사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

정확하게 바이러스 역가를 평가하기 플라크 분석의 능력은 다양한 요소에 의존한다 : 적절한 숙주 세포의 선택, 적절한 미디어 세포 및 바이러스 생존력 성장 조건, 고정화 바이러스 전파 및 바이러스 잠복기의 정확한 결정이 별개의 충분한 시간을 허용하도록 그리고 셀 수있는 플라크 형성. 샘플 서로 다른 유형에서 오버레이 선택, 배양 기간, 플라크 형태 :이 연구를 위해 세 가지 대표적인 가정 바이러스의 차이를 설명하기 위해 선택되었다. 베네수엘라 말 뇌염 (VEEV)는 말의 종과 인간의 중요한 질병의 원인과 Togaviridae의 가족을 대표 할 수있는 (+) ssRNA 바이러스 성 모델로 선정되었다. 인플루엔자 B 대만 변형, 분할 (-) 주로 인간을 감염 ssRNA 바이러스는 오르 쏘 믹소 바이러스과 (orthomixoviridae)를 나타냅니다. 리프트 밸리 열 바이러스 (RVFV), (-) 주로 절지 동물을 감염 ssRNA의 절지 동물 탄생 바이러스,반추 동물과 인간은 Bunyaviridae 가족의 대표로 선정되었다. RVFV (도 1)의 경우, 역가가 72 시간 감염 후의 대해 나란히 배양 하였다 CMC, 아가, 또는 아비셀 오버레이를 이용하여 12 웰 플레이트 형식 RVFV의 재조합 약독 MP12 균주의 스톡 용액으로부터 결정 하였다 (HPI). 에서 10-4 10-7까지 희석을 보여주는 대표적인 판은 CMC를 사용하여 패널 A. 플라크에서 볼 아가로 오스 오버레이는 잘 정의 된 원형 테두리, 작은 분명하고, 별개의 플라크를 보여 주었다 할 수있다. 액체 오버레이 플라크는 약간 더 풍부하고 CMC 플라크를 아가 로스와 비교하여 큰이었고, 덜 뚜렷한 경계를 제공했다. 바이러스 역가가 오버레이 모두가 동등하게 수행하여 패널 B에 비교 하​​였다. reproduc을 결정하는 큰 샘플 크기와 함께 MP12위한 오버레이 중 명확한 시각적 비교를 얻기 위해서는ibility은 6 웰 플레이트는 세중 (그림 2)에서 상용화에 박차를 가하고 있었다. 6 웰 플레이트 포맷에서, CMC 오버레이의 사용은 서로의 크기는 차이가 없었다 아가 오버레이 또는 액체, 하나보다 작은 플라크를 보였다. 바이러스 역가가 세 오버레이 (패널 D)과 비슷하지만, 아가로 오스와 액체 오버레이에 형성된 플라크 인해 증가 된 크기를 계산하기 쉬웠다. 현저하게 변화 (그림 3A) 다른 오버레이 중 RVFV, VEEV 역가와 플라크 형태와는 달리. 플라크 크기 및 감도 (패널 B)의 비용으로, 12 웰 플레이트 포맷을 사용하는 경우 CMC 오버레이에 형성된 플라크는 선명하고 뚜렷한 형태를 보여 주었다. CMC는 대조적으로, 아가 로스 및 액체 오버레이 사용 VEEV 복제 저급 바이러스 억제 및 증가 된 감도를 나타내는 상당히 큰 플라크 결과. 만 AP에 CMC 대 아가로 오스를 비교할 때이 이전에 확인되었다조리개는 후아 레즈 등. 사에 의해 출판. 아가로 오스와 액체 오버레이 CMC보다 큰 플라크를 생성하는 동안, 플라크가 제대로 국경을 정의 가장 큰 국경 확산을 제공하는 액체 오버레이, 12 잘 형식으로 계산하기 어려운했다. 플라크는 6 웰 플레이트 (도 4)에서 상용화에 박차를 가하고 때, 큰 6 웰 포맷의 관점에서 CMC 오버레이 우수한 증명 아가 로스, 12 웰 형식으로 차별화하기 어려웠다 명백히 큰 플라크 및 액체 오버레이의 문제를 부정 플라크 정의와 민감하게 (그림 4D). 비교 RVFV 또는 외부 단백질 분해 효소의 요구 사항으로, plaquing 때 VEEV는, 인플루엔자는 몇 가지 독특한 도전을 제공합니다. 아가로 오스의 브랜드를 다른만큼 약간의 수정이 될 때 큰 변화가 언급 한 바와 같이 서로 다른 오버레이 선택에 인플루엔자 바이러스의 민감도는 물론 과거에 설명되어 있습니다EN 9를 사용했다. 