ניטור קרינה מבוססת פעילות PAD4 באמצעות אנלוגי מצע פרו-הקרינה
Summary
PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.
Abstract
Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.
Introduction
מספר גדול של חלבונים יונקים הם שונה במידה רבה על ידי הפעולה של אנזימים הבאים הסינתזה של חלבונים על ידי הריבוזום. שינויים אלה לאחר translational (PTMs) יכולים להגדיל באופן משמעותי את המגוון הפונקציונלי של proteome על ידי שינוי הגודל, מטען, מבנה, ומדינת oligomerization (בין תכונות אחרות) של חלבוני 1-3. כתוצאה מכך, השינוי במבנה חלבון יכול להוביל לתוצאות פיסיולוגיות, כגון פירוק חלבונים, התמיינות תאים, איתות, אפנון בביטוי גנים, ואינטראקציות בין חלבונים. בעוד שינויים אלה נפוצים באחוז גדול של כל החלבונים האנושיים, המסוף מסתיים בחלבוני היסטון לעבור מספר גבוה מרגיל של שינויים קוולנטיים 4. חלבוני היסטון הם משפחה של חלבונים מבניים המאפשרים העיבוי של הדנ"א הגנומי. שינויים קוולנטיים של זנבות היסטון לא מובנים מתבצעים ומוסדרים על ידי סרייהשל אנזימים שיכולים לזרז את השינוי קוולנטיים של שאריות (סופרים), להפוך את אותם שינויים (מחקים), ולהבחין בין השינויים שהוטבעו על זנבות היסטון (קוראים) 5-7. למעשה, רוב PTMs הידוע ניתן לצפות בקטע קצר זה של היסטון כולל מתילציה, זירחון, acetylation, sumoylation, ubiquitination, וcitrullination 8.
Citrullination כולל ההמרה של peptidyl-ארגינין לRNA t הלא peptidyl-Citrulline המקודד (איור 1 א). החלבונים, אחראים לנטרול שרשרת צד זה, הנם החלק מPAD (עמ 'eptide rginine ד eiminase) משפחת חלבונים, אשר כולם אנזימי סידן תלוי. 9,10. עד כה, חמישה בני משפחת PAD תוארו (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, וPAD6). כל אחד ממשפחה זו מופיעה למקד חלבונים תאיים שונים ומציג גם חדפרופילי הפצת רקמת que. PAD4 הוא החבר היחיד של משפחת חלבון זה ידוע להיות מקומי בתוך הגרעין באמצעות רצף לוקליזציה גרעיני 11. בהתאם לכך, זה הוכח deiminate מספר יעדי גרעין, כוללים שרשרות צד ארגינין על זנבות N- מסוף שאריות ארגינין H2A ההיסטונים 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, וH3R26) וH4 (H4R3) 12, 13. בעוד כל אחד מisozymes PAD יש פונקציות פיסיולוגיות ספציפיות וקריטיות, PAD4 קיבל הרבה יותר תשומת לב בשל תפקידה במספר התהליכים האנושיים בשני תאים חולים ובריאים. לאחרונה, PAD4 הוצג להיות חבר ברשת תעתיק pluripotency 14. שני רמות ביטוי PAD4 והפעילות הוצגו להיות גבוהות במצבי pluripotent תכנות מחדש וקרקע מדינה בעכברים. על ידי שליטה על הרגולציה של גנים בתאי גזע, PAD4 עשוי לשמור תפקיד מרכזי ביעילות תכנות מחדש של תאים. PAD4 גם היה מעורב בהיווצרות מלכודות תאי נויטרופילים, שעל הכריכה של פתוגנים לאפשר פינוי המערכת שלהם. Hypercitrullination של חלבוני היסטון ידי PAD4 גורם decondensation של הכרומטין, המשמש כחומר הבסיס לאנקפסולציה של חיידקים פתוגניים במלכודת תאית, ובכך לבלום את זיהומים חיידקיים 15,16.
