Руководство маленькая молекула экрана Подойдя высокой пропускной Использование эмбрионов данио
Summary
Данио является отличным экспериментальным организм для изучения позвоночных процессы развития и модели болезни человека. Здесь мы опишем протокол о том, как выполнить ручной химический экран высокой пропускной у эмбрионов рыбок данио с целый монтажа в гибридизация (жаль) читать при отъезде.
Abstract
Данио рерио стали широко использоваться модель организм исследовать механизмы, лежащие в основе биологии развития и изучать патологию человека болезни из-за их значительной степени сохранения генетических ресурсов с человека. Химические генетика предполагает тестирование эффект, что небольшие молекулы оказывают на биологический процесс и становится все более популярным поступательное метод исследования для выявления терапевтических соединений. Данио рерио специально привлекательным для использования в химических генетики из-за их способности производить большие лапы прозрачных эмбрионах, которые внешне оплодотворенных. Кроме того, эмбрионы данио может быть легко препарат обрабатывают путем простого добавления соединения к эмбриону массовой информации. Использование цельного монтировать в гибридизация (жаль), экспрессия мРНК может быть четко визуализируется в эмбрионов рыбок данио. Вместе с использованием химических генетики и желаем, данио становится мощным весь контекст организм, в котором для определения клеточного и физиологическиеЭффекты малых молекул. Инновационные успехи были достигнуты в области технологий, которые используют процедуры проверки машины на базе, однако для многих лабораториях такие варианты не доступны или остаются непомерно. Протокол, описанный здесь описано, как выполнить вручную с высокой пропускной химическую генетический экран, который требует базовых ресурсов и может быть выполнена с помощью одного индивидуального или небольшой группы в качестве эффективного периода времени. Таким образом, этот протокол обеспечивает посильную стратегии, которые могут быть реализованы с помощью научно-исследовательских групп для выполнения химических генетику у рыбок данио, которые могут быть полезны для получения фундаментальных понимание процессов развития, механизмов болезни, а также для выявления новых соединений и сигнальные пути, которые имеют медицинской соответствующие приложения ,
Introduction
Идентификация эффективных лекарственных препаратов для лечения заболевания людей является эндшпиль для многих биомедицинских исследований. В то время как идентификация и характеристика потенциальных фармакологических средств для клинического применения имеет очевидное значение для здравоохранения, он остался собой значительную проблему. В конечном счете, развитие многих терапевтических соединений происходит от знания того, как конкретные типы клеток либо развивать или функция. Данио, Danio rerio, является пресноводной костистых семьи карповых, которая стала основной модельный организм в биологии развития 1. Данио рерио генетически податливые позвоночные, которые легко поддерживать и управлять для научных исследований 2,3. Данио эмбрионов является прозрачным, внешне оплодотворенной, и могут быть получены сотни из одной пары взрослых спаривания только в течение недели 2,3. Кроме того, данио доля основных систем органов и обладают большой дegree генетического сходства с млекопитающих, включая человека 4. Поразительно, 70% человеческих генов имеют данио ортолог 4. Благодаря этому сходству, данио были весьма актуальны экспериментальная система для изучения механизмов развития позвоночных и физиологии, и были использованы резюмировать множество заболеваний человека 5-7. Эти причины, в частности, сделали данио идеальным кандидатом для продолжения генетических допросы и привело к постоянному росту признательности за полезности данио в биомедицинских исследованиях 6,7.
