Флуоресценции основе Контроль PAD4 деятельности через Pro-флуоресцентной субстрата Analog

Большое количество белков млекопитающих в значительной степени изменены под действием ферментов следующей биосинтеза белков рибосомой. Эти пост-трансляционные модификации (PTMs) может значительно увеличить функциональное разнообразие протеоме, изменяя размер, заряд, структуру и состояние олигомеризации (среди других особенностей) белков ^1-3. В результате, изменение в структуре белка может привести к физиологических последствий, таких как деградации белка, клеточной дифференцировки, сигнализации, в модуляции экспрессии гена, и белок-белковых взаимодействий. В то время как эти модификации распространены в большом проценте всех белков человека, терминал заканчивается на гистоновых белков пройти необычно высокое число ковалентных модификаций ^4. Гистоновых белков представляют собой семейство структурных белков, которые способствуют конденсации геномной ДНК. Ковалентные модификации неструктурированных гистонов осуществляется и регулируется серииы ферментов, которые могут катализировать ковалентной модификации остатков (писатели), обратного те же изменения (ластики), и различие между изменениями импринтируемые на гистонов (читателей) ^5-7. В самом деле, большинство известных PTMs можно наблюдать в течение этого короткого отрезка гистона включая метилирование, фосфорилирование, ацетилирование, SUMOylation, убиквитинирования, и citrullination ^8.

Citrullination включает конверсию пептидил-аргинина к не-т РНК кодируется пептидил-цитруллин (Фигура 1А). Белки, отвечающие за этот боковой цепи нейтрализации, являются членами ОП (р eptide в rginine D eiminase) семейства белков, все из которых являются кальций-зависимых ферментов. ^9,10. На сегодняшний день, пять членов семьи PAD были описаны (PAD1, pad2, PAD3, PAD4 и PAD6). Каждый член этого семейства появляется целевой различных клеточных белков, а также отображает UNIQue распределительные ткани профили. PAD4 является единственным членом этого семейства белков как известно, локализованный в ядре с помощью последовательности ядерной локализации ^11. Соответственно, было показано, что deiminate ряд ядерных мишеней, в том числе аргинина боковых цепей на N-концевых хвостов гистонов H2A остатка аргинина 3 (H2R3), Н3 (H3R2, H3R17, и H3R26) и H4 (H4R3) ^{12, 13.} В то время как каждый из PAD изоферментов есть конкретные и важные физиологические функции, PAD4 получил значительно больше внимания из-за его роли в ряде населенных процессов в обоих больных и здоровых клеток. В последнее время, PAD4 было показано, что член плюрипотентность транскрипционной сети ^14. Оба уровни экспрессии PAD4 и деятельность были показаны, что повышается во время перепрограммирования и основного состояния плюрипотентных государств на мышах. Управляя регуляции генов стволовых клеток, PAD4 может сохранить ключевую роль в эффективности клеточного перепрограммирования. PAD4 также участвует вформирование нейтрофилов внеклеточных ловушек, которые при связывании патогенов включить их системы очистки. Hypercitrullination из гистоновых белков путем PAD4 индуцирует деконденсацию хроматина, который служит в качестве базового материала для инкапсуляции патогенных бактерий путем внеклеточного ловушку, тем самым отвести бактериальных инфекций ^15,16.

Кроме того, PAD4 было установлено, играть активную роль в ряде заболеваний человека. Ранее было показано, что аберрантная экспрессия PAD4 связан с началом и тяжести ревматоидного артрита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, рассеянный склероз и ^17. В самом деле, присутствие анти-цитруллинированных белковых антител является одним из наиболее надежных и окончательных диагностических и прогностических биомаркеров ревматоидного артрита ^18. Аналогичным образом, нарушением регуляции активности PAD4 недавно было отмечено в ряде злокачественных опухолей человека, включая рак яичников, молочной железы, легкого, сг рака пищевода ^19-22. Связь между PAD4 и рака было показано, чтобы быть опосредованы через онкогена ELK1 или через супрессора опухолевого белка р53 ^22,23 и предыдущая работа предположил, что PAD4 может быть новым противораковым терапевтической мишенью ^17,24,25. В качестве доказательства принцип исследования, истощение PAD4 через shRNA в колоректального клеточной линии рака НСТ116 Было показано, что достаточно для индукции апоптоза и клеточного цикла ^26. Недавно был разработан необратимый ингибитор PAD4 привело к снижению массы опухоли у мышей ²⁷ в семьдесят процентов. Довольно удивительно, PAD4 торможение, казалось, выступать в качестве целевой терапии, в результате селективного убийства раковых клеток, щадя непреобразованной клетки.

Использование малых молекул, чтобы выключить функцию PAD4 может оказаться мощным новая стратегия, чтобы раковые клетки или дополнить существующие химиотерапевтические рака ^28. К сожалению, POПалатка обратимым PAD4 ингибитор еще предстоит открыть. Ряд ингибиторов ковалентных были разработаны с использованием хлора / фтора imidine ручку, который имитирует аргинин субстрат ^27,29,30 и зарекомендовали себя как практические инструменты для понимания роли PAD4 в обоих здоровых и больных государственных клеток. Тем не менее, эти молекулы ингибируют все активные колодки с аналогичной активностью. Таким образом, потребность в поспешном анализа, который сообщает о деятельности PAD4 имеет решающее значение. На сегодняшний день PAD4 анализы были описаны, что связать высвобождение аммиака в результате реакции на колориметрический считывания ^31, используют флуоресцентно меченого субстрата chloroamidine аналог для поляризации флуоресценции анализа ^32, опираются на реакции кислоты при содействии между глиоксаля и цитруллина ^33, и пара деятельность PAD4 к флуоресценции шаг ³⁴ dequenching. Из них только ковалентная модификатор стратегия haloacetamidine доказал, чтобы быть совместимым с высокой пропускной Screрение платформы ^32,35,36. Мы описываем легкое флуоресценции, основанный анализ, который надежно измеряет активность PAD4. Анализ, который отображает сильный сигнал-шум, скорость анализа и надежности измерений, имеет потенциал, чтобы открыть для себя по-настоящему мощным и селективным ингибитором PAD4.