Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan'a bağlı İzleme

Memeli proteinlerinin bir çok sayıda ağır ribozom tarafından proteinlerin sentezi, aşağıdaki enzimlerin etkimesi ile modifiye edilir. Bu post-translasyonel modifikasyonlar, (PTMS) büyük ölçüde protein ^1-3 arasında (diğer özellikleri yanı sıra) boyut, yük, yapı ve oligomerizasyon durumunu değiştirerek Proteome fonksiyonel çeşitliliği artırabilir. Bunun bir sonucu olarak, protein yapısındaki bir değişiklik, örneğin protein bozulması, hücre farklılaşması, iletimde, gen ekspresyonunda modülasyonu ve protein-protein etkileşimleri gibi fizyolojik sonuçlara yol açabilir. Bu değişiklikler tüm insan proteinlerinin büyük bir yüzdesi görülürken histon proteinler kovalent modifikasyonlar ⁴ alışılmadık derecede yüksek sayıda geçmesi üzerine, terminal biter. Histon proteinler genomik DNA yoğunlaştırılmasını kolaylaştırır, yapısal proteinlerin bir ailesidir. Yapılandırılmamış histon kuyrukları Kovalent modifikasyonlar bir seride tarafından yürütülen ve düzenlenir, artıkları (yazarlar) ve kovalent modifikasyonunu katalize aynı değişiklikleri (silgiler), ters ve değişiklikler arasında ayrım enzimlerin s histon kuyrukları (okuyucu) ^5-7 üzerine basılmış olan. Aslında, bilinen PTMS en metilasyon, fosforilasyon, asetilasyon, sumoylation, ubikitinasyon ve sitrülinlenmesine ⁸ de dahil olmak üzere histonun bu kısa segmenti içinde görülmektedir.

Sitrülinlenmesine olmayan T RNA kodlanmış peptidil-sitrulin (Şekil 1A) peptidil-argininin dönüştürülmesini kapsar. Bu yan zinciri nötrleştirme sorumlu proteinleri, PAD üyesi olan kalsiyum-bağımlı enzimler olması her biri. ^9,10, protein ailesini (s rginine D eiminase peptit). Bugüne kadar, PAD ailesinin beş üyesi (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 ve PAD6) 'de tarif edilmiştir. Bu ailenin her üyesi farklı hücresel proteinleri hedef görünür ve aynı zamanda uni görüntülerque doku dağılımı profilleri. PAD4 bir nükleer lokalizasyon dizisi ¹¹ ile çekirdek içinde lokalize olduğu bilinmektedir, bu protein ailesinin tek üyesidir. Bu duruma göre, histon H2A arginin kalıntısının 3, PCR'ın N-terminal kuyrukları arginin yan zincirler (H2R3), H + 3 (H3R2, H3R17 ve H3R26) ve H4 (H4R3) ¹² nükler hedeflerin bir dizi deiminate ^{gösterilmiştir, 13.} PAD izozimlerinin, her özel ve kritik fizyolojik işlevlere sahip olsa da, PAD4 dolayı hastalıklı ve sağlıklı hücrelerinin her ikisinde de, insan gibi bir dizi işlem rolünü önemli ölçüde daha fazla ilgi çekmektedir. Son zamanlarda, PAD4 Pluripotency transkripsiyonel ağı ¹⁴ üye olduğu gösterilmiştir. Her iki PAD4 sentezleme seviyeleri ve aktivite, farelerde yeniden programlama ve taban durumu, pluripotent durumlarında yüksek olduğu gösterilmiştir. Kök hücre genlerin düzenlenmesini kontrol edilerek, PAD4 hücre yeniden programlama veriminde önemli bir rol tutabilirler. PAD4 de implike edilmiştirüzerine patojenlerin bağlanmasını nötrofil hücre dışı tuzakları, oluşumu kendi sistem açıklığı sağlar. PAD4 histon proteinleri hypercitrullination dolayısıyla bakteriyel enfeksiyonların ^15,16 sakınma, hücre dışı tutucusu ile, patojen bakterilerin kapsüllenmesi için taban malzemesi olarak hizmet eden kromatin yoğunluk azaltılmasından neden olur.

