EPA الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية ونوروفيروس حدوثها في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. I. جمع عينات الفيروسات
Summary
EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.
Abstract
EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.
Introduction
الفيروسات المعوية الإنسان تكرار داخل الجهاز الهضمي وتنتشر من خلال الفم برازي الطريق. وغالبا ما توجد هذه الفيروسات في مياه الصرف الصحي في تركيزات عالية 1-3. ويمكن أن تستمر في نفايات مياه المجارير 4،5، وفي سطح 6،7، 8-10 الأرض، وتعامل شرب المياه 11. عندما تكون موجودة، وتركيز الفيروس في المياه البيئية في الولايات المتحدة هو عادة منخفضة جدا لقياس المباشر 12،13. وهذا يتطلب أن الفيروسات أن تتركز من كميات كبيرة من المياه. خلال جمع المعلومات القاعدة (ICR) الرصد التي تقوم بها وكالة حماية البيئة الأمريكية (USEPA) 14، وتركيزات فيروس من عينات إيجابية في الماء مصدر من المرافق كبيرة تراوحت البلاد ،009-19،7 الرقم الأكثر احتمالا من وحدات المعدية (MPN) / L. وكانت تركيزات متوسط ومتوسط العينات الإيجابية 0.03 و 0.17 MPN / L للمياه مصدر من مصادر المتدفقة، 0.01إلى 0.07 MPN / L لأولئك من البحيرات والخزانات، و0،04-0،74 MPN / L لأولئك الذين يستخدمون المياه الجوفية 11 (البيانات من قاعدة بيانات الوصول ICR Aux1 18 شهرا بتاريخ 2000/4/25). وتراوحت تركيزات فيروس من عينات إيجابية من دراسة USEPA من المياه الجوفية وطنية ،009-2،12 الوحدات المعدية / L مع الوسيط وتركيزات متوسط 0.13 و 0.29 وحدة المعدية / L 8. وكان تركيز الفيروس في عينات المياه الجوفية إيجابية أعلى من تلك الموجودة في الجداول المتدفقة. الحصول على معظم المرافق باستخدام المياه الجوفية في هذه الدراسات المياه من طبقات المياه الجوفية الواقعة في المناطق الكارستية. هذه، جنبا إلى جنب مع تلك التي تقع في الحجر الجيري والبلورية من المرجح أن يكون تركيزات أعلى من الفيروس في مواقع أخرى 8،15،16 الإعدادات (بكسر حجر الأساس). طرق فيروس USEPA تحدد حجم عينة من 200 L (ICR) إلى 300 L (الطريقة 1615) من المياه السطحية و 1،000 L (ICR) إلى 1،500 L (الطريقة 1615) من المياه الجوفية 17،18. ولكن، حتى مع استخدامأحجام عينة كبيرة، ومعظم عينات المياه السطحية والجوفية سلبية لفيروس 8،11،19،20.
الفيروسات الموجودة في المياه السطحية تشكل خطرا محتملا على الصحة للمستهلكين من مياه الشرب. سطح معالجة المياه القاعدة يتطلب من جميع محطات المعالجة باستخدام المياه السطحية للحد من تركيزات الفيروس عن طريق السجل-4 على الأقل. حتى مع انخفاض سجل-4، يمكن أن تركيزات فيروس المعدية في مصدر مياه صغيرة مثل 0.0044 MPN / L يؤدي إلى إصابة واحدة يوميا على افتراض مثل هذه متوسط التعرض والمعالجة الشروط والمعلمات الاستجابة للجرعة لفيروس الروتا 11،21. خطر من الفيروس في المياه الجوفية غير المعالجة يمكن أن تكون أكبر بسبب نقص العلاج وحدوث الفيروسي. بوركهارت والزملاء ويقدر أن ما يصل إلى 22٪ من التهاب المعدة والأمعاء الحاد في البالغين و 63٪ في الأطفال أقل من خمس سنوات يمكن أن تكون بسبب فيروس في مياه الشرب في المجتمعات باستخدام المياه الجوفية غير المعالجة 19.