За последние несколько десятилетий, обилие генетических инструментов были разработаны в данио. Данио геном поддается мутагенеза и трансгенеза 3. На сегодняшний день, множество прямом и обратном генетические исследования были проведены, что приводит к генерации более 9000 мутантов 3. Кроме того, многочисленные трансгенные линии имеют бытьан создан, которые позволили маркировки и выделения специфических типов клеток 3. Там были значительные усилия, предпринимаемые на централизацию и распределение этих ресурсов в научно-исследовательского сообщества, которые доступны для лабораторий на довольно низкой стоимости через Международный центр данио рерио ресурсов (Zirc) 8. Кроме того, обширная хранилище биологической информации и молекулярных инструментов, начиная от паттернов экспрессии генов в морфолино последовательности и протоколы, которые были постепенно аннотированный на информационной сети данио рерио (ZFIN) 9-11. Эти данио исследовательских инфраструктур стало возможным благодаря значительной поддержке NIH и пропаганды этого животного модели 8. Это кэш данио мутантов, трансгенных линий и соответствующей информации по-прежнему вызывает исключительную ценность для научного сообщества биологической в целом. Тем не менее, в то время как данио теперь хорошо установлено и выдающийся модельный организм, они представляют лаrgely неиспользованный резервуар для изучения биологии и болезнь развития за счет использования химических генетических экранов.
Химические генетика является использование малых молекул, таких как лекарственных препаратов или других соединений, чтобы воздействовать на биологические процессы в системе живого 12. Химические генетика может быть реализован понять молекулярные механизмы функции гена, например, для идентификации агентов, что спасение или усугубить определенный генетический дефект 12. Кроме того, химические генетика представляет один крупный проспект проводить трансляционные исследования 12. В то время как традиционные вперед генетический скрининг на животных моделях были чрезвычайно мощный в увязать конкретные гены болезней, им не хватает временное измерение, что затрудняет, а иногда невозможно наблюдать фенотипы, которые могут возникнуть после раннего эмбриогенеза. Кроме того, резервирование ген может сделать результаты, наблюдаемые с передовых генетики трудно интерпретировать. Альтернативно, химические генетический скринингпозволяют мелким временным контролем и одновременно обеспечивают ценную отправную точку для открытия новых лекарств 12,13.
Химические генетика может быть выполнена с использованием в пробирке систем (например, клеточные линии, белков), или с использованием системы в живом организме, такие как целого организма. Использование системы в пробирке для химических генетики может быть выгодным, потому что это проще, чем системы организма в целом, легче работать с в большом масштабе, менее дорогостоящей, и меньше времени интенсивно. В результате системы в пробирке позволяют как для высокопроизводительного скрининга (HTS) и высокого содержания скрининга (HCS). Есть ряд преимуществ в использовании системы в пробирке, что следует учитывать при приближении химические генетику, но и существенные ограничения. Одним из основных ограничений на использование линии клеток является то, что малые молекулы могут быть эффективными и нетоксичными в определенной клеточной линии, но становятся токсичными при введении в целом организме. Таким образом, сутьвопроса является то, что в пробирке системы не захватить широкий контекст организма и, следовательно, не всегда в состоянии точно имитировать то, что происходит в целом организме. В то время как соединение тестирование в целых организмах могут обойти эти проблемы, использование млекопитающих целых моделей организма создает ряд физических и этических ограничений. Например, скрининг лекарств в мыши логистически мешает пространстве и за его счет, необходимой для проверки надлежащего размера выборки. Кроме того, вопросы развития может быть трудно изучить, в связи с тем, что млекопитающие развиваются в утробе матери. Наконец, в то время как проведение биомедицинских исследований имеет огромное социальной значимости, есть, тем не менее существенные потребности в защите благополучия животных, ограничивая интенсивные исследования и облегчение боли и страданий животных, используемых для научных исследований. Данио рерио обеспечить жизнеспособную замену, чтобы работать с высших позвоночных, как млекопитающие, и, кроме того, много тем можно изучать с помощью химических генетики вэмбриональные и личиночных стадий, когда неврологическое обработка отсутствует или оперативное на низком уровне 12,13.
