Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish
Summary
Il pesce zebra è un ottimo organismo sperimentale per studiare vertebrati processi di sviluppo e malattie umane modello. Qui, descriviamo un protocollo su come eseguire uno schermo manuale di chimica ad alta velocità in embrioni di zebrafish con tutto il montaggio ibridazione in situ (WISH) Lettura.
Abstract
Zebrafish sono diventati un diffuso organismo modello per studiare i meccanismi che sono alla base della biologia dello sviluppo e di studiare la patologia malattia umana a causa della loro notevole grado di conservazione genetica con gli esseri umani. Genetica chimici trattasi, il testare l'effetto che le piccole molecole hanno su un processo biologico e sta diventando un metodo popolare di ricerca traslazionale per identificare i composti terapeutici. Zebrafish sono specificamente attraente per utilizzare per la genetica chimica a causa della loro capacità di produrre grandi frizioni di embrioni trasparenti, che vengono fecondate esternamente. Inoltre, zebrafish embrioni possono essere facilmente trattati con farmaci con la semplice aggiunta di un composto per il supporto embrioni. Usando tutto il montaggio ibridazione in situ (WISH), espressione di mRNA può essere chiaramente visualizzato all'interno di embrioni di zebrafish. Insieme, con la genetica chimici e WISH, il pesce zebra diventa un contesto organismo intero potente in cui per determinare il cellulare e fisiologicaeffetti di piccole molecole. Innovativi progressi sono stati fatti nel campo delle tecnologie che utilizzano procedure di screening basate sul computer, ma per molti laboratori tali opzioni non sono accessibili o rimangono un costo proibitivo. Il protocollo qui descritto spiega come eseguire uno screening genetico manuale di high-throughput chimico che richiede risorse di base e può essere realizzato da un singolo individuo o gruppo piccolo in un periodo efficiente del tempo. Così, questo protocollo fornisce una strategia praticabile che può essere implementato da gruppi di ricerca di eseguire la genetica chimici in zebrafish, che può essere utile per acquisire conoscenze fondamentali nei processi di sviluppo, meccanismi di malattia e di identificare nuovi composti e le vie di segnalazione che hanno applicazioni clinicamente rilevanti .
Introduction
L'identificazione di efficaci farmaci terapeutici per il trattamento di malattie umane è il finale di partita per molti ricercatori biomedici. Mentre l'identificazione e la caratterizzazione di potenziali agenti farmacologici per le applicazioni cliniche ha valore evidente per l'assistenza sanitaria, è rimasta una sfida significativa. In definitiva, lo sviluppo di molti composti terapeutici deriva dalla conoscenza di come specifici tipi cellulari o sviluppano o funzione. Il zebrafish, Danio rerio, è un teleostei d'acqua dolce della famiglia dei ciprinidi che è diventato un modello tradizionale organismo in biologia dello sviluppo 1. Zebrafish sono geneticamente vertebrati trattabili che sono facili da mantenere e manipolare per gli studi scientifici 2,3. L'embrione zebrafish è trasparente, fecondato esternamente, e può essere prodotto da centinaia da una singola coppia di accoppiamento adulto in una sola settimana 2,3. Inoltre, i principali sistemi zebrafish organi di azioni e in possesso di un grande degree di somiglianza genetica con i mammiferi, compreso l'uomo 4. Sorprendentemente, il 70% dei geni umani hanno un ortologo zebrafish 4. A causa di questa somiglianza, zebrafish essere un sistema sperimentale di grande rilevanza per lo studio dei meccanismi di sviluppo dei vertebrati e fisiologia, e sono stati impiegati ricapitolare una moltitudine di malattie umane 5-7. Queste ragioni, tra gli altri, hanno fatto il pesce zebra un candidato ideale per continuare gli interrogatori genetici e ha portato ad un apprezzamento sempre crescente per l'utilità di zebrafish nella ricerca biomedica 6,7.