USEPA Mوقد تم تطوير ethod 1615 للكشف عن الفيروس المعوي ونوروفيروس خلال الرصد الثالث دورة اللائحة رصد ملوثات غير المنظم في (UCMR3) 22 كمواطن متابعة لنتائج بوركهارت وزملاؤه 19،23. وقد تم تصميم طريقة USEPA في المقام الأول لقياس الفيروس في النظم التي تستخدم المياه الجوفية غير المعالجة، ولكن كانت مكتوبة بشكل عام لتشمل أنواعا المصفوفة المائية الأخرى. الطريقة الجديدة هو مزيج الحفاظ على العديد من المكونات من طريقة الفيروس السابق استخدمت خلال ICR 17، إضافة إجراءات الجزيئية استنادا إلى طريقة بوركهارت وآخرون 19،23، ومجموعات التمهيدي إضافية لنوروفيروس 24. والغرض من هذه الورقة هو وصف الإجراء أخذ العينات والخطوات اللازمة للحفاظ على سلامة العينة أثناء جمع والشحن. يوصف تقييما لطريقة الشامل في Cashdollar وآخرون. 25. هذا البروتوكول يغطي collectio الحقل بسيطن من المياه السطحية والجوفية حيث مضخة وprefilter ليست ضرورية والتي لا تتطلب تعديلات لدرجة الحموضة أو وجود مطهر في الماء لأخذ عينات. يتم وصف متطلبات أكثر تعقيدا أخذ العينات في Fout وآخرون. 17،18.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت أنواع مختلفة مرشح لتركيز الفيروسات من مياه البيئية على مدى 26 عاما. الأساليب الحالية توظف ultrafilters 27، والمرشحات كهربية 13،28،29، والمرشحات الصوف الزجاجي 23، والمرشحات كهربي 30. واستخدمت مرشحات كهربية على نطاق واسع لسنوات عديدة، ولكن شرط لإضافة الملح وتعديل الرقم الهيدروجيني للمياه في حقل قبل أو أثناء أخذ العينات يحد فائدتها 13. إن اختيار المرشح الأكثر عملية لأخذ العينات الحقل مرشحات كهربي. هذه الفلاتر تسمح للأخذ العينات كميات كبيرة من المياه في معدلات تدفق عالية وبدون أي تكييف للمياه. مرشحات الصوف الزجاجي هي الخيار الأقل كلفة، ولكن لديها أبطأ معدلات تدفق من المرشحات كهربي وغير متوفرة تجاريا. توفر Ultrafilters أعلى المبالغ المستردة الفيروس على نطاق واسع لنوعية المياه، ولكن المعدات اللازمة لsampliنانوغرام ليس بسهولة ميدانيا المحمولة والوقت اللازم لجمع عينات هو أطول بكثير 27. مؤخرا تم تطوير الأساليب التي شروطا مسبقة استخدام مرشحات كهربية لتجنب الحاجة إلى تعديل في الميدان، ولكن هذه قد لا تكون قابلة للتطبيق لجمع كميات كبيرة عينة 28،29.
EPA أسلوب 1615 تستخدم مرشحات خرطوشة موجب الشحنة الكهربائية التي تحصل على شحنة موجبة إما من ألياف النانو أكسيد الألومنيوم أو الأمينات الرباعية. مزايا السابق على هذا الأخير هو أنه أقل تكلفة ويجمع بكفاءة الفيروس من المياه على نطاق أوسع من درجة الحموضة الطبيعية تقدر 30،31. ومع ذلك، كل خرطوشة، وكذلك مرشحات الصوف الزجاجي المستخدمة من قبل بوركهارت وزملاؤه تعطي المبالغ المستردة مماثلة من الفيروس المعوي ونوروفيروس من 23،31،32 المياه (Cashdollar، بيانات غير منشورة). توضع المرشحات خرطوشة في جهاز أخذ العينات بسيطة التي تم تصميمها لتسهيل عملية جمع العيناتوالحد من التلوث أثناء أخذ العينات.
الأساليب القياسية لا تقدر بثمن عندما يتم إجراء دراسات كبيرة باستخدام المختبرات التحليلية المتعددة. EPA أسلوب 1615 على إجراءات وإرشادات لتقليل اثنين من القضايا الرئيسية جمع العينات التي يمكن أن تؤثر البيانات التي تم جمعها خلال هذه القياسية دراسات كاذبة النتائج الإيجابية الناجمة عن التلوث أثناء جمع العينات أو من مكونات جهاز تطهيرها بشكل كاف، وانسداد المسام مرشح من قبل عناصر في الماء يجري عينات.