На сегодняшний день, несметное число химических генетических экранов были выполнены с использованием эмбрионов данио рерио, в частности, как соединение доставки может быть достигнуто путем погружения эмбрионов в среде, содержащей лекарственное средство интереса 12-15. Кроме того, были многочисленные научные и технологические достижения, чтобы сделать химические генетический скрининг можно и управляемым 16-20. Петерсон и его коллеги были первыми, чтобы использовать данио в химической генетическом скрининге в 2000 году, а позже в 2004 году выявили соединения, которые подавлены аорты мутации коарктации в данио 21,22. Химические экраны, так как был реализован изучать несколько развивающимся тканей (например, сердце, кровь, сосуды) 23-25 физиологические функции (например, неврологические основы для поведения) 26, взрослый регенерации 27,28, и diseas е модели (например, мышечная дистрофия и рака) 29,30. Из этих рыбок данио химических экранов, открытие, что простагландины регулируют гемопоэтических стволовых клеток было принято в ходе клинических испытаний на людях, демонстрируя силу, чтобы перейти от "танка к постели" 23,31-33 (NIH, Клиническая Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Совсем недавно, перспективные кандидаты терапевтические появились для сложных органов, таких как почки, которые рекультивации клеточной патологии в поликистозом почек (ДОК) 34 и острой почечной травмы 27,35, хотя они до сих пор не переехать в клинических испытаниях. Эти химические генетический скрининг широко продемонстрировать полезность тестирования небольших соединений в развивающихся данио и способности применять химические генетику допросить функцию взрослых тканей. Кроме того, существует растущий список имеющихся в продаже коллекций фармакологии, которые доступны для академических исследований 19.
ove_content "> В последние несколько лет, были видные достижения в химической генетических технологий скрининга, в том числе с использованием автоматизированных систем роботов для дозирования препарата и обращения, а также автоматизированных систем обработки изображений 36-38. Такие системы позволяют возможности тестирования многие тысячи соединений, чтобы достичь обеих HTS и ЖКХ 36-38. К сожалению, предприятие химической генетических экранах с этих инновационных роботизированных предприятий, как правило, требуют значительных ресурсов. Эти типы ресурсов являются существенным препятствием для многих учреждений, которые не имеют капитал, чтобы приобрести , эксплуатировать и обслуживать такой аппаратуры. В то время как создание инфраструктуры для роботизированной обработки химических библиотек, в том числе перенос эмбрионов в упорядоченной пластины, остается стоимость непомерно высокой для многих лабораториях, автоматизированный изображений и анализа, как правило, более доступными 12. Автоматизированная скрининг изображения позволяет количественно флуоресцентного трансгенных реносильщики и облегчает конкретных фенотипический анализ 12,15.Хотя автоматизированные системы представляют полезные технические достижения, многие вопросы можно решить с помощью более целенаправленных ручных экранов, таких как запрос из нескольких тысяч биологически активных соединений на процесс развития с целым-горе гибридизация (жаль) считывания 39 в. Кроме того, в то время как все большее число лабораторий ссылались данио химические экраны исследовать вопрос исследования, мало (если таковые имеются) усилия достигли насыщения и много тем до сих пор не нарушил использованием химических генетику. Химические экраны могут быть выполнены с помощью небольшого данио колонию, состоящую всего из нескольких дикого типа или трансгенных танков. Таким образом, эта форма генетической допроса должны быть достижимы большинством данио исследовательских групп, заинтересованных в расширении / диверсификации в этой области. Химические библиотеки различного размера могут быть приобретены с коммерческой дистрибьютора и / или седловинеlaborators. По этим причинам, химические генетика может быть экономически целесообразным даже в суровых финансирования климатических условиях. Тем не менее, существуют препятствия для начала экран химические генетики, такие как, как планировать логистические аспекты экрана: например, количество персонала, необходимого для успешного экране, ассигнований из выделенного времени и склеивания физическое протокол вручную образцы процесс что количество от сотен до нескольких тысяч. Здесь мы подробно руководство протокол высокой пропускной выполнять химические генетику в эмбрионов рыбок данио с WISH как показания. Этот метод предполагает медикаментозное лечение эмбрионов данио, а затем обнаружения Riboprobe транскриптов мРНК. Используя этот протокол, небольшая группа или даже одного человека может разумно экран и анализировать скромный химической библиотеки около 600 соединений в промежутке 9 недель.
