JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

Published: March 28, 2015
doi:
10.3791/52067
, , , ,
1National Exposure Research Laboratory,U.S Environmental Protection Agency, 2Technical Support Center, Office of Ground Water and Drinking Water,U.S Environmental Protection Agency

Summary

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

Abstract

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

Introduction

וירוסי enteric אדם לשכפל בתוך מערכת העיכול ומתפשטים באמצעות מחזור הצואה-פה. וירוסים אלה נמצאים לעתים קרובות בשפכים בריכוזים גבוהים 1-3. הם יכולים להתמיד בשפכי ביוב 4,5, ובמשטח 6,7, קרקע 8-10, והתייחסו שתיית מים 11. כאשר קיימים, הריכוז של וירוס במים הסביבתיים בארה"ב בדרך כלל נמוך מדי למדידה ישירה 12,13. זה דורש שוירוסים להיות מרוכזים מכמויות גדולות של מים. במהלך איסוף המידע כלל (ICR) ניטור שנערך על ידי הסוכנות האמריקנית להגנת הסביבה (USEPA) 14, ריכוזי הווירוס של דגימות חיוביות במי המקור של כלי עזר גדולים נעו בפריסה ארצית .009-19.7 מספר הסביר ביותר של יחידות זיהומיות (MPN) / L. ריכוזי חציון והממוצעים של דגימות חיוביות היו 0.03 ו 0.17 MPN / L למי מקור מנחלים זורמים, 0.010.07 MPN / L למי מאגמים ומאגרי מים, ו0.04-0.74 MPN / L של אלה המשתמשים groundwaters 11 (נתונים מבסיס נתוני גישת 18 חודש מיום ICR Aux1 2000/04/25). ריכוזי וירוס של דגימות חיוביות ממחקר USEPA של groundwaters הלאומי נעו .009-2.12 יחידות מדבקות / L עם חציון וריכוזים ממוצעים של 0.13 ו0.29 יחידות מדבקות / L 8. הריכוז של וירוס בדגימות מי תהום חיוביות היה גבוה יותר מאלו בנחלים זורמים. רוב המתקנים באמצעות מי תהום במחקרים אלה הושגו מים מאקוויפרים הממוקמים באזורי הקארסט. אלה, יחד עם אלה הממוקמים באבן גיר וגבישי הגדרות (סלע שבר) עשויים להיות להם ריכוזי וירוס גבוהים יותר מאשר בהגדרות אחרות 8,15,16. שיטות וירוס USEPA לציין כרכי דגימה של 200 L (ICR) 300 L (שיטת 1,615) של מים עיליים ו1,000 L (ICR) ל -1,500 ליטר (שיטת 1,615) של מי תהום 17,18. עם זאת, אפילו עם השימוש בכרכי מדגם גדולים, רוב דגימות פני השטח ומי תהום הן שליליות לנגיף 8,11,19,20.

וירוסים הנמצאים במים עיליים מהווים סיכון בריאותי פוטנציאלי לצרכנים של מי שתייה. Surface טיפול במים כלל מחייב את כל מתקני הטיפול באמצעות מים עיליים להפחתת ריכוזי נגיף על ידי לפחות 4 log-. אפילו עם ירידת 4 log-, ריכוזי וירוס מדבקים במי מקור קטנים כמו .0044 MPN / L עלולים להוביל לזיהום אחד ליום בהנחה כגון תנאי חשיפה וטיפול ממוצע ופרמטרי תגובת המינון לרוטה-וירוס 11,21. הסיכון מהווירוס בgroundwaters שלא טופל עלול להיות גדול עוד יותר בשל חוסר הטיפול והתרחשות ויראלי. Borchardt ועמיתים מעריכים כי עד 22% מקיבה והמעיים חריפים במבוגרים ו -63% בילדים פחות מחמש שנים יכולות להיות בגלל הווירוס במי שתייה בקהילות באמצעות groundwaters שלא טופל 19.