Nel corso degli ultimi decenni, una grande varietà di strumenti genetici sono stati sviluppati in zebrafish. Il genoma zebrafish è suscettibile di mutagenesi e transgenesi 3. Fino ad oggi, una pletora di forward e reverse studi genetici sono stati effettuati, porta alla generazione di oltre 9.000 mutanti 3. Inoltre, numerose linee transgeniche devono essereen creato, che hanno permesso l'etichettatura e l'isolamento di specifici tipi cellulari 3. Ci sono stati notevoli sforzi in corso per centralizzare e distribuire queste risorse per la comunità di ricerca, che sono accessibili per i laboratori ad un piuttosto basso costo attraverso il Zebrafish Resource Center International (Zirc) 8. Inoltre, un vasto archivio di informazioni biologiche e di strumenti molecolari, che vanno dai modelli di espressione genica di morfolino sequenze e protocolli, sono stati progressivamente annotato sul Network Information Zebrafish (ZFIN) 9-11. Queste infrastrutture di ricerca di zebrafish sono stati resi possibili attraverso un significativo sostegno NIH e la promozione di questo modello animale 8. Questa cache di mutanti di zebrafish, linee transgeniche, e le informazioni pertinenti continua ad essere di eccezionale valore per la comunità di ricerca biologica in generale. Tuttavia, mentre zebrafish sono ormai un organismo modello consolidato e preminente, che rappresentano a largely serbatoio inutilizzato per lo studio della biologia dello sviluppo e della malattia attraverso l'uso di schermi genetici chimici.
Genetica chimici è l'uso di piccole molecole, come farmaci o altri composti, ad incidere un processo biologico all'interno di un sistema vivente 12. La genetica chimici possono essere implementate per comprendere i meccanismi molecolari della funzione del gene, in modo da identificare gli agenti che il salvataggio o esacerbare un difetto genetico specifico 12. Inoltre, la genetica chimica rappresenta una importante via per condurre una ricerca traslazionale 12. Mentre schermi genetici avanti tradizionali in modelli animali sono stati tremendamente potente nel collegare geni specifici per le malattie, non hanno una dimensione temporale, il che rende difficile o talvolta impossibile osservare fenotipi che deriverebbero dopo embriogenesi precoce. Inoltre, la ridondanza gene può rendere i risultati osservati dalla genetica a termine di difficile interpretazione. In alternativa, schermi genetici chimiciconsentire il controllo fine temporale e fornire allo stesso tempo un prezioso punto di partenza per la scoperta di farmaci 12,13.
Genetica chimici possono essere eseguite utilizzando sistemi in vitro (ad esempio, linee cellulari, proteine) o mediante un sistema in vivo, come un intero organismo. Utilizzando un sistema in vitro per genetica chimica può essere vantaggioso perché è più semplice di un sistema organismo complesso, più facile da lavorare su larga scala, meno costosa e meno tempo ad alta intensità. Di conseguenza, i sistemi in vitro permettono sia ad elevata capacità di screening (HTS) e lo screening ad alto contenuto (HCS). Ci sono una serie di vantaggi di utilizzare un sistema in vitro da considerare quando si avvicina genetica chimica, ma anche significative limitazioni. Una limitazione importante da utilizzando una linea cellulare è che le piccole molecole possono essere efficaci e non tossici in una linea cellulare specifica, ancora diventato tossico quando introdotto in un intero organismo. Così, il punto crucialedel problema è che in vitro sistemi non catturano vasto contesto di un organismo e quindi non sempre sono in grado di imitare accuratamente ciò accade in un intero organismo. Durante il test composto negli organismi interi può aggirare questi problemi, l'utilizzo di modelli di organismi interi mammiferi pone una serie di limitazioni fisiche ed etiche. Ad esempio, screening di farmaci nel topo è logisticamente ostacolato dallo spazio e costi necessari per testare un campione di dimensioni adeguate. Inoltre, le domande di sviluppo possono essere difficili da studiare, a causa del fatto che i mammiferi sviluppano in utero. Infine, mentre la conduzione della ricerca biomedica ha un immenso valore sociale, ci sono comunque le esigenze sostanziali per la tutela del benessere degli animali, limitando studi intensi e alleviare il dolore e la sofferenza degli animali utilizzati per la ricerca. Zebrafish fornire un valido sostituto di lavorare con vertebrati superiori come i mammiferi, e, inoltre, molti argomenti possono essere studiate usando la genetica chimiche agli stadi embrionali e larvali in caso di trattamento neurologico è assente o operativa ad un basso livello di 12,13.
