Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence

Un grand nombre de protéines de mammifères sont fortement modifiées par l'action d'enzymes suivant la biosynthèse des protéines par le ribosome. Ces modifications post-traductionnelles (MPT) peuvent augmenter considérablement la diversité fonctionnelle du protéome en changeant la taille, la charge, la structure et l'état d'oligomérisation (entre autres fonctions) de protéines ^1-3. En conséquence, le changement de structure de la protéine peut avoir des conséquences physiologiques, tels que la dégradation des protéines, la différenciation cellulaire, la signalisation, la modulation de l'expression génique, et les interactions protéine-protéine. Bien que ces modifications sont répandues dans un grand pourcentage de toutes les protéines humaines, le terminal se termine sur des protéines histones subissent un nombre anormalement élevé de modifications covalentes ^4. protéines histones sont une famille de protéines de structure qui facilitent la condensation de l'ADN génomique. Des modifications covalentes des queues d'histones non structurées sont effectuées et réglées par une séries d'enzymes capables de catalyser la modification covalente de résidus (écrivains), inverser les mêmes modifications (gommes à effacer), et la distinction entre les changements étant imprimé sur les queues d'histones (lecteurs) ^5-7. En fait, la plupart des PTM connus peut être observé dans ce court segment de l'histone y compris la méthylation, phosphorylation, acétylation, sumoylation, ubiquitination, et citrullination ^8.

Citrullination implique la conversion de peptidyl-arginine de l'ARN t non codé peptidyl-citrulline (figure 1A). Les protéines, responsables de cette neutralisation de la chaîne latérale, sont membres de la PAD (p eptide un d eiminase rginine) famille de protéines, qui sont des enzymes dépendant du calcium. ^9,10. À ce jour, cinq membres de la famille de PAD ont été décrits (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, et PAD6). Chaque membre de cette famille semble cibler des protéines cellulaires distincts et affiche également uniprofils de distribution tissulaire Qué. PAD4 est le seul membre de cette famille de protéines connues pour être localisée dans le noyau par l'intermédiaire d'une séquence de localisation nucléaire ^11. En conséquence, il a été démontré que deiminate un certain nombre de cibles nucléaires, y compris les chaînes latérales d'arginine sur les queues N-terminales des histones H2A arginine résidu 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, et H3R26) et H4 (H4R3) ^{12, 13.} Bien que chacune des isoenzymes de la PAD ont des fonctions physiologiques spécifiques et critiques, PAD4 a reçu beaucoup plus d'attention en raison de son rôle dans un certain nombre de processus humains à la fois les cellules saines et malades. Récemment, PAD4 a été montré pour être un membre du réseau de la transcription de la pluripotence ^14. Les deux niveaux d'expression et de l'activité pAD4 ont été montrés à être élevé lors de la reprogrammation et l'Etat-sol Etats pluripotentes chez la souris. En contrôlant la régulation des gènes de cellules souches, PAD4 peut conserver un rôle central dans l'efficacité de la reprogrammation cellulaire. PAD4 a également été impliquée dans laformation de pièges extracellulaires neutrophiles, qui lors de la liaison des agents pathogènes permettre leur dégagement du système. Le hypercitrullination de protéines histones par PAD4 induit la décondensation de la chromatine, qui sert de matériau de base pour l'encapsulation de bactéries pathogènes par le piège extracellulaires, ainsi éloigner les infections bactériennes ^15,16.

En outre, PAD4 a été trouvé à jouer un rôle actif dans un certain nombre de maladies humaines. Il a été précédemment montré que l'expression aberrante de PAD4 est associé à l'apparition et la gravité de la polyarthrite rhumatoïde, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques et ^17. En fait, la présence d'anticorps anti-protéine est une citrullinés des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques fiables et les plus définitives de la polyarthrite rhumatoïde ^18. De même, l'activité dérégulée PAD4 a récemment été observé dans un certain nombre de cancers humains, y compris de l'ovaire, du sein, du poumon, und cancers de l'œsophage ^19-22. Le lien entre PAD4 et le cancer a été montré être médiée par l'oncogène ELK1 ou via la p53 protéine suppresseur de tumeur et ^22,23 travaux antérieurs ont suggéré que PAD4 pourrait être un anti-cancer cible thérapeutique ^17,24,25. En tant que preuve de principe étude, l'épuisement des PAD4 via shRNA dans la lignée de cellules de cancer colorectal HCT116 a été révélée être suffisante pour induire l'apoptose et arrêt du cycle cellulaire ^26. Inhibiteur irréversible de PAD4 récemment développé a conduit à une réduction de soixante-dix pour cent de la masse tumorale chez les souris ^27. Tout à fait remarquable, PAD4 inhibition semble agir comme une thérapie ciblée qui conduit à une destruction sélective des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules non transformées.

L'utilisation de petites molécules pour désactiver la fonction de PAD4 peut se révéler être une nouvelle stratégie efficace pour cibler les cellules cancéreuses ou d'augmenter les agents chimiothérapeutiques contre le cancer ²⁸ existantes. Malheureusement, un poinhibiteur de PAD4 réversible de la tente n'a pas encore été découvert. Un certain nombre d'inhibiteurs covalents ont été développés en utilisant la chloro / poignée de imidine fluoro qui imite le substrat arginine ^27,29,30 et se sont révélés être des outils pratiques pour comprendre le rôle de PAD4 dans les cellules de l'État sains et malades. Cependant, ces molécules inhibent tous les DPA actifs avec une activité similaire. Par conséquent, la nécessité d'un dosage facile que les rapports sur l'activité de PAD4 est crucial. À ce jour, pAD4 essais ont été décrits qui pointent le rejet de l'ammoniac à partir de la réaction à une lecture colorimétrique ^31, utiliser un analogue de substrat de chloroamidine marqué par fluorescence pour l'analyse de polarisation de fluorescence ^32, compter sur la réaction acide-assistée entre glyoxal et citrulline ^33, et coupler l'activité PAD4 à une fluorescence étape ³⁴ dequenching. Parmi ceux-ci, seul le modificateur de stratégie haloacetamidine covalente est avéré être compatible avec scre à haut débitplates-formes Ening ^32,35,36. Nous décrivons un test basé sur la fluorescence facile qui mesure de façon fiable l'activité de PAD4. L'essai, qui présente un fort rapport signal-sur-bruit, la vitesse d'analyse, et la robustesse de la mesure, est susceptible de découvrir un inhibiteur de PAD4 vraiment puissant et sélectif.