USEPA Method 1,615 פותח כדי לזהות enterovirus וnorovirus במהלך מחזור הניטור השלישי של תקנת הניטור המזהם ללא פיקוח (UCMR3) 22 כלאומי מעקב לממצאי Borchardt ועמיתי 19,23. שיטת USEPA נועדה בעיקר למדידת וירוס במערכות באמצעות groundwaters שלא טופל, אך נכתבה באופן כללי יותר לכוללת סוגים אחרים מטריצת מים. השיטה החדשה היא היברידית שימור מרכיבים רבים משיטת הווירוס הקודמת שימשה במהלך ICR 17, התוספת של נהלים מולקולריים המבוססת על השיטה של Borchardt et al. 19,23, וערכות פריימר נוספות לnorovirus 24. מטרת מאמר זה היא לתאר את הליך דגימה ואת הצעדים הדרושים כדי לשמור על שלמות המדגם במהלך איסוף ומשלוח. הערכה של השיטה הכוללת מתוארת בet al Cashdollar. 25. פרוטוקול זה מכסה collectio שדה פשוטn של מים עיליים והקרקע שבה משאבה וprefilter אינם נחוצות ושבו התאמות אינן נדרשות לpH או הנוכחות של חומר חיטוי במים שנדגמו. דרישות הדגימה מורכבות יותר מתוארות בet al Fout. 17,18.