Fino ad oggi, una miriade di schermi genetici chimiche sono state eseguite utilizzando zebrafish embrioni in particolare, come la consegna composto può essere realizzato immergendo embrioni in mezzi contenenti il farmaco di interesse 12-15. Inoltre, ci sono stati numerosi progressi scientifici e tecnologici per rendere gli schermi genetici chimici possibile e gestibile 16-20. Peterson e colleghi sono stati i primi ad utilizzare zebrafish in uno schermo genetica chimica nel 2000, e più tardi nel 2004 hanno identificato un composto che ha soppresso una mutazione coartazione aortica in zebrafish 21,22. Schermi chimici allora sono stati implementati per studiare diversi tessuti in via di sviluppo (ad esempio, il cuore, i vasi sanguigni, 23-25), funzioni fisiologiche (ad esempio, basi neurologiche del comportamento) 26, la rigenerazione adulti 27,28, e diseas modelli e (ad esempio, la distrofia muscolare e il cancro) 29,30. Tra questi schermi chimici zebrafish, la scoperta che le prostaglandine regolano le cellule staminali ematopoietiche è stata presa per gli studi clinici sugli esseri umani, dimostrando il potere di spostare da "serbatoio al capezzale" 23,31-33 (NIH, Clinica Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Più di recente, promettenti terapie candidati sono emersi per gli organi complessi come il rene, che rimedio ai patologia cellulare nella malattia del rene policistico (PKD) 34 e danno renale acuto 27,35, anche se questi devono ancora passare alla sperimentazione clinica. Questi schermi genetici chimici ampiamente dimostrano l'utilità di testare piccoli composti in zebrafish sviluppo e la capacità di applicare la genetica chimici per interrogare funzione di tessuto adulto. Inoltre, vi è un crescente elenco di collezioni di farmacologia disponibili in commercio che sono disponibili per gli studi accademici 19.
ove_content "> Negli ultimi anni, ci sono stati importanti progressi nella tecnologia chimica screening genetico, compreso l'uso di sistemi automatizzati di robot per l'erogazione e la gestione della droga, insieme a sistemi di imaging automatizzati 36-38. Tali sistemi prevedono la possibilità di testare molte migliaia di composti per ottenere sia HTS e HCS 36-38. Purtroppo, l'impresa di schermi genetici chimici con queste imprese innovative robotici in genere richiedono notevoli risorse. Questi tipi di risorse sono un ostacolo significativo per molte istituzioni che non hanno il capitale per l'acquisizione , operare e mantenere tale strumentazione. Pur stabilendo l'infrastruttura per la gestione robotizzata di librerie chimiche, compreso il trasferimento di embrioni schierati piatti, rimane il costo proibitivo per molti laboratori, imaging e analisi automatizzata è in genere più accessibile 12. proiezione di immagini automatica permette di quantificare di fluorescenza re transgenicofacchini e facilita l'analisi fenotipica specifico 12,15.Anche se i sistemi automatizzati rappresentano utili progressi tecnologici, molte domande possono essere affrontate da schermi manuali più mirate, come ad esempio la query di diverse migliaia di composti biologicamente attivi in un processo di sviluppo di un intero-mount ibridazione in situ (WISH) lettura 39. Inoltre, mentre un numero crescente di laboratori hanno invocato schermi chimici zebrafish per indagare su una domanda di ricerca, pochi saturazione (se presente) hanno raggiunto gli sforzi e molti argomenti non sono ancora stati violati con la genetica chimici. Schermi chimici possono essere eseguite con una piccola colonia zebrafish costituito da un solo tipo selvaggio pochi o serbatoi transgenici. Pertanto, questa forma di interrogatorio genetica deve essere raggiungibile dalla maggior parte dei gruppi di ricerca