Protocol
Representative Results
Discussion
Химические генетика в данио может сделать решающее воздействие на прогрессирование открытия новых лекарств. Этот протокол обеспечивает ручной метод высокой пропускной выполнять химические генетику у эмбрионов рыбок данио с желанием считывания, эффективно позволяет индивидуальный или небольшую группу, чтобы провести экран малую молекулу. Этот метод минимально-ресурс расширяет возможности химических генетики для многих исследовательских групп. В частности, эта стратегия экран обеспечивает важную альтернативу использования роботизированной аппаратуры, поскольку такие системы не являются широко доступными через научно-исследовательских подразделений. Это руководство экран позволяет один человек, чтобы проверить один 96-луночного планшета соединений с пожеланием отсчета в 6 день рабочей недели. Так данио яйцекладущие, с эмбрионы разработки за пределами родительского, и эмбрионы являются достаточно большими, чтобы увидеть невооруженным глазом (между 1-3 мм), они поддаются для ручной обработки с простыми инструментами и исследователь может образцов массива вмульти-луночные планшеты без использования микроскопа. Кроме того, поскольку данио быстро развиваются, воздействие малая молекула может быть эффективным с одной обработке соединения, а не повторных доз, что сводит к минимуму дальнейшее ручной обработки. Эмбрионы рыбок данио легко культивировать, потому что их желток обеспечивает источник питания до 5-6 дней после оплодотворения, что исключает осложнения мальков кормления. Кроме того, большинство личинок органов разработали и стать функциональным в течение этого периода, что обеспечивает возможность изучить широкий спектр научно-исследовательских вопросов. Простое добавление небольших молекул в эмбрион инкубационного СМИ является неинвазивным и позволяет исследователю (ы), чтобы выбрать для дозы препарата, время того, и продолжительность экспозиции таким образом, обеспечивая жесткий контроль над многими переменными и позволяет для конкретных процессов развития Интересно быть запрошены. Как описано здесь, значительная производительность исследование может быть достигнута в короткий timefrAme используя эту методику ручного экрана. По нашему опыту, существует высокая отдача на вложенный усилий, которые могут быть усилен с помощью известного биологически активное химическое библиотеку проанализировать процесс интереса, таких как нефрона сегментации во время почечной развития (рисунок 4; Poureetezadi и Wingert, не опубликовано).
Ручной химической экран описано здесь исключительно универсален, потому что включает в себя анализ на фиксированных экземпляров рыбок данио. Например, эта стратегия может быть пересмотрен, чтобы проверить несколько пластин соединений в течение одной недели, а затем набрать эмбрионов на следующей неделе. Альтернативные анализы на образцах фиксированных данио, такие как иммуногистохимических или другой окраски ткани препаратов, также может быть заменен на желание считывания. Экспериментальные стратегии для выполнения сотовые анализы на рыбках данио адаптируются благодаря оптической ясности и прозрачности ранних стадиях развития. Кроме того, исследователи могут подавлять пигментацию на более поздний ГНАГЭС с использованием химических веществ, или избежать осложнений развития пигментной вообще за счет использования пигментных-менее генетических линий, как Каспер или чистой данио 13. Это возможно вручную управлять малых молекул, обработать пятно (ы) интересов, и вручную набрать эмбрионов, используя простой стереомикроскопа. Тем не менее, важно иметь в виду, что автоматизированный анализ изображения может быть выполнена, и в действительности может потребоваться для анализа фенотипа с высоким разрешением. Например, может быть предпочтительным, чтобы партнера автоматизированной системы анализа изображений с прямого анализа, такие как трансгенного репортера, так как это упрощает ручную обработку образцов, количественно различия не так легко различимы невооруженным глазом, и устраняет исследователь уклон 15. К счастью, некоторые автоматизированные системы обработки изображений являются удобным и экономичным с точки зрения расходов на программное обеспечение 15. Использование и возможности других автоматизированных систем быстро развивалась и можетбыть использованы для ориентации организмов, администрирование медикаментозного лечения, и даже переехать организмов 12,15. Эти автоматизированные системы ознаменовало начало новой технологической эры исследований и предоставили инновационные решения для управления в больших количествах испытуемых и, таким образом, выполнить HTS и ЖКХ подходов в целых организмах 12,15. В то время как такие машины, несомненно, являются полезными инструментами, они также очень дорого и находятся вне досягаемости для многих основных научно-исследовательских лабораторий. Без доступа к этим автоматизированных возможностей может показаться, что химические экраны не возможно. Тем не менее, этот протокол описывает руководство о том, как провести ручной экран, который может использоваться для завершения экран химические генетики в практической плоскости в течение разумного периода времени.