Protocol

1. נהלים ראשוניים להרכיב מכשירי סינון סטנדרטיים כפי שמוצג באיור 1 בהיקף של מודול הצריכה, מודול דיור מחסנית, ומודול שחרור כפי שתוארו בחומרים נוספים. לכייל את המד / totalizer הזרימה בספיקות המשמשות לדגימה לפני השימוש הראשון. בדוק את הכיול לאחר השימוש הראשון ולאחר מכן לאחר חודש של שימוש. אם כיול קצב הזרימה השתנה לאחר או השימוש הראשון או לאחר החודש הראשון של שימוש, לקבוע את התדירות לבדיקות כיול כמתואר בחומרים נוספים. חבר מודול פריקה למודול הצריכה ולאחר מכן חבר את מודול הצריכה לברז. הגדר את המטר / totalizer הזרימה לקרוא את קצב הזרימה. הפעל את ברז לחלוטין ולאחר מכן להתאים את קצב הזרימה עד 10 L / min באמצעות שסתום גלובוס ברונזה. ברגע שקצב הזרימה יציב של 10 L / min, לאפס את המד / totalizer הזרימה לקרוא נפח כולל. הנח את החוצהבואו של מודול הזרמה לL 4 או יותר סיימתי גליל ובו-זמנית לאפס totalizer לאפס. מדוד את קריאת totalizer בסימן 4 L-ואת הזמן הנדרש כדי להגיע לסימן 4 L על הגליל. לשנות את המטר / totalizer זרימת הגדרה חזרה לקצב זרימה. הערה: אם קצב זרימת ירד אל מתחת ל 9.95 L או עלה ליותר מ 10.05 L לאחר שסיים את שלב 1.2.2, לחכות עד שקצב הזרימה הוא שלב יציב וחזור על 1.2.2. מטר מכויל כראוי יגיע סימן 4 L בגליל סיים ב 24 ± 1 שניות עם קריאת totalizer של 4.0 ± 0.04 ל ' אם קריאת totalizer היא פחות מ 3.96 או יותר מ 4.04 L, לחשב גורם תיקון הדרוש כדי להתאים את ההבדל שנצפה. לדוגמא, אם המטר / totalizer הזרימה קוראת 3.9 L בסימן 4 L בגליל סיים, גורם התיקון יהיה 1.026 (4 ÷ 3.9). לכן, אם הנפח הרצוי של מדגם שדה היה 300 L, אסף את הנפח פי reading על המטר / totalizer הזרימה צריכה להיות 300 מעלות 1.026 = 292.4 L. לעקר את מנגנון הסינון הסטנדרטי ולהכין אותו לאיסוף דגימה. לעקר את המודולים דיור הצריכה ומחסנית עם .525% היפוכלוריט נתרן לפחות 30 דקות לפני כל שימוש על ידי הטבילה באופן מלא את המודולים בפתרונות או על ידי במחזור hypochlorite נתרן אם כי מודולים באמצעות משאבה. יש לשטוף את המודולים עם סטרילי DH 2 O ולאחר מכן dechlorinate בתמיסה המכילה 50 מיליליטר של 1 thiosulfate M נתרן לליטר המים כיתה מגיב סטרילי במשך 5 דקות. מכסה את מודול מנגנון דגימת המסנן מסתיים ברדיד אלומיניום סטרילי. הוספת מסנן מחסנית electropositive לסביבה נקיה מחיידקי מודול דיור המחסנית. הערה: תשמור על מנת להבטיח שמסנן המחסנית יושב כראוי את מעטה. כראוי מסננים יושבים לא ידלפו והמסנן לא יעבור בתוך הדיור כאשר מזועזע. האטמים על aproperly מסנן יושב יהיה חריצים גלויים מראים אם במגעים מסננם. האטמים תמיד צריכים להיבדק לחריצים מייד לאחר הסינון הוא להסיר את הדיור. להקליט מספר מדגם ייחודי בגיליון נתוני מדגם (ראה נוספים חומרים לדוגמא) ולאחר מכן לקחת או לשלוח את מכשיר דגימת מסנן וגיליון נתונים לדוגמא לאדם שיהיה איסוף דגימת השדה, יחד עם כל הוראות הדרושות בנוגע למדגם אוסף (לדוגמא, נפח דגימה, מיקום דגימה, וכו '). 2. הכנה לאוסף דוגמאות באתר הדגימה שטוף את הידיים בעת הגעה לאתר האיסוף ודון כפפות מנתחים כדי למזער את האפשרות של זיהום מדגם. אל תאספו דגימות אם חווים תסמיני מעי או בדרכי הנשימה. שנת כפפות בתדירות גבוהה, ובמיוחד לאחר שנגע ברזי מים ופריטים אחרים שעשויות להיות המשךaminated. מדגם רלוונטי שיא מעקב אחר מידע על גיליון נתונים לדוגמה. מידע רלוונטי כולל אתר וזיהוי מדגם, שמו של דגם, ודגמי ציוד ומספרים סידוריים. הפעל את ברז המים במשך 2-3 דקות כדי לנקות את כל פסולת שהתיישבה בשורה. במידת צורך, להשתמש בצינור גינה או צינורות כדי להגיע לטמיון במהלך שלב זה. אם מודולים מנגנון הדגימה מחוברים, נתק אותם ולהגן על הקצוות הפתוחים של מודול דיור המחסנית בנייר סטרילי. חבר את מודול ההזרמה למודול הצריכה ולאחר מכן לחבר את שני לברז המים. חבר צינור גינה בסופו של מודול הפריקה ולמקם את הקצה החופשי במכל פוליפרופילן 1 ליטר. הפעל את הברז ולהעביר לפחות 75 ליטר של המים שנדגמו באמצעות המנגנון. מדוד ורשום את הפרמטרים של איכות מים בתקופת הסומק במים זורמות לתוך מיכל resid כלור פוליפרופילןרע"מ, pH, טמפרטורה, ועכירות. לאחר כיבוי במים בברז, נתק את מודול השחרור ממודול הצריכה, ולאחר מכן חבר את מודול דיור מחסנית ליציאה של מודול הצריכה ואת מודול ההזרמה ליציאה של מודול דיור מחסנית. איפוס totalizer קריאה לאפס. אוסף דוגמאות 3. שדה רשום את קריאת totalizer הראשונית יחד עם התאריך והשעה ולאחר מכן פתח את ברז המים באיטיות. ודא שמחסנית הדיור הוא בתנוחה זקופה ושימלא לחלוטין במים. יש לי מעטה חלקן פורקן אשר יכול להיות לחוץ למוציא אוויר מהדיור במהלך תהליך המילוי. פתח את הברז לחלוטין. התאם את קצב הזרימה עד 10 L / min באמצעות שסתום גלובוס ברונזה ואז להקליט את קצב הזרימה הראשוני. לעבור 300 ליטר של מים עיליים או 1,500 ל -1,800 ליטר של מי תהום באמצעות המנגנון באמצעותקריאות totalizer (כפי שהותאם, במידת צורך). אם קבקבי המסנן לפני הנפח הנדרש הוא הגיע ויותר ממחצית הנפח נאסף, להשתמש במודול בית מסנן שני כדי לאסוף את המדגם שנותר, אם זמין. שים לב לקצב הזרימה כנפח הדגימה מתקרב לסוף תקופת הדגימה ולאחר מכן לכבות את זרימת מים בברז המדגם. רשום את קצב הזרימה הסופי, תאריך, השעה ביום, קריאת totalizer הסופית, ונפח הדגימה הכולל. נתק את מכשיר דגימת מסנן מהברז. נתק את מודול דיור מחסנית ממודולים האחרים. הפעל בית המסנן (ים) במהופך ולאפשר למים לזרום החוצה עודפים עד לא יותר מים יהיה לנקז משתי יציאות הכניסה ויציאה. הפעל הדיור זקוף ולכסות את החיבור מהיר בכל קצה ברדיד אלומיניום סטרילי. הנח את הדיור לשקיות פלסטיק סגר אחד או יותר. מסננים את המים מהצריכה ודמודולים ischarge. הנח את המודולים לשקיות פלסטיק סגר אחד או יותר. 4. משלוח של דוגמאות שדה הנח את המודולים מנגנון דגימת מסנן למקרר אחסון והובלה מבודד. להוסיף שקיות קרח קפוא או קוביות קרח כפולות שטיח עטוף לאחסון והובלה קריר כדי להבטיח כי המדגם נותר בין 1-10 מעלות צלזיוס במהלך משלוח. שתי גדולים או 6-8 שקיות קרח קטנות צריכה להיות מספיק. מניחים את מכשיר הקלטה בטמפרטורה באחסון המבודד וחזה תחבורה במיקום ללא קשר לשקיות קרח או שקיות קרח. הערה: מכשיר טמפרטורת ההקלטה הוא אופציונאלי אם המעבדה האנליטית תהיה באמצעות מדחום אינפרא אדום חזותי כדי למדוד את הטמפרטורה של דיור המחסנית מייד עם הגעה והפתיחה של המכל. למלא את כל חלל הריק עם חומרי אריזה ולאחר מכן למקם את גיליון נתוני מדגם, מוגן בשקית ניילון סגר, על top. סגור את האחסון מבודד וחזה תחבורה וקלטתו כדי למנוע כל דליפה של מים. תחבורה או לשלוח את הדגימה למעבדה האנליטית. ודא כי המדגם מגיע למעבדה האנליטית לא יאוחר מ -24 שעות לאחר תחילת איסוף דגימת שדה (כלומר, הזמן שנרשם בשלב 3.1).

