Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência

Um grande número de proteínas de mamífero são fortemente modificado pela acção de enzimas após a biossíntese de proteínas pelo ribossoma. Estas modificações pós-translacionais (PTMs) pode aumentar significativamente a diversidade funcional do proteoma mudando o tamanho, carga, estrutura, e estado de oligomerização (entre outras características) de proteínas ^1-3. Como resultado, a variação na estrutura da proteína podem conduzir a consequências fisiológicas, tais como a degradação das proteínas, a diferenciação celular, a sinalização, a modulação da expressão do gene, e interacções proteína-proteína. Enquanto essas modificações são predominantes em uma grande porcentagem de todas as proteínas humanas, o terminal termina em proteínas histonas passam por um número anormalmente elevado de modificações covalentes ^4. Proteínas histona são uma família de proteínas estruturais que facilitam a condensação de ADN genómico. Modificações covalentes das caudas das histonas não estruturados são realizadas e regulado por uma series de enzimas que podem catalisar a modificação covalente de resíduos (escritores), inverter as mesmas modificações (borrachas), e distinguem entre as mudanças que estão sendo impressas para as caudas das histonas (leitores) ^5-7. Na verdade, a maioria dos PTMs conhecidos pode ser observado dentro deste segmento curto da histona, incluindo a metilação, fosforilação, acetilação, sumoilação, ubiquitinação, e citrulinação ^8.

Citrulinação envolve a conversão de peptidil-arginina para o t ARN não codificado peptidil-citrulina (Figura 1A). As proteínas, responsáveis ​​por esta cadeia lateral de neutralização, são membros da DAP (p eptide um eiminase rginine d) a família de proteínas, todas as quais são enzimas dependentes de cálcio ^9,10.. Até à data, cinco membros da família PAD foram descritos (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, e PAD6). Cada membro desta família parece alvejar proteínas celulares distintas e também exibe uniperfis de distribuição de tecido Que. PAD4 é o único membro desta família de proteínas conhecida por estar localizada dentro do núcleo através de uma sequência de localização nuclear ^11. Deste modo, tem sido demonstrado que deiminate um número de alvos nucleares, incluindo cadeias laterais de arginina sobre as caudas N-terminais das histonas H2A arginina resíduo 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, e H3R26) e H4 (H4R3) ^{12, 13.} Enquanto cada uma das isozimas PAD têm funções fisiológicas específicas e críticos, PAD4 tem recebido bastante mais atenção devido ao seu papel numa série de processos humanos em ambas as células doentes e saudáveis. Recentemente, PAD4 mostrou ser um membro da rede transcricional pluripotência ^14. Ambos os níveis de expressão PAD4 e atividade mostraram-se elevados durante a reprogramação e estatais chão estados pluripotentes em camundongos. Ao controlar a regulação de genes de células-tronco, PAD4 pode reter um papel crucial na eficiência de reprogramação celular. PAD4 também tem sido implicado naformação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, o qual após a ligação de agentes patogénicos possibilitar a sua recarga do sistema. O hypercitrullination de proteínas histona por PAD4 induz descondensação da cromatina, o que serve como o material de base para o encapsulamento de bactérias patogénicas por a armadilha extracelular, assim, afastar infecções bacterianas ^15,16.

Além disso, foi encontrado PAD4 a desempenhar um papel activo num número de doenças humanas. Foi previamente mostrado que a expressão aberrante de PAD4 está associada com o aparecimento e gravidade da artrite reumatóide, a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, e esclerose múltipla ^17. Na verdade, a presença de anticorpos anti-citrulinados proteína é um dos biomarcadores de diagnóstico e de prognóstico mais fiáveis ​​e definitivas ¹⁸ de artrite reumatóide. Do mesmo modo, a actividade desregulada PAD4 foi recentemente observado num número de cancros humanos incluindo ovário, mama, pulmão, umad cânceres de esôfago ^19-22. A ligação entre PAD4 e cancro tem sido mostrado para ser mediada através do oncogene ELK1 ou através da proteína supressora de tumor p53 ^22,23 e trabalho anterior sugeriu que PAD4 poderia ser um alvo terapêutico anti-cancro da novela ^17,24,25. Como prova do princípio do estudo, a depleção de PAD4 através shRNA na linha celular de cancro colo-rectal HCT116 foi revelado para ser suficiente para induzir a apoptose e paragem do ciclo celular ^26. Um inibidor irreversível PAD4 recentemente desenvolvido conduziu a uma redução de setenta por cento da massa do tumor em ratos ^27. Muito notavelmente, a inibição PAD4 apareceu para actuar como uma terapia-alvo que resultou na morte selectiva de células cancerígenas, enquanto poupando células não transformadas.

O uso de pequenas moléculas para desligar a função de PAD4 pode vir a ser uma nova e poderosa estratégia para atingir as células cancerosas ou para aumentar quimioterápicos de câncer existentes ^28. Infelizmente, a potenda inibidor reversível PAD4 tem ainda a ser descoberto. Uma série de inibidores covalentes foram desenvolvidos usando o / alça imidine flúor cloro que imita o substrato arginina ^27,29,30 e provaram ser ferramentas práticas para a compreensão do papel da PAD4 em ambas as células estaduais saudáveis ​​e doentes. No entanto, estas moléculas inibem a todos os PADs activos com potência similar. Portanto, a necessidade de um ensaio fácil, que relata sobre a actividade de PAD4 é crucial. Até à data, PAD4 ensaios foram descritos que vincular a liberação de amônia a partir da reação de uma leitura colorimétrica ^31, utilizar um análogo do substrato chloroamidine fluorescente etiquetado para teste de polarização fluorescente ^{de 32,} contam com a reação assistida por ácido entre glioxal e citrulina ^33, e par a actividade PAD4 a um passo de fluorescência dequenching ^34. Destes, apenas a estratégia haloacetamidine modificador covalente tem provado ser compatíveis com scre de alto rendimentoplataformas ening ^32,35,36. Nós descrevemos um ensaio baseado fluorescência fácil, que mede de forma confiável a atividade de PAD4. O ensaio, que exibe uma forte relação de sinal-para-ruído, a velocidade de análise, e robustez de medição, tem o potencial para descobrir um verdadeiramente potente e selectivo inibidor PAD4.