Недостатки для ручных скрининга и химических генетики в целом существует, и следует иметь в виду при рассмотрении химического экран. В частности, этот способ требует продемонстрировали здесь умеренную степеньфизической ловкости. Эта проблема является уменьшенной или полностью устраняется через повторение, как ловкость улучшится с практикой. Кроме того, существует минимальный номер для грубой ошибкой, поскольку есть только 10 эмбрионов на лунку для анализа. Малые молекулы могут варьироваться в пенетрантностью фенотипа, индуцированной, так разумный режим подсчета очков для идентификации соединений, представляющих интерес обязательные для исполнения. Очень важно, чтобы исследователи, использующие этот протокол разработать соответствующим строгим критериям для того, что они будут рассматривать хит. Важно также иметь в виду, что характер этой формы экрана, скорее всего, дают определенную часть ложных срабатываний, которые могут быть выделены путем дальнейшего химического обработки с. Кроме того, очень важно, чтобы устроить эмбрионов точно и собрать муфты для скрининга вскоре после оплодотворения, а асинхронный развитие может привести к осложнениям в точно оценить эффект от медикаментозного лечения. Кроме того, в отношении химического скрининга как бывшийэкспериментальное стратегия, есть множество ограничений. Соединение растворимость и токсичность молекул-носителей (например, диметилсульфоксид (ДМСО)) может также представлять собой проблему, и могут быть непомерно высокими в тестировании много молекул. Хориона также может выступать в качестве барьера для воздействия наркотиков. Наконец, даже при том, что данио являются мощными и поступательное модель для химических генетики, следует всегда быть приняты при определении того, альтернативной стратегии химической экрана, например, с использованием системы в пробирке, таких как линии клеток, может быть заменен на использовании целое животные. Тем не менее, химическая обработка по всей данио системы считается предпочтительным проведение аналогичных подходов в млекопитающих, так как она обеспечивает преимущество сбора системных эффектов соединений и может позволить исследователям сортировку списка тестируемых соединений в модели млекопитающих.