Representative Results

סתימת מסנן היא בעיה פוטנציאלית גדולה שניתן נתקלה עם שיטת 1615. סתימה מקטינה את קצב הזרימה של מים דרך המסנן. בחלק מהמקרים ניתן להתגבר על ידי פתיחת שסתום הגלובוס כדי לאפשר זרימה גדולה יותר. במקרים אחרים המסנן להיות סתום לחלוטין לפני הנפח הנדרש עבר דרכו. טבלת 1 מציגה את אחוז הדגימות עם כרכים מופחתים כפונקציה של סוג המסנן, סוג מים, ועכירות. סתימה התרחשה עם דגימות שניהם מי תהום ומים עיליים, עם המסנן מבוסס nanofiber תחמוצת האלומיניום יעלה בביצועי המסנן האמין מבוססת הרבעונים לדגימות מי תהום ואילו ההפוך היה במקרה של דגימות מים עיליות. בסך הכל, 6% מהדגימות שנאספו באמצעות המסנן אמין מבוסס רבעונים היו לקויים בהיקף גדול, תוך 10% מהדגימות שנאספו עם המסננים המבוססים על תחמוצת אלומיניום nanofiber לא עמדו במינימום הנדרש שצוין הנפח עקב סתימה. בgeneral, סתימה גדל עם עכירות, אבל מספר הרכיבים שונים תורם לעכירות וחלק מאלה לא יובילו לסתימה. לדוגמא, 43% מכל האירועים המתרחשים סתימה במהלך מחקר ICR היו מוגבלים לשתי מערכות נהר (מידע לא מוצג). במהלך ICR מינימום נפח היעד למים עיליים היה 200 ל 'הנפח הממוצע שנאסף במהלך המחקר היה L 217 ± 32 עם נפח ממוצע של 208 L (נתונים מבסיס נתוני גישת 18 חודש מיום ICR Aux1 2000/04/25) . לפיכך, מלא נפח ניתן לאסוף ממים רבים אפילו גבוה turbidities. ICR נדרש דוגמים להשתמש prefilter כאשר turbidities היה מעל 75 NTU, אבל גם עם prefilter, 34% מהדגימות שנאספו במים עם turbidities מעל 75 NTU סתום. שיטה 1,615 ממליצה על השימוש בprefilter עם מים מעל 50 NTU; עם זאת, מאז פרסום השיטה 1615, מספר אפשרויות prefilter שונות בנוסף לכך רשום בשיטה היונבדק. אף אחד מאלה הביא לשיפור משמעותי בנפח דגימה (מידע לא מוצג). איור 1. מכשירי סינון רגילים. מנגנון המסנן הסטנדרטי מורכב מהצריכה, בית המסנן, ומודולים פריקה (ראה נוספים חומרים לתיאור של כל מודול). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. סה"כ דוגמאות מספר b דוגמאות הלקויה דוגמאות לקויות אחוזים עכירות (NTU) מי תהום באמצעות NanoCeram ג מסננים 113 1 1 <20 מים עיליים באמצעות ג מסנני NanoCeram 83 12 14 <20 ד 8 4 50 20 – <50 6 5 83 ≥ 50 ד סה"כ ג NanoCeram 210 22 10 ≥ 0 מי תהום באמצעות ג מסנני 1MDS 374 75 20 <20 שלוחה-align: מרכז "> מים עיליים באמצעות ג מסנני 1MDS 2,693 27 1 דואר <20 דואר 505 36 7 ו 20 – <50 f 122 19 16 דואר 50 – <75 g 175 60 34 E, F ≥ 75 E, F, G ג סה"כ 1MDS 3,869 217 6 ≥ 0 קיבולת סינון טבלת 1. דוגמאות מהמחקרים הבאים שממנו נפח הנתונים ועכירות זמינים:. 1) מחקר ICR של USEPA (נתונים מבסיס נתוני גישת 18 חודש מיום 4/2 ICR Aux15/2000), 2) מחקר מי תהום USEPA 8, 3) USEPA לורנס וואל,, 4) USEPA נהר המיסיסיפי מחקר מחקר MA (נתונים שלא פורסמו) (נתונים שלא פורסמו), 5) מחקר מתקן לטיפול במי שתיית USEPA (נתונים שלא פורסמו), USEPA שיטת 1,615 מחקר הערכה 25, ו -6) 7) בשלושת החודשים הראשונים של ניטור UCMR3 (נתונים שלא פורסם). דוגמאות b בי המסנן סתום לפני ההיקף המינימאלי של מים שנקבעו לכל מחקר נאסף. זה היה 200 L למים עיליים ו1,500 L לgroundwaters, אבל היה 200 L למי מקור שהיו מי תהום מתחת לICR USEPA ו1,893 L לחקר תהום USEPA. ג היכולת לאסוף המינימום המלא צוין נפח הוא שונה באופן משמעותי ל דגימות שנאספו באמצעות NanoCeram ומסנני 1MDS (P = 0.002) ובין מים העיליים וgroundwaters שתי כולל (P <0.001) ולכל סוג מסנן (P <0.001) באמצעות בדיקת מאן-ויטני הדרגה הסכום. d & #8211; g קבוצות עם אותו הערך עילי שונות באופן משמעותי (P <0.05) על פי ניתוח קרוסקל-ווליס דרך אחת של שונות במבחן דרגות וPairwise השוואת הנוהל המרובים של דאן. לכל המבחנים הסטטיסטיים המשתנה התלוי הוא הנפח עבר דרך המסנן כחלק של המינימום שצוין הנפח, אבל עם ערך מקסימאלי של 1.0.