di zebrafish interessati ad ampliare / diversificare in questa arena. Librerie chimiche di varie dimensioni possono essere prelevati da un distributore commerciale e / o colboratori. Per questi motivi, la genetica chimici possono essere economicamente fattibile anche in dure climi finanziamento. Tuttavia, ci sono ostacoli ad iniziare una schermata genetica chimici, come il modo di pianificare gli aspetti logistici dello schermo: ad esempio, il numero di personale necessario per uno schermo di successo, l'assegnazione del tempo dedicato e mettere insieme un protocollo fisico di campioni elaborare manualmente che numero da centinaia a diverse migliaia. Qui, i dettagli di un protocollo di high-throughput manuale per effettuare la genetica chimici nell'embrione zebrafish con WISH come read-out. Questo metodo comporta il trattamento farmacologico di embrioni di zebrafish, seguita da rilevamento riboprobe di trascritti di mRNA. Usando questo protocollo, un piccolo team o anche di un solo individuo può ragionevolmente schermo e analizzare una biblioteca chimica modesto di circa 600 composti nell'arco di 9 settimane.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetica chimici nel zebrafish può avere un impatto critico sulla progressione della scoperta di nuovi farmaci. Questo protocollo fornisce un metodo high-throughput manuale per eseguire la genetica chimiche in embrioni di zebrafish con un desiderio di lettura, che consente in modo efficace un team individuo o piccolo per condurre un piccolo schermo molecola. Questo metodo minimal-risorsa estende la fattibilità della genetica chimici per molti gruppi di ricerca. In particolare, questa strategia schermata fornisce un'importante alternativa all'uso di strumentazione robotica, in cui tali sistemi non sono ampiamente accessibili attraverso dipartimenti di ricerca. Questa schermata manuale permette un singolo individuo per testare una piastra da 96 pozzetti di composti con una lettura WISH in una settimana lavorativa di 6 giorni. Dal momento che zebrafish sono ovipari, con gli embrioni in via di sviluppo al di fuori del genitore, e gli embrioni sono abbastanza grandi da vedere ad occhio nudo (tra 1-3 mm), sono suscettibili per la movimentazione manuale con strumenti semplici e il ricercatore può campioni di matrice inpiastre multi-pozzetto senza l'uso di un microscopio. Inoltre, poiché zebrafish sviluppano rapidamente, piccola esposizione molecola può essere efficace con un singolo trattamento di un composto, invece di dosi ripetute, che minimizza l'ulteriore elaborazione manuale. Zebrafish embrioni sono facilmente coltivate perché la loro tuorlo fornisce una fonte di alimentazione fino a 5-6 giorni dopo la fecondazione, che elimina la complicazione di avannotti alimentazione. Inoltre, la maggior parte degli organi larvali hanno sviluppato e diventare funzionale durante questo periodo, che prevede la possibilità di studiare una vasta gamma di domande di ricerca. La semplice aggiunta di piccole molecole ai media embrione di incubazione non è invasivo e permette al ricercatore (s) per selezionare per la dose di droga, il tempo di più, e la durata di esposizione fornendo così uno stretto controllo su molte variabili e consentendo processi di sviluppo specifici di interesse da interrogare. Come descritto qui, significativa la produttività della ricerca può essere raggiunto in un breve timeframe utilizzando questa metodologia schermo manuale. Nella nostra esperienza, vi è un elevato ritorno sullo sforzo investito, che può essere accentuata utilizzando una libreria chimica bioattivo noto per analizzare un processo di interesse, quali la segmentazione nefrone durante lo sviluppo renale (Figura 4; Poureetezadi e Wingert, non pubblicato).
