プロ蛍光基質アナログを経由してPAD4活性の蛍光ベースの監視

哺乳類のタンパク質の大多数は重くリボソームによるタンパク質の合成以下の酵素の作用によって修飾される。これらの翻訳後修飾（PTMは）大幅にタンパク質^1-3（他の機能の中で）、サイズ、電荷、構造、オリゴマー化状態を変化させることにより、プロテオームの機能的多様性を増加させることができる。その結果、タンパク質構造の変化は、タンパク質分解、細胞分化、シグナル伝達、遺伝子発現の調節、およびタンパク質 – タンパク質相互作用のような生理学的結果をもたらすことができる。これらの変更は、すべてのヒトタンパク質の大きな割合で普及している一方で、端末はヒストンタンパク質に終了共有結合修飾⁴の異常に高い数値を受ける。ヒストンタンパク質は、ゲノムDNAの凝縮を容易にする構造タンパク質のファミリーである。非構造化ヒストン尾部の共有結合修飾は、セリエAによって行われ、規制されている、残基（作家）の共有結合的修飾を触媒する同じ変更（消しゴム）を逆転し、変更を区別できる酵素のsはヒストン尾（読者^）5-7上に刻印されている。実際には、既知のPTMのほとんどは、メチル化、リン酸化、アセチル化、SUMO化、ユビキチン化、およびシトルリン⁸を含むヒストンのこの短いセグメント内に観察することができる。

シトルリンは、ペプチジル-シトルリン（ 図1A）符号化された非トン RNAへのプチアルギニンの変換を含む。この側鎖の中和を担うタンパク質は、カルシウム依存性酵素であるその全てがPAD た（p eptide A rginine dの eiminase）タンパク質ファミリーのメンバーである^。9,10。現在までに、PADのファミリーの5メンバーは（PAD1、PAD2、PAD3、PAD4、およびPAD6）に記載されている。このファミリーの各メンバーは、個別の細胞タンパク質を標的とするように表示され、またUNIを表示queの組織分布プロファイル。 PAD4は、核局在化配列¹¹を介して核内に局在することが知られているこのタンパク質ファミリーの唯一のメンバーである。したがって、H3（H3R2、H3R17、およびH3R26）及びH4（H4R3）、ヒストンH2Aのアルギニン残基3（H2R3）のN末端 ​​尾部におけるアルギニンの側鎖を含む核標的の数を、deiminateすることが示されている^{12、 13。} PADアイソザイムのそれぞれが具体的かつ重要な生理学的機能を有するが、PAD4は、罹患および正常細胞の両方におけるヒトのプロセス数におけるその役割にかなり注目されている。最近では、PAD4は、多能性の転写ネットワーク¹⁴のメンバであることが示された。両方PAD4の発現レベルおよび活性は、マウスにおける再プログラミングと基底状態の多能性状態の間に上昇することが示された。幹細胞の遺伝子の調節を制御することにより、PAD4は細胞リプログラミング効率の極めて重要な役割を保持することができる。 PAD4も関与している病原体の結合時に、そのシステムのクリアランスを有効に好中球細胞外トラップの形成。 PAD4によるヒストンタンパク質のhypercitrullinationは、このような細菌感染^15,16を退ける、細胞外トラップによる病原性細菌のカプセル化のための基材として機能するクロマチンの脱凝縮を誘導する。

さらに、PAD4は、多くのヒト疾患において積極的な役割を果たすことが見出されている。これは、以前にPAD4の異常な発現は、関節リウマチの発症および重症度と関連していることが示されており、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症^17。実際、抗シトルリン化タンパク質抗体の存在が関節リウマチ¹⁸の最も信頼性の決定的な診断および予後バイオマーカーの1つである。同様に、調節不全PAD4活性は最近、卵巣、乳房、肺、などの多くのヒト癌において観察されているD食道癌^19-22。 PAD4と癌との関連は、p53腫瘍抑制タンパク質^22,23 ELK1癌遺伝子を介して、またはを介して媒介されることが示されており、以前の研究は、PAD4は、新規な抗癌治療のターゲット^17,24,25かもしれないことを示唆している。原理研究の証明として、結腸直腸癌細胞株HCT116におけるshRNAを介したPAD4の枯渇は、アポトーシスおよび細胞周期停止^26を誘導するために十分であることが判明した。最近開発された不可逆的なPAD4阻害剤は、マウス²⁷の腫瘍塊における七十%削減につながった。かなり著しく、PAD4阻害は非形質転換細胞を温存しながら、癌細胞の選択的殺傷をもたらした標的療法として機能するように見えた。

PAD4の機能をオフにする小分子の使用は、癌細胞を標的とするか、または既存の癌化学療法剤^28を補強するための強力な新しい戦略になるかもしれない。残念ながら、PO10トン可逆PAD4阻害剤は、まだ発見されなければならない。共有結合性阻害剤の数は、アルギニン基板^27,29,30を模倣し、健康および疾患状態の細胞の両方においてPAD4の役割を理解する上で実用的なツールであることが証明されているクロロ/フルオロイミジンハンドルを使用して開発されている。しかし、これらの分子は、同様の効力を有する活性のPADのすべてを阻害する。したがって、PAD4の活動について報告し、容易なアッセイの必要性は非常に重要です。今日まで、PAD4アッセイは、比色読み出し³¹に対する反応からのアンモニアの放出をリンクすることが記載されており、蛍光偏光アッセイ³²用の蛍光標識chloroamidine基質類似体を利用し、グリオキサール及びシトルリン³³との間の酸アシスト反応に依存して、及び夫婦ステップ^34を脱消光蛍光にPAD4活動。これらのうち、唯一の共有結合の修飾haloacetamidine戦略は、ハイスループットSCREと互換性があることが証明されている締付プラットフォーム^32,35,36。私たちは確実にPAD4の活性を測定する簡便な蛍光ベースのアッセイを記述する。強力な信号対雑音比、分析速度、および測定のロバスト性を表示するアッセイは、真の強力かつ選択的なPAD4阻害剤を発見する可能性がある。