Discussion

סוגי מסנן שונים לריכוז וירוסים ממים הסביבתיים כבר בשימוש במשך השנים 26. שיטות קיימים כיום מעסיקות 27 ultrafilters, מסנני אלקטרו 13,28,29, מסנני צמר זכוכית 23, ומסנני electropositive 30. מסנני אלקטרו היו בשימוש נרחב במשך שנים רבות, אך דרישה לתוספת של מלח והתאמת pH המים בתחום לפני או במהלך הדגימה מגבילה את השימושיות שלהם 13. בחירת המסנן המעשית ביותר לדגימת שדה היא מסנני electropositive. מסננים אלה מאפשרים הדגימה של כמויות גדולות של מים בספיקה גבוהה וללא כל תניה של המים. מסנני צמר זכוכית הם האופציה הפחות יקרה, אבל יש לי ספיקות איטיות יותר ממסנני electropositive ואינם זמינים באופן מסחרי. Ultrafilters לספק ההחלמה הווירוס הגבוהה ביותר על פני טווח גדול של איכות מים, אך הציוד דרוש לשם sampling לא מתקיים שדה נייד ואת הזמן הנדרש כדי לאסוף דגימות הוא הרבה יותר 27. שיטות לאחרונה פותחו כי שימוש preconditioned מסנני אלקטרו, כדי למנוע את הצורך בהתאמה בתחום, אבל אלה לא יכולים להיות ישימים לאיסוף כרכי מדגם גדול 28,29.

