Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza
Summary
PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.
Abstract
Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.
Introduction
Un gran numero di proteine di mammifero sono fortemente modificato dall'azione di enzimi seguito della biosintesi delle proteine del ribosoma. Queste modificazioni post-traduzionali (PTM) possono aumentare notevolmente la diversità funzionale del proteoma modificando le dimensioni, la carica, la struttura, e lo stato di oligomerizzazione (tra le altre caratteristiche) di proteine 1-3. Di conseguenza, il cambiamento della struttura di proteine può portare a conseguenze fisiologiche, quali la degradazione delle proteine, differenziazione cellulare, segnalazione, la modulazione dell'espressione genica, e le interazioni proteina-proteina. Mentre queste modificazioni sono prevalenti in una grande percentuale di tutte le proteine umane, il terminale termina il istoni subiscono un numero insolitamente elevato di modificazioni covalenti 4. Istoni sono una famiglia di proteine strutturali che facilitano la condensazione del DNA genomico. Covalenti modificazioni delle code istoniche non strutturati sono effettuate e regolate da una series di enzimi in grado di catalizzare la modifica covalente di residui (scrittori), invertire le stesse modifiche (gomme), e distinguere tra i cambiamenti che sono impresse sulle code degli istoni (lettori) 5-7. In realtà, la maggior parte dei PTM conosciute si possono osservare in questo breve segmento del istoni compresi metilazione, fosforilazione, acetilazione, sumoilazione, ubiquitinazione e citrullination 8.
Citrullination comporta la conversione del peptidil-arginina al t RNA non codificato peptidil-citrullina (Figura 1A). Le proteine, responsabili di questa catena di neutralizzazione lato, sono membri del PAD (p eptide un rginine eiminase d) famiglia di proteine, che sono tutti enzimi calcio-dipendenti. 9,10. Fino ad oggi, cinque membri della famiglia PAD sono state descritte (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, e PAD6). Ogni membro di questa famiglia sembra indirizzare proteine cellulari distinti e anche visualizza unique profili distribuzione tissutale. PAD4 è l'unico membro di questa famiglia di proteine note per essere localizzato all'interno del nucleo tramite una sequenza di localizzazione nucleare 11. Pertanto, è stato dimostrato per deiminate un numero di bersagli nucleari, comprese le catene laterali di arginina sulle code N-terminali degli istoni H2A residuo di arginina (3 H2R3), H3 (H3R2, H3R17 e H3R26) e H4 (H4R3) 12, 13. Mentre ciascuna delle isoenzimi PAD hanno funzioni fisiologiche specifiche e critiche, PAD4 ha ricevuto molta più attenzione a causa del suo ruolo in una serie di processi umani in cellule di entrambi i malati e sani. Recentemente, PAD4 ha dimostrato di essere un membro della pluripotenza trascrizionale di rete 14. Entrambi i livelli di espressione PAD4 e l'attività hanno dimostrato di essere elevata durante la riprogrammazione e la terra statali stati pluripotenti nei topi. Controllando la regolazione dei geni di cellule staminali, PAD4 può mantenere un ruolo centrale nella riprogrammazione cellulare efficienza. PAD4 è stato anche coinvolto nelformazione di trappole extracellulari dei neutrofili, che dopo il legame di agenti patogeni consentire loro liquidazione sistema. La hypercitrullination di proteine istoniche da PAD4 induce decondensazione della cromatina, che serve come materiale di base per l'incapsulamento di batteri patogeni da parte della trappola extracellulare, in modo da scongiurare infezioni batteriche 15,16.
Inoltre, PAD4 è stata trovata a svolgere un ruolo attivo in una serie di malattie umane. È stato precedentemente dimostrato che l'espressione aberrante di PAD4 è associato con l'insorgenza e la gravità di artrite reumatoide, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi multipla e 17. Infatti, la presenza di anticorpi anti-proteina citrullinati è uno dei biomarcatori diagnostici e prognostici più affidabili e definitive di artrite reumatoide 18. Analogamente, l'attività PAD4 disregolazione stato recentemente osservato in un certo numero di tumori umani inclusi dell'ovaio, della mammella, del polmone, und tumori esofagei 19-22. Il legame tra PAD4 e il cancro ha dimostrato di essere mediata attraverso l'oncogene ELK1 o tramite il tumore soppressore p53 proteina 22,23 e lavoro precedente ha suggerito che PAD4 potrebbe essere un anti-cancro nuovo bersaglio terapeutico 17,24,25. Come una prova di principio studio, l'esaurimento delle PAD4 via shRNA nella linea cellulare del cancro del colon-retto HCT116 si è rivelato essere sufficiente per indurre l'apoptosi e arresto del ciclo cellulare 26. Un inibitore irreversibile PAD4 recentemente sviluppato ha portato ad una riduzione del settanta per cento della massa tumorale nei topi 27. Piuttosto notevole, l'inibizione PAD4 sembrava operare come una terapia mirata che ha provocato l'uccisione selettiva delle cellule cancerose risparmiando cellule non trasformate.
L'uso di piccole molecole per disattivare la funzione di PAD4 può rivelarsi una potente strategia nuova per colpire le cellule tumorali o di aumentare chemioterapici cancro esistenti 28. Purtroppo, un potenda inibitore reversibile PAD4 deve ancora essere scoperto. Un certo numero di inibitori covalenti sono stati sviluppati utilizzando il / maniglia imidine fluoro cloro che imita il substrato arginina 27,29,30 e hanno dimostrato di essere strumenti pratici per comprendere il ruolo di PAD4 in entrambe le cellule statali sani e malati. Tuttavia, queste molecole inibiscono tutte le pastiglie attivi con potenza simile. Pertanto, la necessità di un saggio superficiale che segnala l'attività di PAD4 è cruciale. Fino ad oggi, PAD4 saggi sono stati descritti che collegano il rilascio di ammoniaca dalla reazione a una lettura colorimetrica 31, utilizzare un analogo substrato chloroamidine fluorescente per fluorescenza polarizzata test 32, si basano sulla reazione acida assistita tra gliossale e citrullina 33, e coppia l'attività PAD4 ad una fluorescenza dequenching passo 34. Di questi, solo il modificatore strategia haloacetamidine covalente ha dimostrato di essere compatibile con scre elevato throughputpiattaforme zare 32,35,36. Descriviamo un test basato sulla fluorescenza facile che misura in modo affidabile l'attività di PAD4. Il test, che mostra un forte rapporto segnale-rumore, velocità di analisi, e la robustezza della misura, ha il potenziale per scoprire un inibitore PAD4 veramente potente e selettivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
| Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| All Buffer Salts | Fisher Scientific | N/A | Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc. |
| Protino Glutathione (GSH) agarose | Machery-Nagel | 745500.10 | Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/ |
| Z-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (Zcoum) | Sigma Aldrich | C5429 | www.sigmaaldrich.com |
| Chloroamidine | Cayman Chemical | 10599 | Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP HCl) | Thermo Scientifc | 20490 | http://www.piercenet.com |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
| Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) | N/A | N/A | Purchase from Corning; Sigma-Aldrich |
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software | N/A | N/A | www.tecan.com |
| Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | N/A | N/A | http://www.perkinelmer.com |
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