Lo schermo chimico manuale a qui descritto è eccezionalmente versatile perché si tratta di un test su campioni di zebrafish fisse. Ad esempio, questa strategia può essere modificato per testare diversi piatti di composti in una settimana e poi a segnare embrioni settimana successiva. Test alternativi su campioni di zebrafish fissi, come immunoistochimica o altro di colorazione dei tessuti preparati, potrebbero anche essere sostituita da un WISH di lettura. Strategie sperimentali per eseguire test cellulari in zebrafish sono adattabili a causa della chiarezza ottica e la trasparenza delle fasi precoci dello sviluppo. Inoltre, i ricercatori in grado di inibire la pigmentazione in seguito staGES uso di prodotti chimici o evitare la complicazione di sviluppo del pigmento del tutto attraverso l'uso di linee genetiche pigmento-meno come Casper o pura zebrafish 13. E 'fattibile per gestire manualmente piccole molecole, elaborare la macchia (s) di interesse, e di segnare manualmente embrioni utilizzando un semplice stereomicroscopio. Tuttavia, è importante tenere presente che l'analisi automatica delle immagini può essere eseguita, e può infatti essere necessaria per l'analisi fenotipica alta risoluzione. Ad esempio, può essere preferibile partner di un sistema di analisi delle immagini automatizzata con un saggio diretta, come reporter transgenico, in quanto ciò semplifica il trattamento manuale dei campioni, quantifica le differenze non facilmente distinguibili ad occhio nudo, ed elimina ricercatore polarizzazione 15. Fortunatamente, alcuni sistemi di imaging automatizzati sono sia facile da usare ed economico in termini di costi del software 15. L'uso e le capacità di altri sistemi automatizzati sono rapidamente evoluti e in grado diessere utilizzata per gli organismi orientare, gestire trattamenti farmacologici, e persino di trasferirsi organismi 12,15. Questi sistemi automatizzati hanno annunciato una nuova era tecnologica della ricerca e hanno fornito soluzioni innovative di manipolare grandi quantità di soggetti di prova ed eseguire HTS quindi e HCS approcci negli organismi interi 12,15. Anche se tali macchine sono innegabilmente strumenti utili, ma sono anche molto costosi e sono fuori dalla portata di molti laboratori di ricerca di base. Senza l'accesso a queste funzionalità automatizzate può sembrare che gli schermi chimici non sono possibili. Tuttavia, questo protocollo delinea una guida per come condurre uno schermo manuale che può essere utilizzato per completare una schermata genetica chimica in modo pratico per un periodo di tempo ragionevole.