EPA שיטה 1,615 משתמשת במסנני מחסנית electropositive אשר להשיג מטען החיובי שלהם משני nanofibers תחמוצת אלומיניום או אמינים רבעונים. היתרונות של הראשונה על פני האחרונה הוא שזה פחות יקר ויעילות אוסף וירוס ממים על פני טווח רחב יותר של pH הטבעי ערכי 30,31; עם זאת, כל מחסנית, כמו גם את מסנני צמר זכוכית בשימוש על ידי Borchardt ועמיתים לתת החלמה דומה של enterovirus וnorovirus מ23,31,32 מים (Cashdollar, נתונים שלא פורסמו). מסנני מחסנית ממוקמים לתוך מנגנון דגימה פשוט שנועד לפשט את איסוף דגימותולהפחית את הזיהום במהלך דגימה.

שיטות סטנדרטיים הן לא יסולא בפז, כאשר מחקרים גדולים שנערכו באמצעות מעבדות אנליטיות מרובות. EPA שיטת 1,615 קובעת נהלים והדרכה כדי למזער את שתי סוגיות אוסף מדגם גדולות שיכול להשפיע על נתונים שנאספו במהלך אלה סטנדרטיים לימודים-שווא תוצאות חיוביות הנובעות מזיהום במהלך איסוף דגימה או מרכיבים כראוי חיטוי מכשיר, והסתימה נקבוביות סינון לפי רכיבים ב שנדגמו המים.

בדיוק כפי שניתן להפיץ וירוסי enteric אדם לאדם בשל היגיינה לקויה, יכולים להיות הציגו וירוסים לתוך דגימות מהידיים או כפות הידיים שטפו היטב עם כפפות מזוהמות 33. זה חיוני כי דוגמים להבין את המסלולים האפשריים של זיהום ולהשתמש בטכניקת ספטית בדגימה. דוגמים צריכים להבין כי כפפות משמשות בעיקר כדי להגן על סמפלר מחשיפה ולא protect המנגנון מזיהום. יש לשטוף ידיים לפני תחילת הדגימה ויש להקפיד במהלך עוטת כפפות כדי למנוע יד לכפפת זיהום. דוגמים עם סימפטומים במערכת עיכול או בדרכי הנשימה אסור לאסוף דגימות, כפי שהם יכולים להיות שפיכת enteroviruses או noroviruses ברמות גבוהות.

שנית, יש להקפיד כדי למנוע שריד של וירוס מאירועי דגימה קודמים. כדי למזער את המקור פוטנציאלי של זיהום, מנגנון הדגימה בשיטה 1,615 שונה מזה של ICR על ידי לא כולל ווסת לחץ ומד לחץ בין הכניסה ומודול דיור מחסנית. רכיבים אלו הוסרו בגלל הלחצים שנצפו במהלך אירועי דגימה תמיד היו מתחת לדירוג המרבי הדיור (למשל, 125 psi למבני מחסנית 5 אינץ ') ובגלל שהם היו קשים לחיטוי. הבעיה האחרונה הודגמה באמצעות פקדים ריקים ציוד בstudies לאחר ICR 6,20. המידה שבה זה השפיע על נתוני ICR אינם ידוע, אך עשוי קטן; היו רק שתי דוגמאות שליליות חיוביות כוזבות הערכת ביצועים במהלך המחקר (מידע לא מוצג). כדי לצמצם את האפשרות של זיהום שריד נוסף, מומלץ גם שצינורות מודול הכניסה יוחלפו לאחר כל אירוע דגימה. זה חשוב במיוחד על מנת להבטיח חיטוי נאות אם המנגנון שימש לבקרת איכות או ביצועים שנזרעה עם וירוס. קודם לביצוע חיטוי, הריכוז של כלור חופשי יש למדוד לכל אובדן במהלך האחסון. בנוסף לשינויים בתצורה של המנגנון שתואר לעיל, הוא חיוני, כי חסר ציוד רגיל לרוץ להפגין החיטוי כי הוא יעיל. שיטת 1,615 מנדטים שחסרי ציוד להתבצע באמצעות מנגנונים שכבר לחטא לאחר שמשמש לבקרת וירוס-זרע, ובכך לפשטההליך על ידי ביטול הצורך לעבור פתרון וירוס זרע באמצעות המנגנון לפני החיטוי. הריכוז של חומר חיטוי הוגדל ל .525 היפוכלוריט% לשיטה 1615, כפי שנדרש ריכוז זה הן כדי להשבית כל וירוסי קיימא על הציוד ולהשפיל חומצות גרעין. לכן, חסר ציוד חייב להיות מנותח בשתי תרבית תאים ומבחני qPCR.