На сегодняшний день, данио химические экраны обеспечили мощный экспериментальный инструмент тO очертить механизмы развития и чтобы установить кандидатов фармакологических агентов для применения в медицине, например, идентификации молекул, способных профилактики патологий, болезней. Например, исследование, проведенное Бернс и его коллеги разработали автоматизированную анализа микро-а для частоты сердечных сокращений с помощью трансгенных эмбрионов данио, что высказанные GFP в миокарде 42. Они использовали эту трансгенной линии для анализа сердечного ритма в развитии, и как это повлияло на лечение наркозависимости 42. Еще одно исследование, проверяя плотность населения гемопоэтических стволовых клеток в эмбрионов рыбок данио, установлено, что простагландин E2 регулирует HSC нишу 23. Эта находка была подтверждена в мышь, и позже был реализован для клинических испытаний в трансплантации пуповинной человека 23,31-33 (NIH, Клиническая Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Через несколько недавних исследований, химические генетика доказала, что полезно в изучении болезни почек с помощью данио <sдо> 43. Данио почек обеспечивает отличную парадигму для изучения нефрогенеза или регенерации нефрона, функциональное устройство, которые включают почки во время развития и острой почечной травмы 43. Структура Nephron высоко консервативен между данио почки эмбриона и взрослого почек млекопитающих 44-50. Несколько исследований, посвященных изучению данио эмбриональной почки наглядно иллюстрируют присущую поступательное потенциал в сочетании с химическими генетики. Экран химические генетика была выполнена на двух рыбок данио мутантов, которые были сопоставлены с PKD2 генов и ift172, которые, как известно, являются ключевыми игроками в поликистозом почек (ДОК) 34. Результатом экран в определении пан-гистондезацетилазу (HDAC) ингибитор трихостатин A (TSA), как небольшой молекулы, которые могут свести на нет морфологические дефекты обычно видели в мутантных эмбрионов. Иной подход, принятый де Гро и коллег скрининг соединений, которые inducред отек в дикого типа эмбрионов данио, которые указывали бы на нарушение функции почек 35. После выявления PTBA как хит, они отметили, что в дополнение к вызывая отек, PTBA также повышал экспрессию pax2a, маркер для почечных клеток-предшественников. Важно отметить, что оптимизированный производная PTBA тогда показали, чтобы уменьшить процентную фатальность взрослых данио, что была гентамицин-индуцированной повреждение почек и, кроме того, ускоренное восстановление мышей, которые страдали от повреждения почек 27. Взятые вместе, эти взносы данио химических генетики продемонстрировать типы открытий, которые могут быть сделаны с использованием метода, описанного в этом протоколе.
В то время как исследования химических генетика несет существенную заслугу, это не без некоторых проблем. Исключительно с использованием химических генетики подход может сделать это сложно определить конкретный ген или гены, которые под воздействием соединения. Даже если цель (ы) найдена, сиgnificant разрыв может остаться между идентификации соединений и понимания механизма (ов) действий, в котором маленькая молекула ведет себя. Например, это может быть трудно определить механизм, в котором малая молекула, действующую так как одно соединение способно имеющий диапазон различных эффектов в организме. Тем не менее, с появлением новых технологий и более химических генетических экранов завершается у рыбок данио, задача определения механизма сокращается. Один из способов, чтобы помочь определить молекулярные эффекты определенных соединений, чтобы выбрать библиотеку наркотиков известных биоактивных для скрининга, где механизмы могут быть потенциально вывести из ранее аннотированных данных. Кроме того, chemoinformatic алгоритмы, как ворота Discovery, доступны для использования, что может сравниться структурные сходства соединения с базой данных соединений с приписываемыми механизмов 14. Еще один способ выяснить механизм соединения будет генерировать MICRoarray профиль после лечения, а затем запросить эту анкету в составлении профилей наркотиков микрочипов, таких как Connectivity карте, поиск механистически определенных соединений, которые вызывают подобный эффект 14. Этот подход также может быть использован, чтобы идентифицировать генетические мутанты, которые имеют такой же эффект, что и соединение, представляющее интерес. Нахождение связи между соединением и мутанта можно предположить, что соединение работает молекулярно до или после соответствующего гена, который может быть очерченной путем обработки мутанты с соединением и Morpholinos. Другим вариантом было бы масс-спектрометрии, который продолжает становиться более оптимизирован для рыбок данио. Этот метод может быть использован, чтобы очертить конкретные изменения белка или посттрансляционных модификаций после лечения препаратом. Наконец, малые молекулы и даже целые библиотеки иногда способен быть помечены для выпадающем связывающих партнеров. Стоит также отметить,, что в то время как механизм, как маленький функций молекул яы значительного импорта, есть FDA-одобренных лекарственных препаратов, механизмы остаются неизвестными.