흥미롭게도 인플루엔자 B 대만 균주, 오버레이로 CMC의 사용은 계산하기 어려운과 (그림 5A) 안정적으로 점수를 어려웠다 현저하게 작은 플라크를 초래. 아가 오버레이의 사용은 가장 플라크 (패널 C)를 제공하고, (증가 단층 생존에 가능성으로 인해) 더 어두운 배경 얼룩 결과, 액체 오버레이의 사용 (패널 B에 직접 비교 명확하고 선명 플라크를 보였다 ). 아가 로스와 CMC 고체 및 반고체 오버레이를 통해 액체 폴리머의 뚜렷한 장점은, 제거 및 응용 프로그램의 용이성에있다. 반고체 오버레이 난방을 필요로하며, 처리 및 제거 할 때 응고가 문제가 될 수 있습니다. 이러한 장점을 활용하고 RVFV위한 높은 처리량 방식 아비셀를 이용하는 실용성을 결정하기 위해, 96 웰 플레이트 형식은 다양한 오버레이 concentrati에서 상용화에 박차를 가하고시켰다기능 (그림 6). RVFV MP-12의 경우, 희석 아비셀 모두 0.6 및 1.2 %의 최종 농도에서 4 번씩 수행 하였다. 오버레이 응용 프로그램 및 제거 재현성의 높은 수준을 보여, 반복 실험 중 또는 언급 농도 사이의 명백한 차이, 간단한 증명했다. 득점 할 때, 플라크는 RVFV에 대한 높은 처리량 방식으로 액체 오버레이를 사용의 가능성을 보여주는, 육안으로 구별하고 셀 수 있었다. 그림 1 :. 12 잘 접시를 활용 RVFV 플라크 오버레이 비교 Veros 12 웰 플레이트에 2.5 × 10 5 세포에서 도금과 MP12의 같은 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 200 μL에 감염되었다. 감염 0.3 % 아가로 오스를 1.5 ml의 오버레이, 아비셀 0.6 %, 또는 1 % CMC (최종 후 다패널 A. 플라크에서 증명 카운트와 패널 B에 titered 된대로 oncentrations), 직접 오버레이를 비교하기 위해 적용되었다. 그림 2 :. 6 웰 플레이트를 활용 RVFV 플라크 오버레이 비교 Veros 6 웰 플레이트에 5 × 10 5 세포에서 도금과 MP12의 같은 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 400 μL에 감염되었다. 패널 AC 기술 한 바와 같이 패널에 입증 된 바와 같이 0.3 % 아가 로스 세 ml의 오버레이, 0.6 % 아비셀, 또는 1 % CMC가 직접 오버레이를 비교하기 위해 적용하고, B 및 C. 분리 실험과 동일하게 수행 하였다 플라크는 계산 및 패널 D (N = 3)에서 titered. 그림 3 : <12 웰 플레이트를 활용 strong>을 VEEV 플라크 오버레이 비교. Veros 12 웰 플레이트에 2.5 × 10 5 세포에서 도금 VEEV TC-83 백신 균주의 같은 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 200 μL에 감염되었다. 패널 A. 플라크에서 입증 된 바와 같이 감염 후 0.3 % 아가로 오스를 1.5 ml의 오버레이, 아비셀 0.6 %, 또는 1 % CMC는, 패널 B.에서 카운트 하였다 titered 직접 오버레이를 비교하기 위하여 적용된 그림 4. 6 웰 플레이트를 활용 V의 EEV 플라크 오버레이 비교 Veros 6 웰 플레이트에 5 × 10 5 세포에서 도금 400 μL가 VEEV TC-83의 동일한 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 감염되었다. 입증 된 바와 같이 감염 후 0.3 % 아가 로스 오버레이 3 ㎖, 0.6 % 아비셀, 또는 1 % CMC 직접 오버레이를 비교하기 위하여 적용된C를 카운트 패널 D에서 titered 플라크와, (N = 3) – 패널 기술 한 바와 같이 패널에, B와 C. 