שני הסוגים של מסנני electropositive היו כפופים לסתימה במחקרים שדווחו בטבלה 1. מספר לא ידועים של דגימות עם כרכים מופחתים אולי בשל טעויות דגימה, כגון הבנה מוטעית של totalizer או עצירה מוקדמת מכוונת של דגימה לפגוש עוד מועד אחרון, במיוחד למים עם קריאות עכירות פחות מ -20 NTU. התואר של סתימה תלוי הן בפרמטרי סוג המסנן ואיכות מים. Prefilters לספק מידה מסוימת של שיפור, אבל אם משתמש בו, צריך להיות מעובד ומנותחבנפרד ממסנן electropositive. ההמלצה הנוכחית לUCMR3 היא שהמדגם ייאסף ללא prefilters באמצעות מסננים מבוססי nanofiber תחמוצת אלומיניום שני אם לפחות מחצית מהנפח יכול להיות שנאסף באמצעות המסנן הראשון.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים אנשי המשרד לאיכות הסביבה רבים שתרומות שנעשו הניטור שנערך בICR וUCMR3 האפשרי, החוקרים הבאים הראשיים של מחקרים אחרים דיווחו EPA: דניאל "יהקירת', אלפרד דופור, אנדריי Egorov, סוזן Glassmeyer, Asja Korajkic, ריצ'רד ליברמן, רוברט Safferman, וטים ווייד; ושאנון גריפין ומייקל וייר ללאור כתב היד הזה. המחברים מודים עבודות המים ההודים היל לשימוש באחד מבתי משאבתם להפגין איסוף דגימה. למרות שעבודה זו נסקרה על ידי USEPA ואושרה לפרסום, זה לא בהכרח משקף את מדיניות הסוכנות רשמית. אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מהווה אישור או המלצה לשימוש.