مثلما الفيروسات المعوية يمكن أن ينتشر من شخص إلى شخص وذلك بسبب عدم كفاية النظافة الصحية، ويمكن إدخال الفيروسات في عينات من أيدي سيئة غسلها أو اليدين بقفازات الملوثة 33. ومن الضروري أن العينات فهم الطرق المحتملة للتلوث واستخدام تقنية العقيم خلال أخذ العينات. يجب أن يفهموا أن أخذ العينات والقفازات وتستخدم في المقام الأول لحماية العينات من التعرض وليس إلى protect الجهاز من التلوث. يجب غسل اليدين قبل ويجب أن تؤخذ في بداية أخذ العينات والرعاية أثناء الارتداء من القفازات لمنع يد لقفاز التلوث. العينات مع التهاب المعدة والأمعاء أو الجهاز التنفسي أعراض لا يجب أن جمع العينات، كما يمكن تسليط الفيروسات المعوية أو النوروفيروس في مستويات عالية.
ثانيا، يجب توخي الحذر لمنع المرحل من الفيروس من الأحداث أخذ العينات السابقة. لتقليل هذا مصدر محتمل للتلوث، تم تعديل جهاز أخذ العينات في أسلوب 1615 من أن من ICR بعدم بما في ذلك منظم الضغط والضغط متر بين مدخل وحدة سكنية خرطوشة. تمت إزالة هذه المكونات بسبب الضغوط التي لوحظت خلال أحداث أخذ العينات كانت دائما أقل من الحد الأقصى للتصنيف السكن (على سبيل المثال، 125 رطل لمدة 5 بوصة أغلفة خرطوشة)، ولأن كان من الصعب تطهير. وقد ظهرت المشكلة الأخيرة من خلال استخدام معدات التحكم فارغة في شارعudies اللاحقة لICR 6،20. الدرجة التي تتأثر البيانات ICR غير معروف، ولكن كان صغيرا على الأرجح. كان هناك اثنان فقط كاذبة عينات تقييم الأداء السلبية الإيجابية أثناء الدراسة (لا تظهر البيانات). لمزيد من خفض إمكانية التلوث المرحل، كما أنه من المستحسن أن مدخل وحدة أنابيب الاستعاضة بعد كل حدث أخذ العينات. ومن المهم بشكل خاص لضمان التطهير الكافي إذا تم استخدام الجهاز للحصول على جودة أو أداء الرقابة التي كان المصنف مع الفيروس. قبل إجراء التطهير، ينبغي قياس تركيز الكلور الحر عن أي خسارة أثناء التخزين. وبالإضافة إلى التغييرات في تكوين جهاز المذكورة أعلاه، فإنه من الضروري أن يتم تشغيل الفراغات المعدات العادية لإثبات أن التطهير فعال. طريقة 1615 الولايات التي يتعين القيام بها الفراغات المعدات التي تستخدم الأجهزة التي تم تطهيرها بعد استخدامها لضوابط للفيروسات المصنف، وبالتالي تبسيطالإجراء من خلال القضاء على الحاجة لتمرير حل للفيروسات المصنف من خلال الجهاز قبل التطهير. تم زيادة تركيز مطهر إلى 0.525٪ هيبوكلوريت لأسلوب 1615، كما يلزم هذا التركيز على حد سواء لتعطيل أي الفيروسات قابلة للحياة على المعدات وأن تتحلل الأحماض النووية. لذلك، يجب تحليل الفراغات المعدات باستخدام كل ثقافة الخلية والمقايسات QPCR.