Esistono svantaggi per entrambi di screening e chimiche genetica manuali in genere, e dovrebbero essere tenuti a mente quando si considera uno schermo chimico. In particolare, il metodo illustrato qui richiede un grado moderatodi destrezza fisica. Questa preoccupazione è ridotta o del tutto ovviato attraverso la ripetizione, come destrezza migliorerà con la pratica. Inoltre, c'è spazio per il minimo errore grossolano, in quanto ci sono solo 10 embrioni per bene per l'analisi. Le molecole piccole possono variare nel penetranza del fenotipo che è indotta, in modo da un regime di punteggio ragionevole per identificare i composti di interesse devono essere rispettate. E 'fondamentale che i ricercatori utilizzano questo protocollo elaborare criteri sufficientemente rigorosi per quello che prenderà in considerazione un successo. E 'anche importante tenere presente che la natura di questa forma di uno schermo molto probabilmente produrrà una certa porzione di falsi positivi, che possono essere delineate attraverso un ulteriore chimica work-up. Inoltre, è fondamentale mettere in scena gli embrioni con precisione e di raccogliere frizioni per lo screening poco dopo la fecondazione, lo sviluppo asincrono può portare a complicazioni nel valutare con precisione l'effetto dei trattamenti farmacologici. Inoltre, per quanto riguarda lo screening chimico come un exstrategia sperimentale, ci sono una serie di limitazioni. Solubilità e tossicità di molecole carrier composto (ad esempio, dimetil solfossido (DMSO)) possono anche presentare un problema e possono essere proibitivi per testare molte molecole. Il corion può anche fungere da barriera alla esposizione al farmaco. Infine, anche se zebrafish sono un modello potente e traslazionale per genetica chimica, si deve sempre essere presa nel determinare se una strategia alternativa schermata chimica, ad esempio, utilizzando un sistema in vitro come ad esempio una linea cellulare, può essere sostituito per l'uso di tutta animali. Tuttavia, trattamento chimico nell'intero sistema zebrafish è considerato preferibile condurre approcci simili nei mammiferi, in quanto fornisce il vantaggio di raccogliere gli effetti sistemici dei composti e può permettere ai ricercatori di triage l'elenco dei composti da testare in un modello di mammifero.
Fino ad oggi, gli schermi chimici zebrafish hanno fornito un potente strumento sperimentale to delineare i meccanismi di sviluppo e per accertare candidati agenti farmacologici per uso in medicina, come l'identificazione di molecole capaci di prevenire patologie malattia. Ad esempio, uno studio di Burns e colleghi hanno sviluppato un test di micro-e automatizzato per la frequenza cardiaca utilizzando embrioni di zebrafish transgenici che esprimono GFP nel miocardio 42. Hanno usato questa linea transgenica di analizzare la frequenza cardiaca in fase di sviluppo e come è stato influenzato in seguito al trattamento di droga 42. Un altro studio, testando la densità di popolazione di cellule staminali ematopoietiche in embrione zebrafish, ha rilevato che prostaglandina E2 regola la nicchia HSC 23. Questo risultato è stato convalidato nel topo, e successivamente è stato implementato per la sperimentazione clinica nel trapianto di cordone ombelicale umano 23,31-33 (NIH, Clinica Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Attraverso diversi studi recenti, la genetica chimica ha dimostrato di essere utile per lo studio delle malattie renali con il pesce zebra <sup> 43. Il rene zebrafish fornisce un eccellente paradigma per lo studio nefrogenesi o la rigenerazione del nefrone, l'unità funzionale che comprende il rene durante lo sviluppo e renale acuta lesioni 43. Struttura del nefrone è altamente conservata tra il rene embrionale zebrafish e il rene dei mammiferi adulti 44-50. Diversi studi che esaminano il rene embrionale zebrafish illustrano chiaramente la sua intrinseca potenzialità di traslazione quando accoppiato con la genetica chimici. Uno schermo genetica chimica è stata effettuata su due mutanti di zebrafish che sono stati associati al PKD2 e ift172 geni, che sono noti per essere protagonisti di malattia del rene policistico (PKD) 34. Lo schermo ha portato a identificare la deacetilasi pan-istoniche (HDAC) inibitori tricostatina A (TSA) come una piccola molecola in grado di annullare i difetti morfologici normalmente visto negli embrioni mutanti. Un approccio diverso presa da de Groh e colleghi screening per composti che INDUCed edema in wild-type embrioni di zebrafish, che indicherebbe una perturbazione della funzione renale 35. Dopo aver identificato PTBA come un colpo, hanno osservato che oltre a causare l'edema, PTBA anche aumentato l'espressione di pax2a, un marker per progenitori renali. È importante sottolineare che un derivato ottimizzata di PTBA è stato poi dimostrato di diminuire la percentuale di mortalità di zebrafish adulto che ha subito danni ai reni gentamicina-indotta e, inoltre, ha accelerato il recupero di topi che soffrivano di danno renale 27. Nel loro insieme, questi contributi dalla genetica chimici zebrafish vetrina i tipi di scoperte che possono essere fatte con il metodo descritto in questo protocollo.