분리 실험을 동일하게 수행 하였다. 그림 5 : 인플루엔자 플라크 오버레이 비교 MDCK 세포를 6 웰 플레이트에 5 × 10 5 세포에서 도금 및 인플루엔자 B 대만의 동일한 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 접종의 400 μL에 감염되었다.. FBS는 바이러스 성 융합에 필요한 특정 프로테아제 억제 통해 인플루엔자 전파를 억제 할 수 없음 소 태아 혈청 (FBS)이, 성장 배지 또는 오버레이에 사용되지 않았다. TPCK-트립신은 숙주 세포와 바이러스의 융합 및 진입을 용이하게하기 위해 이전에 애플리케이션 오버레이 모두에 첨가 하였다. 감염 후, 0.3 % 아가 로스 오버레이 3 ㎖, 0.6 % 아비셀, 또는 1 % CMC를 직접 비교하기 위해 적용된C, 패널 D에 카운트 titered 플라크와 (N = 3) – 패널에 기재된 바와 같이 패널 A, B 및 C. 별도 실험에서 입증 된 바와 같이 오버레이 동일하게 수행 하였다. 평균은 CMC 플라크 걸리는 동안 그들은 확산 테두리와 매우 작은 플라크 크기를 보여 그들이 안정적으로 계산하기 어려운 입증했다. 그림 6 :. 높은 처리량 플라크 오버레이 Veros의 96 웰 플레이트에 4 번씩, 1 시간 동안 RVFV MP12 같은 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 접종 50 μL에 감염되었다, 잘 ​​당 3 × 10 4 세포에서 도금. 오버레이를 들어, 아비셀 0.6 및 1.2 %의 최종 농도는 높은 처리량으로, 패널 A 및 B에서 액체 오버레이의 이용 가능성 및 재현성을 결정하기 위해 상용화에 박차를 가하고 있었다. RVFV VEEV 인플루엔자 B 셀 타입 베로 베로 MDCK 감염 기간 1 시간 1 시간 45 분 배양 시간 삼일 이일 삼일 표 1 : 플라크 분석 접종 조건 및 셀 유형 RVFV VEEV 인플루엔자 B 셀형 베로 베로 MDCK 성장 타입 DMEM 1 DMEM 1 DMEM 2 플라크 미디어 2xEMEM 2xEMEM 2xEMEM B 1. 둘 베코 변형 이글 보통 10 % 소 태아 혈청, 1 % L 글루타민, 1 % Penicllin / 스트렙토 마이신이 보충. 2. 둘 베코 변형 이글 보통 1 % L 글루타민, 1 % Penicllin / 스트렙토 마이신, 0.2 % 소 혈청 알부민, 0.025 % HEPES, DEAE 덱스 트란 50ug / ㎖로 보충. 5 % FBS (25 ㎖), 1 %의 최소 필수 아미노산 (5 ㎖), 1 % 나트륨 피루 베이트 (5 ㎖), 1 % L – 글루타민 (5 ml)로 보충 된 최소 필수 A. 배 미디어 (500 ㎖), 2 % 펜 / 스트렙토 (10 ㎖). 0.2 % 소 혈청 알부민, 1 %의 최소 필수 아미노산 (5 ㎖), 50ug / ㎖, 0.025 % HEPES, DEAE 덱스 트란, 트립신 TPCK 보충 된 최소 필수 B. 배 미디어 (500 ㎖) * * 준비 직전에 25 당 1 μl를 추가나누어지는 2 μg의 TPCK – 트립신의 / ㎖ 주식 ml의 당신은 플라크에 아가와 함께 섞어 사용하는 것입니다. 표 2 : 상패 및 바이러스 / 세포 성장 MEDIAS RVFV VEEV 인플루엔자 B 셀 타입 베로 베로 MDCK 감염 기간 1 시간 1 시간 45 분 배양 시간 삼일 이일 삼일 너무 오래 불임이 유지되는했을 때 오버레이 솔루션은 만료되지 않습니다. 표 3 : 오버레이 증권 6 잘 12도 96 웰 세포의 # /도 5 × 10 5 2.5 × 105 3 × 104 innoculum의 볼륨 (μL) (400) (200) (50) 오버레이의 양 (㎖) 3 1.5 0.100 표 4 : 플레이트 형식