Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Eine Vielzahl von Säugetier-Proteine ​​sind stark durch die Wirkung von Enzymen nach der Biosynthese von Proteinen durch das Ribosom modifiziert. Diese post-translationale Modifikationen (PTM) kann die Funktionsvielfalt des Proteoms stark erhöhen, indem Sie die Größe, Ladung, Struktur und Oligomerisierungszustand (neben weiteren Funktionen) von Proteinen ^1-3. Als Ergebnis kann die Änderung in der Proteinstruktur zu physiologischen Folgen, wie Protein-Abbau, Zelldifferenzierung, die Signalisierung, die Modulation der Genexpression und Protein-Protein-Wechselwirkungen führen. Obwohl diese Modifikationen sind weit verbreitet in einer großen Prozentsatz aller menschlichen Proteine, die Anschlußenden von Histonen eine ungewöhnlich hohe Anzahl von kovalenten Modifikationen ⁴ unterzogen. Histon-Proteine ​​sind eine Familie von Strukturproteinen, die die Kondensation von genomischer DNA erleichtern. Kovalente Modifikationen der unstrukturierten Histone werden durch eine Serie durchgeführt und geregelts von Enzymen, die die kovalente Modifikation von Rückständen (Schriftsteller) katalysieren können, kehren Sie die gleichen Modifikationen (Radiergummis) und unterscheiden zwischen den Veränderungen, die auf die Histon-Enden (Leser) ^5-7 druckt. Tatsächlich sind die meisten der bekannten PTMs kann innerhalb dieses kurzen Segment des Histon einschließlich Methylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, sumoylation, Ubiquitinierung und Citrullinierung ⁸ beobachtet werden.

Citrullinierung beinhaltet die Umwandlung von Peptidyl-Arginin in den nicht t-RNA kodiert Peptidyl-Citrullin (1A). Die Proteine, für diese Seitenketten Neutralisierung verantwortlich sind Mitglieder der PAD (p eptide eine rginine d eiminase) Proteinfamilie, die alle calciumabhängigen Enzymen. ^9,10. Bisher fünf Mitglieder der PAD-Familie beschrieben (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 und PAD6). Jedes Mitglied dieser Familie scheint deutliche zelluläre Zielproteine ​​und zeigt auch unique Gewebeverteilungsprofile. PAD4 ist das einzige Mitglied dieser Proteinfamilie bekannt, innerhalb des Kerns über eine Kernlokalisierungssequenz ¹¹ lokalisiert werden. Dementsprechend wurde gezeigt, um eine Anzahl von Kern Ziele, einschließlich Arginin-Seitenketten an den N-Termini von Histonen H2A Argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 und H3R26) und H4 (H4R3) ^{12 deiminate, 13.} Während jede der PAD-Isoenzyme haben spezielle und kritische physiologische Funktionen hat PAD4 erheblich mehr Aufmerksamkeit aufgrund seiner Rolle bei einer Anzahl von menschlichen Prozesse sowohl in kranken und gesunden Zellen erhalten. Vor kurzem wurde gezeigt, PAD4 Mitglied der Pluripotenz Transkriptionsnetzwerk ¹⁴ ist. Beide PAD4 Expressionsniveaus und Aktivität wurde gezeigt, dass während der Umprogrammierung und Grundzustands pluripotenten Zustände bei Mäusen erhöht werden. Durch die Steuerung der Regulierung der Stammzellen Genen kann PAD4 eine zentrale Rolle in der zellulären Anpassung Effizienz beizubehalten. PAD4 wurde auch in den in Verbindung gebrachtBildung von neutrophilen Extracellular Traps, die bei der Bindung von Krankheitserregern ermöglichen ihr System-Clearance. Die hypercitrullination von Histon-Proteinen durch PAD4 induziert Dekondensation des Chromatins, die als Basismaterial für die Verkapselung von pathogenen Bakterien, die durch die extrazelluläre Falle dient, wodurch die Abwehr von bakteriellen Infektionen ^15,16.

Zusätzlich PAD4 wurde gefunden, daß eine aktive Rolle bei einer Reihe von Krankheiten beim Menschen spielen. Es wurde zuvor gezeigt, dass aberrante Expression PAD4 wird mit dem Beginn und die Schwere von rheumatoider Arthritis, Alzheimer, Parkinson-Krankheit und Multiple Sklerose ^17. In der Tat ist die Anwesenheit von Anti-Protein-Antikörper citrullinated ist einer der verlässlichsten und definitive diagnostische und prognostische Biomarker von rheumatoider Arthritis ^18. Ebenso hat dysreguliert PAD4 Aktivität kürzlich in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Eierstock-, Brust-, Lungen-, einer beobachtetd Speiseröhrenkrebs ^19-22. Die Verbindung zwischen PAD4 und Krebs wurde gezeigt, dass durch die ELK1 Onkogen oder über das p53-Tumorsuppressor-Protein ^22,23 vermittelt werden und frühere Arbeiten vorgeschlagen, PAD4 konnte eine neuartige Anti-Krebs therapeutisches Ziel ^17,24,25 sein. Als Beweis des Prinzips Studie wurde die Erschöpfung der PAD4 über shRNA in kolorektalen Krebszelllinie HCT116 ergab ausreichend zur Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest ²⁶ zu sein. Eine kürzlich entwickelte irreversible PAD4 Inhibitor zu einer siebzig Prozent Reduktion der Tumormasse bei Mäusen ^27. Bemerkenswerterweise erschien PAD4 Hemmung als zielgerichtete Therapie, die in selektiven Abtötung von Krebszellen führte unter Schonung nicht transformierten Zellen wirken.

Die Verwendung von kleinen Molekülen zum Ausschalten der Funktion PAD4 könnte sich als eine leistungsfähige neue Strategie gezielt Krebszellen oder an bestehende Krebschemotherapeutika ²⁸ erweitern können. Leider ist ein poZelt reversible PAD4 Inhibitor wurde noch entdeckt zu werden. Eine Reihe von kovalenten Inhibitoren mit der Chlor / Fluor imidine Griff, die Arginin Substrat ^27,29,30 nachahmt und haben sich als praktische Instrumente für das Verständnis der Rolle der PAD4 sowohl bei gesunden und kranken Zustand Zellen entwickelt. Allerdings sind diese Moleküle inhibieren alle aktiven Pads mit ähnlicher Potenz. Daher ist die Notwendigkeit für einen einfachen Test, der auf die Aktivität des PAD4 berichtet entscheidend. Bisher wurden PAD4 Assays beschrieben worden, die die Freisetzung von Ammoniak aus der Reaktion auf einen kolorimetrischen Anzeige ³¹ zu verbinden, verwenden einen fluoreszierend markierten Substrates chloroamidine analog zur Fluoreszenzpolarisationsassay ^32, sich auf die Säure-katalysierten Reaktion zwischen Glyoxal und Citrullin ³³ und Koppeln der PAD4 Aktivität zu einer Fluoreszenz Dequenching Schritt ^34. Davon sind nur die kovalente Modifizierungs haloacetamidine Strategie hat sich mit High-Throughput SCRE kompatibel zu seinkung Plattformen ^32,35,36. Wir beschreiben eine einfache fluoreszenzbasierten Assays, die die Aktivität PAD4 misst zuverlässig. Der Assay, der ein starkes Signal-zu-Rauschverhältnis, die Geschwindigkeit der Analyse und Robustheit der Messung zeigt, hat das Potential, ein wirklich wirksamer und selektiver Inhibitor PAD4 entdecken.