وكانت كلا النوعين من المرشحات كهربي تخضع للانسداد خلال الدراسات الواردة في الجدول 1. وهناك عدد غير معروف من العينات مع انخفاض أحجام قد يكون بسبب أخطاء أخذ العينات، مثل القراءة الخاطئة للعدادا أو توقف في وقت مبكر المتعمد لأخذ العينات لتلبية أخرى الموعد النهائي، خاصة بالنسبة للمياه مع التعكر قراءات أقل من 20 NTU. درجة انسداد تعتمد على حد سواء على نوع الفلتر ونوعية المياه المعلمات. توفر Prefilters قدرا من التحسن، ولكن إذا ما استخدمت، ينبغي معالجتها وتحليلهابشكل منفصل عن فلتر كهربي. التوصية الحالية لUCMR3 هي أن يتم جمع عينة من دون prefilters باستخدام مرشحات القائمة على ألياف نانوية أكسيد الألومنيوم اثنين إذا لا يقل عن نصف حجم يمكن جمعها باستخدام فلتر الأول.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر العديد من موظفي وكالة حماية البيئة التي جعلت رصد أجريت خلال ICR والمساهمات UCMR3 ممكن، والمحققين القيادي التالية من دراسات أخرى ذكرت وكالة حماية البيئة: دانيال Dahling، ألفريد دوفور، أندري إيغوروف، سوزان Glassmeyer، Asja Korajkic، ريتشارد ليبرمان، روبرت Safferman، وتيم وايد. وشانون غريفين ومايكل وير لمراجعة ناقدة هذه المخطوطة. الكتاب أشكر الأشغال المائية الهندي هيل لاستخدام واحد من المنازل مضخة لإثبات جمع العينات. وعلى الرغم من مراجعة هذا العمل من قبل وكالة حماية البيئة وافق للنشر، قد لا تعكس بالضرورة سياسة الوكالة الرسمية. لا يشكل ذكر أسماء تجارية أو منتجات تجارية تأييد أو توصية للاستخدام.
Materials
| Name of the reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments/Description |
| 1-L polypropylene bottle | Nalgene | 2104-0032 | |
| Aluminum foil squares | Cole-Parmer | 06275-40 | |
| Autoclave | Steris | Amsco Lab Series | |
| Bubble wrap | U.S. Plastics | 50776 | |
| Closable bag | Uline | S-12283 | |
| Closable bag | Fisher Scientific | S31798C | |
| Commercial ice packs | Cole-Parmer | 06345-20 | |
| Cool safe box | Diversified Biotech | CSF-BOX | |
| Gauze sponge | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Graduated cylinder | Cole-Parmer | 06135-90 | 4-L or larger |
| Hype Wipe | Fisher Scientific | 14-412-56 | |
| iButtons temperature data logger | Maxim | DS1921G | |
| Insulated storage and transport chest | Fisher Scientific | 11-676-12 | |
| Packing tape | U.S. Plastics | 50083 | |
| Portable chlorine colorimeter II test kit | Hach | 5870062 | |
| Portable pH and temperature probe | Omega | PHH-830 | |
| Portable turbidity meter | Omega | TRB-2020-E | |
| PTFE thread tape | Cole-Parmer | 08270-34 | Use on all threaded connections |
| Pump, Centrifugal Magnetic Drive | Cole-Parmer | 72010-20 | |
| Reduction nipple | Cole-Parmer | 06349-87 | |
| Sodium hypochlorite (NaClO) | Use locally available household bleach | ||
| Sodium thiosulfate (Na2S2O3) | Sigma Aldrich | 217247 | |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 19-058-800 | |
| Waterproof marker | Fisher Scientific | 22-290546 | |
| Media | Composition | ||
| 0.525% sodium hypochlorite (NaClO) | Prepare a 0.525% NaClO solution by diluting household bleach 1:10 in dH2O. Store 0.525% NaClO solutions for up to 1 week at room temperature. | ||
| 1 M sodium thiosulfate (Na2S2O3) pentahydrate | Prepare a 1 M solution by dissolving 248.2 g of Na2S2O3 in 1 L of dH2O. Store sodium thiosulfate for up to 6 months at room temperature. |
References
- Katayama, H., et al. One-year monthly quantitative survey of noroviruses, enteroviruses, and adenoviruses in wastewater collected from six plants in Japan. Water Res. 42 (6-7), 1441-1448 (2008).
- La Rosa, G., Pourshaban, M., Iaconelli, M., Muscillo, M. Quantitative real-time PCR of enteric viruses in influent and effluent samples from wastewater treatment plants in Italy. Annali Dell Istituto Superiore Di Sanita. 46 (3), 266-273 (2010).
- Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994 to december 2002. Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (1994).
- Berg, H., Lodder, W., van der Poel, W., Vennema, H., de Roda Husman, A. M. Genetic diversity of noroviruses in raw and treated sewage water. Res Microbiol. 156 (4), 532-540 (2005).
- Haramoto, E., et al. Seasonal profiles of human noroviruses and indicator bacteria in a wastewater treatment plant in Tokyo, Japan. Water Sci Technol. 54 (11-12), 301-308 (2006).
- Denis-Mize, K., Fout, G. S., Dahling, D. R., Francy, D. S. Detection of human enteric viruses in stream water with RT-PCR and cell culture. J Water Health. 2 (1), 37-47 (2004).
- Hamza, I. A., Jurzik, L., Stang, A., Sure, K., Uberla, K., Wilhelm, M. Detection of human viruses in rivers of a densly-populated area in Germany using a virus adsorption elution method optimized for PCR analyses. Water Res. 43 (10), 2657-2668 (2009).
- Lieberman, R. J., et al. . Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , (2002).
- Parshionikar, S. U., et al. Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus. Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).
- Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort. Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).
- Shaw, S., Regli, S., Chen, J., Maguire, M. J., McLain, J. L., Odolensky, A. Virus occurrence and health risks in drinking water. Information Collection Rule Data Analysis. , 437-462 (2002).
- Sobsey, M. D., Wallis, C., Henderson, M., Melnick, J. L. Concentration of Enteroviruses from Large Volumes of Water. Appl Microbiol. 26 (4), 529-534 (1973).
- Hill, W. F., Akin, E. W., Benton, W. H., Metcalf, T. G. Virus in water. II. Evaluation of membrane cartridge filters for recovering low multiplicities of poliovirus from water. Appl Microbiol. 23 (5), 880-888 (1972).
- USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. Federal Register. 61 (94), 141 (1996).
- Pang, L. Microbial removal rates in subsurface media estimated from published studies of field experiments and large intact soil cores. J Environ Qual. 38 (4), 1531-1559 (2009).
- Johnson, T. B., et al. Viruses and Bacteria in Karst and Fractured Rock Aquifers in East. Ground Water. 49 (1), 98-110 (2011).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. . ICR Microbial Laboratory Manual. , (1996).
- Fout, G. S., et al. . Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR. , 1-91 (2012).
- Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness. Environ Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).
- Francy, D. S., Bushon, R. N., Stopar, J., Luzano, E. J., Fout, G. S. Scientific Investigations Report 2004-5219, U.S. Geological Survey. Environmental factors and chemical and microbiological water-quality constituents related to the presence of enteric viruses in ground water from small public water supplies in southeastern Michigan. , 1-54 (2004).
- Regli, S., Rose, J. B., Haas, C. N., Gerba, C. P. Modeling the Risk from Giardia and Viruses in Drinking-Water. Journal American Water Works Association. 83 (11), 76-84 (1991).
- USEPA. Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems; Final Rule. Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).
- Lambertini, E., Spencer, S. K., Bertz, P. D., Loge, F. J., Kieke, B. A., Borchardt, M. A. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).
- Butot, S., Le Guyader, F. S., Krol, J., Putallaz, T., Amoroso, R., Sanchez, G. Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus. J Virol Methods. 167 (1), 90-94 (2010).
- Cashdollar, J. L., et al. Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water. Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. J Virol Methods. 176 (1-2), 38-45 (2011).
- Katayama, H., Shimasaki, A., Ohgaki, S. Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and norwalk virus from coastal seawater. Appl. Environ. Microbiol. 68 (3), 1033-1039 (2002).
- Haramoto, E., Katayama, H., Utagawa, E., Ohgaki, S. Recovery of human norovirus from water by virus concentration methods. J Virol Methods. 160 (1-2), 206-209 (2009).
- Sobsey, M. D., Jones, B. L. Concentration of poliovirus from tap water using positively charged microporous filters. Appl. Environ. Microbiol. 37 (3), 588-595 (1979).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).
- Ko, G., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. J Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).
- Liu, P., et al. Laboratory Evidence of Norwalk Virus Contamination Levels on the Hands of Infected Individuals. Appl. Environ. Microbiol. 79 (24), 7875-7881 (2013).