Хотя данио демонстрируют много общего с млекопитающими и генетически и физиологически, есть еще вопрос наркотиков кроссовера 14. Одно исследование исследовали кроссовера возможность хитов с экрана для ингибиторов клеточного цикла в эмбрионов рыбок данио 50. Результатом экран в идентификации 14 хитов, которые ранее были неизвестны обладают активностью клеточного цикла. Из этих 14 соединений, 6 было установлено, что активность клеточного цикла в обоих человеческих и данио клеточных культурах, 3 было показано, что в сыворотке крови инактивированной в клеточных культурах, 1 был активен только в данио клеток, и 4 не обладал активностью в любом данио или человека на культурах клеток, но только в данио всего организма. Примечательно, что 4 соединения, которые только имели активность в данио демонстрируют, что существуют различия между данио и млекопитающих, которые могут prohiбит поступательное потенциал некоторых соединений. Это является важным фактором не забывать о, однако есть примеры малых молекул, как PGE 2, который усиливает способность ГСК привить в человека получателей и PTBA производных, которые улучшают скорость почечной восстановления млекопитающих, обеспечивая тем самым доказательство из принципа, что кроссовер можно 23,31-33.
Независимо от этих ловушек, химических генетики и этого подхода минимальной ресурсов может многое предложить научному сообществу. Химические генетика особенно полезно в данио и будет продолжать играть важную роль в молекулярной допроса пути и открытия новых лекарств. Химические экраны на основе дискретных молекулярных мишеней исторически подвергались высокой интенсивности отказов из-за того, что известно как сочетание адсорбции, распределения, обмена веществ, выведения и токсикологических (ADMET) свойств 51. Химические экраны, использующие данио, чтобысосредоточиться на процессе, а не дискретной цели, может обойти несколько проблем ADMET и идентификации соединений, которые являются эффективными в контексте всего организма. С увеличением пула доступных для рыбок данио исследований, в том числе текущих мутантных штаммов и способности использовать редактирование генома для создания целевых генетических мутантов и трансгенных ресурсов, есть практически неограниченное количество потенциальных химических генетических экранов с использованием данио. Многие химические библиотеки были куратором, и диапазона коллекции с известными биоактивных, новых соединений, структурно разнообразных и структурно подобных. Эти реагенты обеспечивают богатство захватывающих возможностей для комбинаций экранов, которые доступны в настоящее время и, вероятно, еще больше расти в ближайшие годы. С этими возможностями в стороны, это руководство и высокой пропускной протокол обеспечивает практический и удобный способ увеличить способность исследовательских групп для проведения химических генетические экраны с помощью данио.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирование для научно-исследовательской лаборатории Wingert из следующих: Национальные институты здравоохранения предоставляет K01 DK083512, DP2 OD008470 и R01 DK100237; Марш Dimes Василий О'Коннор Starter Scholar гранта # 5-FY12-75; запуск средства из Университета Нотр-Дам колледж науки и Отделения биологических наук; и щедрый подарок в Университет Нотр-Дам от Элизабет и Майкл Галлахер от имени Галлахер семьи, чтобы способствовать исследования стволовых клеток. Доноры не участвовал в разработке исследования, сбор и анализ данных, решение о публикации или подготовке рукописи. Мы благодарим Пола Т. Крегер-младший за предоставление критическую обратную связь на рукописи. Мы благодарим сотрудников Отделения биологических наук за поддержку, и Центр данио рерио исследований в Нотр-Дам за их выдающуюся самоотверженность в помощи и благосостояния нашей данио колонии. Наконец, мы благодарим членов нашей researч лаборатория для их комментарии, обсуждения и идеи по этой работе.
