجهاز العصبي المركزي، ينضج وصلات بين الخلايا العصبية أشكال معقد جدا السيطرة عليها، على سبيل المثال، السلوك أو الإدراك، هو من الأهمية بمكان. وسيتم تحقيق هذا الهدف بعيد المنال إلا من خلال ترسيم الآليات الجزيئية التي تتحكم في خطوات فردية من الاعتراف والتواصل خلية الى خلية خلال التنمية. بسبب التعقيد الهائل، وتفاصيل هذه التفاعلات الجزيئية الخلوية متعددة يمكن حاليا دراستها بدقة إلا في انخفاض النظم. ومع ذلك، فإن القدرة على زيادة تعقيد هذه الأنظمة بالإعراب عن مجموعات متعددة من البروتينات ودراسة كيفيةتتفاعل لديه بعض المزايا مقارنة، على سبيل المثال، نهج حذف الوراثية. وذلك لأن تفسير دقيق للآثار حذف جين واحد في كثير من الأحيان للخطر بسبب التغيرات المرتبطة آليات تعويضية اخفاء آثار الآفات الأصلية، وخاصة في الدماغ النامية. تقنية بسيطة لكنها غنية بالمعلومات المشارك الثقافة الموصوفة هنا قد سمح لاكتشاف الدور الهيكلي للGABA A روبية في تشكيل المشبك وفتح إمكانية لمعرفة كيف GABA A روبية وغيرها من جزيئات الالتصاق الخلوي و / أو البروتينات المصفوفة متشابك تتفاعل مع بعضها البعض خلال synaptogenesis. البروتينات المصفوفة متشابك ذات أهمية خاصة نظرا لأنها في الآونة الأخيرة أظهرت أن تلعب دورا رئيسيا في تشكيل المشبك glutamatergic 39. تطوير المزيد من النماذج المشارك الثقافة هي مهمة لأنها لديها القدرة على دفع معرفتنا الآليات الجزيئية التي توجه «طبيعية و# 8217؛ نمو الدماغ وبالتالي زيادة فهمنا لكيفية تغيير هذه الآليات في العديد من الأمراض العصبية النمائية، مثل الصرع، والفصام، واضطرابات طيف التوحد وغيرها الكثير.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف بدعم مالي من MRC المملكة المتحدة (G0800498). نود أيضا أن نشكر الأستاذ JM Fritschy، جامعة زيوريخ، لتوفير GABA A -R فرعية محددة γ2 الأجسام المضادة وأستاذ R. هارفي، مدرسة الصيدلة، جامعة لندن، لتوفير pcDNA 3.1 (+) ناقلات التعبير التي تحتوي على مقاومة المضادات الحيوية الجينات لإنتاج ستابلي خطوط الخلايا HEK293.
Materials
| Name | Company/Individual | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Serum) | Life Technologies | 11960-044 | Warm in water bath at 37 ° С before use |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Danger: irritant |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10106-169 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | Warm in water bath at 37 ° С before use |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| HBSS (10X) | Life Technologies | 14180-046 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) | Life Technologies | V790-20 | |
| pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) | Life Technologies | V860-20 | |
| pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) | Life Technologies | V870-20 | |
| Stable HEKα1β2γ2 line | Sanofi-Synthelabo, Paris | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| G418 disulfate salt (Geneticin) | Sigma-Aldrich | G5013 | Danger: irritant |
| Phleomycin D1 (Zeocin) | Life Technologies | R25001 | |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | Danger: toxic, irritant and corrosive |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | Warm in water bath at 37 ° С before use Danger: Irritant. |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| 100 μm Nylon Cell Strainer | VWR | 734-0004 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C1768 | Danger: Irritant |
| Chelating agent (Versene) | Life Technologies | 15040-033 | |
| liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). | Life Technologies | 15338-100 | Alternative transfection method: Effectene Reagent |
| Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) | Qiagen | 301425 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 11058-021 | |
| Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 | Synaptic Systems | 105311C5 | |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | VWR | 27810.364 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G1726 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody | Prof. Jean Marc Fritschy | N/A | |
| (Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H. | |||
| J. Comp. Neurol. 359 (1) 154–194 (1995). | |||
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody | Merck Millipore | MAB351 | |
| Mouse anti-synapsin antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) | Merck Millipore | MAB341 | |
| Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody | Professor Anne Stephenson | N/A | |
| (UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172. | |||
| Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody | Merck Millipore | AP1085 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | Merck Millipore | AP124S | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody | Life Technologies | A31553 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody | Life Technologies | A21422 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Life Technologies | A11008 | |
| Mounting reagent (Prolong Gold) | Life Technologies | P36930 | Use at room temperature |
References
- Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Defining the role of GABA in cortical development. J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).
- Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).
- Structure Sieghart, W. pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes. Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).
- Unwin, N. Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels. Cell. 72, 31-41 (1993).
- Homanics, G. E., et al. Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).
- Gunther, U., et al. Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).
- Mohler, H. GABA(A) receptor diversity and pharmacology. Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).
- Low, K., et al. Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science. 290, 131-134 (2000).
- Rudolph, U., et al. Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes. Nature. 401, 796-800 (1999).
- Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).
- Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles. Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).
- Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin. Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).
- Schweizer, C., et al. The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses. Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).
- Belelli, D., et al. Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).
- Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).
- Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors. J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).
- Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).
- Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors. Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).
- Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses. Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus. Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).
- Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat. Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).
- Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).
- Siddiqui, T. J., Craig, A. M. Synaptic organizing complexes. Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).
- Tanaka, H., et al. Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin. Cell reports. 2, 101-110 (2012).
- Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses. Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Cell. 119, 1013-1026 (2004).
- Dong, N., Qi, J., Chen, G. Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors. Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).
- Ventimiglia, R., Lindsay, R. . Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 371-393 (1998).
- Gross, A., et al. Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses. Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).
- Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).
- Lalchandani, R. R., Vicini, S. Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures. Physiological reports. 1, (2013).
- Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).
- Linhoff, M. W., et al. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron. 61, 734-749 (2009).
- Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development. J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).
- Wit, J., et al. Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development. Neuron. 79, 696-711 (2013).