בנוסף, PAD4 כבר נמצא לשחק תפקיד פעיל במספר המחלות בבני אדם. זה הוכח בעבר שביטוי חריג של PAD4 קשור עם תחילת וחומרת דלקת מפרקים שגרונית, מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת נפוצה 17. למעשה, הנוכחות של נוגדני חלבון אנטי-citrullinated היא אחד מהסמנים דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים אמינות והמקיפים ביותר של דלקת מפרקים שגרונית 18. כמו כן, פעילות PAD4 dysregulated לאחרונה נצפתה במספר סוגים של סרטן אנושי כוללים השחלות, שד, ריאות,סרטן הוושט ד 19-22. הקשר בין PAD4 והסרטן הוכח להיות מתווך דרך אונקוגן ELK1 או באמצעות החלבון המדכא גידולי p53 22,23 ועבודה קודמת הציעה כי PAD4 יכול להיות יעד נגד סרטן רומן טיפולי 17,24,25. כהוכחה למחקר עיקרון, הדלדול של PAD4 באמצעות shRNA בשורת תאי סרטן המעי הגס HCT116 התגלה כמספיק לגרימת אפופטוזיס ומחזור תא מעצר 26. מעכב PAD4 בלתי הפיך שפותח לאחרונה הביא להפחתת שבעים אחוז במסת גידול בעכברי 27. די להפליא, עיכוב PAD4 הופיע לפעול כטיפול ממוקד שגרם להריגתם בררני של תאים סרטניים מבלי לפגוע בתאי untransformed.
השימוש במולקולות קטנות כדי לכבות את הפונקציה של PAD4 עשויים להיות אסטרטגיה חדשה וחזקה למקד תאים סרטניים או כדי להגדיל chemotherapeutics הסרטן קיים 28. לרוע המזל, ת.ד.מעכב PAD4 הפיך אוהל שעדיין לא התגלה. מספר המעכבים קוולנטיים פותחו באמצעות לורו / ידית imidine fluoro המחקה את מצע ארגינין 27,29,30 והוכיחה להיות כלים מעשיים להבנת תפקידו של PAD4 בשני תאי מצב בריאים וחולים. עם זאת, מולקולות אלה כל הרפידות הפעילים עם עוצמה דומה לעכב. לכן, הצורך בassay קליל שמדווח על הפעילות של PAD4 הוא קריטי. עד כה, PAD4 מבחני תוארו המקשרים השחרור של אמוניה מהתגובה לקריאת colorimetric 31, לנצל אנלוגי מצע chloroamidine שכותרתו fluorescently עבור assay קיטוב הקרינה 32, להסתמך על התגובה בסיוע החומצה בין glyoxal וCitrulline 33, ו כמה פעילות PAD4 לקרינת dequenching צעד 34. מבין אלה, רק אסטרטגית haloacetamidine משנה קוולנטיים הוכיחה להיות תואם עם scre תפוקה גבוההפלטפורמות ening 32,35,36. אנו מתארים assay המבוסס הקרינה קלילה שאמינים מודד את הפעילות של PAD4. Assay, אשר מציג יחס חזק אות לרעש, מהירות של ניתוח, ואת חוסן של מדידה, יש את הפוטנציאל לגלות מעכב PAD4 באמת חזק ובררני.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
| Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| All Buffer Salts | Fisher Scientific | N/A | Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc. |
| Protino Glutathione (GSH) agarose | Machery-Nagel | 745500.10 | Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/ |
| Z-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (Zcoum) | Sigma Aldrich | C5429 | www.sigmaaldrich.com |
| Chloroamidine | Cayman Chemical | 10599 | Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP HCl) | Thermo Scientifc | 20490 | http://www.piercenet.com |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
| Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) | N/A | N/A | Purchase from Corning; Sigma-Aldrich |
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software | N/A | N/A | www.tecan.com |
| Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | N/A | N/A | http://www.perkinelmer.com |
References
- Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
- Sims, R. J., Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
- Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
- Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
- Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
- Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
- Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
- Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
- Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
- Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
- Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
- Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
- Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
- Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
- Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
- Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
- Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
- Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
- Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
- Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
- Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
- Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
- Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
- Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
- Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
- Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
- Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
- Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
- Dreyton, C. J., et al. . Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
- Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).