Materials
| JoVE 51922 MATERIALS | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
| 1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
| 1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
| 10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| 20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| 24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
| 4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
| 48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| 50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
| 96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
| 96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
| anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
| block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
| glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
| glass pipette | VWR | 14673-010 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| glycine | Sigma | G8898 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
| INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
| MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
| MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
| multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
| plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
| pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
| Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
| small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
| staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |
References
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish—emergence of a new model vertebrate. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Dahm, R., Geisler, R. Learning from small fry: the zebrafish as a genetic model organism for aquaculture fish species. Mar. Biotechnol. (NY). 8 (4), 329-345 (2006).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view). Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Hsu, C. H., Wen, Z. H., Lin, C. S., Chakraborty, C. The zebrafish model: use in studying cellular mechanisms for a spectrum of clinical disease entities. Curr. Neurovasc. Res. 4 (2), 111-120 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. , (2012).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Henken, D. B., Rasooly, R. S., Javois, L., Hewitt, A. T. The National Institutes of Health and the growth of the zebrafish as an experimental model organism. Zebrafish. 1 (2), 105-110 (2004).
- Sprague, J., et al. The Zebrafish Information Network: the zebrafish model organism database provides expanded support for genotypes and phenotypes. Nucleic Acids Res. 36, (2008).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the Zebrafish Model Organism Database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Howe, D. G., et al. ZFIN, the Zebrafish Model Organism Database: increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41, (2013).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93 (3), 268-280 (2011).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163 (2), 65-78 (2014).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3 (5), 454-460 (2010).
- Tsang, M. Zebrafish: a tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
- Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31 (2), 171-179 (2009).
- Peterson, R. T., Fishman, M. C. Designing zebrafish chemical screens. Methods Cell Biol. 105, 525-541 (2011).
- Tan, J. L., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods Cell Biol. 105, 493-516 (2011).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med. Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (3), 459-468 (2012).
- Peterson, R. T., et al. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Peterson, R. T., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat. Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
- Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
- Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (6), 943-953 (2013).
- Oppendal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- White, R. M., et al. DHODH modulates transcriptional elongation in the neural crest and melanoma. Nature. 471 (7339), 518-522 (2011).
- Lord, A. M., North, T. E., Zon, L. I. Prostaglandin E2: Making more of your marrow. Cell Cycle. 6 (24), 3054-3057 (2007).
- Goessling, W., North, T. E. Hematopoietic stem cell development: Using the zebrafish to identify the signaling networks and physical forces regulating hematopoiesis. Methods Cell Biol. 105, 117-136 (2011).
- Cutler, C., et al. Prostaglandin-modulated umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 122 (17), 3074-3081 (2013).
- Cao, Y., et al. Chemical modifier screen identifies HDAC inhibitors as suppressors of PKD models. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (51), 21819-21824 (2009).
- Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 794-802 (2010).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238 (3), 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), (2010).
- Tran, T. C., et al. Automated, quantitative screening assay for antiangiogenic compounds using transgenic zebrafish. Cancer Res. 67 (23), 11386-11392 (2007).
- Jing, L., Durand, E. M., Ezzio, C., Pagliuca, S. M., Zon, L. I. In situ hybridization assay-based small molecule screening in zebrafish. Curr. Protoc. Chem. Biol. 4, 2 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of fixed zebrafish embryo specimens. J. Vis. Exp. , (2014).
- Burns, C. G., et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nat. Chem. Biol. 1 (5), 263-264 (2005).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and Acute Kidney Disease: Translational Research Insights from Zebrafish Chemical Genetics. General Med. 1, 112 (2013).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: Insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospect., & challenges. Clin. Transl. Med. 2 (1), 11 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem. J. 444 (2), 153-168 (2012).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev. Dyn. 240 (8), 2011-2027 (2011).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and notch signaling. Dev. Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Murphey, R. D., Stern, H. M., Straub, C. T., Zon, L. I. A chemical genetic screen for cell cycle inhibitors in zebrafish embryos. Chem. Biol. Drug Des. 68 (4), 213-219 (2006).
- Williams, C. H., Hong, C. C. Multi-step usage of in vivo models during rational drug design and discovery. Int. J. Mol. Sci. 12 (4), 2262-2274 (2011).