Buna ek olarak, PAD4 insan hastalıklarının bir dizi aktif bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Daha önce PAD4 anormal ekspresyon romatoid arteritin başlamasında ve şiddeti ile ilişkili olduğu gösterilmiştir, Alzheimer, Parkinson hastalığı ve multipl skleroz ^17. Aslında, bir anti-sitrülin proteinin antikorların varlığı romatoid artrit ¹⁸ arasında en güvenilir ve kesin bir teşhis ve prognostik biyolojik biridir. Benzer şekilde, bozulmuş PAD4 aktivitesi en son yumurtalık, meme, akciğer, bir de dahil olmak üzere insan kanserlerinin bir dizi gözlenmiştird özofagus kanserleri ^19-22. PAD4 ve kanser arasındaki bağlantı, p53 tümör bastırıcı bir protein ^22,23 ELK1 onkogen üzerinden veya yoluyla aracılık ettiği gösterilmiştir ve önceki iş PAD4 bir yeni anti-kanser terapötik hedef ^17,24,25 olabileceğini öne sürdü. Ilke çalışmanın bir kanıtı olarak, kolorektal kanser hücre çizgisi, HCT116 olarak shRNA ile PAD4 tükenmesi apoptoz ve hücre döngü yakalanmasını ²⁶ uyarılması için yeterli olduğu bulundu. Son yıllarda geliştirilmiş olan geri dönüşü olmayan bir PAD4 inhibitörünün farelerde ²⁷ tümör kütlesinde bir yetmiş oranında azalmaya yol açmıştır. Oldukça önemli ölçüde, PAD4 inhibisyon dönüştürülmemiş hücreleri ayırarak, kanser hücrelerinin seçici ölümüyle sonuçlanan bir hedefe yönelik bir tedavi olarak hareket ortaya çıktı.

PAD4 işlevini kapatmak için küçük moleküllerin kullanımı, kanser hücrelerini hedef veya mevcut kanser, kemoterapi ²⁸ artırmak için yeni ve güçlü bir strateji olduğu ispat edebilir. Ne yazık ki, POÇadır geri dönüşümlü PAD4 inhibitörü henüz keşfedilmeyi etti. Kovalent önleyicileri bir dizi alt-tabakanın arginin ^27,29,30 taklit ile sağlıklı ve hastalıklı durumu hücrelerinin her ikisinde de PAD4 rolünü anlamak için pratik araçlar olduğu kanıtlanmıştır kloro / floro dj pirimidin kolu kullanarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu molekül, benzer etki ile, aktif pedlerin her inhibe eder. Bu nedenle, PAD4 aktivitesine ilişkin raporlar, basit bir deneme için olan ihtiyaç çok önemlidir. Bugüne kadar, PAD4 deneyler, kolorimetrik bir okuma ³¹ ile reaksiyondan amonyağın serbest bağlantı tarif edilmiştir, floresan polarizasyon tahlili için ³² flüoresan chloroamidine alt-tabaka analog kullanmaktadır glioksal ve sitrulline ³³ arasındaki asit yardımlı reaksiyon üzerine dayanır ve bağlanma aşamasının ³⁴ dequenching bir floresan PAD4 faaliyet. Bunlardan sadece kovalent değiştirici haloacetamidine stratejisi, yüksek verimli Scre ile uyumlu olduğu kanıtlanmıştırsürmesi gelen platformlar ^32,35,36. Biz güvenilir PAD4 aktivitesini ölçen basit floresan dayalı tahlil açıklar. Güçlü bir sinyal-gürültü oranı, analiz hızı ve ölçüm sağlamlık gösterir deneyi, gerçekten kuvvetli ve seçici PAD4 inhibitörü keşfetmek için potansiyele sahiptir.