Materials

Name of the reagent/Equipment Company Catalogue number Comments/Description
1-L polypropylene bottle Nalgene 2104-0032
Aluminum foil squares Cole-Parmer 06275-40
Autoclave Steris Amsco Lab Series
Bubble wrap U.S. Plastics 50776
Closable bag Uline S-12283
Closable bag Fisher Scientific S31798C
Commercial ice packs Cole-Parmer 06345-20
Cool safe box Diversified Biotech CSF-BOX
Gauze sponge Fisher Scientific 22-415-469
Graduated cylinder Cole-Parmer 06135-90 4-L or larger
Hype Wipe Fisher Scientific 14-412-56
iButtons temperature data logger Maxim DS1921G
Insulated storage and transport chest Fisher Scientific 11-676-12
Packing tape U.S. Plastics 50083
Portable chlorine colorimeter II test kit Hach 5870062
Portable pH and temperature probe Omega PHH-830
Portable turbidity meter Omega TRB-2020-E
PTFE thread tape Cole-Parmer 08270-34 Use on all threaded connections
Pump, Centrifugal Magnetic Drive Cole-Parmer 72010-20
Reduction nipple Cole-Parmer 06349-87
Sodium hypochlorite (NaClO) Use locally available household bleach
Sodium thiosulfate (Na2S2O3) Sigma Aldrich 217247
Surgical gloves Fisher Scientific 19-058-800
Waterproof marker Fisher Scientific 22-290546
Media Composition
0.525% sodium hypochlorite (NaClO) Prepare a 0.525% NaClO solution by diluting household bleach 1:10 in dH2O.  Store 0.525% NaClO solutions for up to 1 week at room temperature.
1 M sodium thiosulfate (Na2S2O3) pentahydrate Prepare a 1 M solution by dissolving 248.2 g of Na2S2O3 in 1 L of dH2O.  Store sodium thiosulfate for up to 6 months at room temperature.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katayama, H., et al. One-year monthly quantitative survey of noroviruses, enteroviruses, and adenoviruses in wastewater collected from six plants in Japan. Water Res. 42 (6-7), 1441-1448 (2008).
  2. La Rosa, G., Pourshaban, M., Iaconelli, M., Muscillo, M. Quantitative real-time PCR of enteric viruses in influent and effluent samples from wastewater treatment plants in Italy. Annali Dell Istituto Superiore Di Sanita. 46 (3), 266-273 (2010).
  3. Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994 to december 2002. Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (1994).
  4. Berg, H., Lodder, W., van der Poel, W., Vennema, H., de Roda Husman, A. M. Genetic diversity of noroviruses in raw and treated sewage water. Res Microbiol. 156 (4), 532-540 (2005).
  5. Haramoto, E., et al. Seasonal profiles of human noroviruses and indicator bacteria in a wastewater treatment plant in Tokyo, Japan. Water Sci Technol. 54 (11-12), 301-308 (2006).
  6. Denis-Mize, K., Fout, G. S., Dahling, D. R., Francy, D. S. Detection of human enteric viruses in stream water with RT-PCR and cell culture. J Water Health. 2 (1), 37-47 (2004).
  7. Hamza, I. A., Jurzik, L., Stang, A., Sure, K., Uberla, K., Wilhelm, M. Detection of human viruses in rivers of a densly-populated area in Germany using a virus adsorption elution method optimized for PCR analyses. Water Res. 43 (10), 2657-2668 (2009).
  8. Lieberman, R. J., et al. . Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , (2002).
  9. Parshionikar, S. U., et al. Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus. Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).
  10. Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort. Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).
  11. Shaw, S., Regli, S., Chen, J., Maguire, M. J., McLain, J. L., Odolensky, A. Virus occurrence and health risks in drinking water. Information Collection Rule Data Analysis. , 437-462 (2002).
  12. Sobsey, M. D., Wallis, C., Henderson, M., Melnick, J. L. Concentration of Enteroviruses from Large Volumes of Water. Appl Microbiol. 26 (4), 529-534 (1973).
  13. Hill, W. F., Akin, E. W., Benton, W. H., Metcalf, T. G. Virus in water. II. Evaluation of membrane cartridge filters for recovering low multiplicities of poliovirus from water. Appl Microbiol. 23 (5), 880-888 (1972).
  14. USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. Federal Register. 61 (94), 141 (1996).
  15. Pang, L. Microbial removal rates in subsurface media estimated from published studies of field experiments and large intact soil cores. J Environ Qual. 38 (4), 1531-1559 (2009).
  16. Johnson, T. B., et al. Viruses and Bacteria in Karst and Fractured Rock Aquifers in East. Ground Water. 49 (1), 98-110 (2011).
  17. Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. . ICR Microbial Laboratory Manual. , (1996).
  18. Fout, G. S., et al. . Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR. , 1-91 (2012).
  19. Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness. Environ Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).
  20. Francy, D. S., Bushon, R. N., Stopar, J., Luzano, E. J., Fout, G. S. Scientific Investigations Report 2004-5219, U.S. Geological Survey. Environmental factors and chemical and microbiological water-quality constituents related to the presence of enteric viruses in ground water from small public water supplies in southeastern Michigan. , 1-54 (2004).
  21. Regli, S., Rose, J. B., Haas, C. N., Gerba, C. P. Modeling the Risk from Giardia and Viruses in Drinking-Water. Journal American Water Works Association. 83 (11), 76-84 (1991).
  22. USEPA. Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems; Final Rule. Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).
  23. Lambertini, E., Spencer, S. K., Bertz, P. D., Loge, F. J., Kieke, B. A., Borchardt, M. A. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).
  24. Butot, S., Le Guyader, F. S., Krol, J., Putallaz, T., Amoroso, R., Sanchez, G. Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus. J Virol Methods. 167 (1), 90-94 (2010).
  25. Cashdollar, J. L., et al. Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water. Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).
  26. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).
  27. Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. J Virol Methods. 176 (1-2), 38-45 (2011).
  28. Katayama, H., Shimasaki, A., Ohgaki, S. Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and norwalk virus from coastal seawater. Appl. Environ. Microbiol. 68 (3), 1033-1039 (2002).
  29. Haramoto, E., Katayama, H., Utagawa, E., Ohgaki, S. Recovery of human norovirus from water by virus concentration methods. J Virol Methods. 160 (1-2), 206-209 (2009).
  30. Sobsey, M. D., Jones, B. L. Concentration of poliovirus from tap water using positively charged microporous filters. Appl. Environ. Microbiol. 37 (3), 588-595 (1979).
  31. Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).
  32. Ko, G., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. J Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).
  33. Liu, P., et al. Laboratory Evidence of Norwalk Virus Contamination Levels on the Hands of Infected Individuals. Appl. Environ. Microbiol. 79 (24), 7875-7881 (2013).

Tags

EPA Method 1615EnterovirusNorovirusVirus SamplingElectropositive Cartridge FilterSurface WaterFinished/ground WaterFilter CloggingTurbidity

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fout, G. S., Cashdollar, J. L., Varughese, E. A., Parshionikar, S. U., Grimm, A. C. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples. J. Vis. Exp. (97), e52067, doi:10.3791/52067 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image