Mentre la ricerca genetica chimici porta il merito sostanziale, non è senza alcuni problemi. Unicamente utilizzando un approccio genetica chimica può rendere complicato per determinare il gene oi geni specifici che vengono colpiti da un composto. Anche se viene trovata una destinazione (s), un SIgap gnificant può rimanere tra l'identificazione del composto e la comprensione del meccanismo (s) di azione in cui la piccola molecola si comporta. Ad esempio, può essere difficile determinare il meccanismo in cui una piccola molecola agisce poiché un singolo composto è in grado di avere una serie di effetti diversi all'interno di un organismo. Tuttavia, con l'avvento di nuove tecnologie e schermi genetiche più chimiche in fase di completamento in zebrafish, il problema di determinare un meccanismo sta diminuendo. Un metodo per determinare gli effetti molecolari dei composti identificati è quello di selezionare una libreria di droga bioattivi noti per lo screening, in cui meccanismi possono essere potenzialmente dedotte da dati precedentemente annotati. Inoltre, gli algoritmi chemoinformatic, come cancello Discovery, sono disponibili per l'uso che si possa paragonare somiglianze strutturali di un composto con un database di composti con meccanismi attribuiti 14. Un altro modo per chiarire il meccanismo di un composto sarebbe quello di generare un microarray profilo dopo il trattamento e quindi interrogare questo profilo in una raccolta di profili di droga microarray, come ad esempio la connettività mappa, la ricerca per i composti meccanicamente definiti che provocano un effetto simile 14. Questo approccio può essere utilizzato per identificare mutanti genetici che hanno un effetto simile a quello del composto di interesse. Trovare una connessione tra un composto e un mutante potrebbe suggerire che il composto funziona molecolarmente monte oa valle del relativo gene, che potrebbe essere delineato trattando i mutanti con il composto e Morpholinos. Un'altra opzione sarebbe quella di spettrometria di massa, che continua a diventare più ottimizzato per zebrafish. Questo metodo può essere utilizzato per delineare cambiamenti proteici specifici o modificazioni post-traduzionali dopo il trattamento farmacologico. Infine, piccole molecole o anche intere biblioteche sono a volte in grado di essere etichettato per la discesa di partner vincolanti. E 'anche interessante notare che, mentre il meccanismo di come una piccola molecola funzioni is di notevole importazione, ci sono farmaci approvati dalla FDA per il quale i meccanismi rimangono sconosciute.
Anche se zebrafish presentano molte somiglianze con i mammiferi sia geneticamente e fisiologicamente, vi è ancora un problema di attraversamento di droga 14. Uno studio ha valutato la capacità di crossover dei colpi da uno schermo per gli inibitori del ciclo cellulare in embrioni di zebrafish 50. Lo schermo ha portato all'identificazione di 14 risultati che erano precedentemente sconosciute di possedere un'attività ciclo cellulare. Di questi 14 composti, 6 sono stati trovati ad avere attività del ciclo cellulare in entrambi i saggi di colture cellulari umane e zebrafish, 3 sono stati dimostrato di essere siero inattivato in saggi di coltura cellulare, 1 era attivo solo nelle cellule zebrafish, e 4 avevano alcuna attività in entrambe le zebrafish o test di coltura cellulare umana, ma solo in tutto l'organismo zebrafish. In particolare, i 4 composti che avevano solo l'attività nel zebrafish dimostrano che non vi sono differenze tra zebrafish e mammiferi che possono prohibit il potenziale traslazionale di alcuni composti. Questa è una considerazione importante essere consapevoli di, tuttavia ci sono esempi di piccole molecole, come PGE 2 che amplifica la capacità delle cellule staminali emopoietiche di attecchire nei soggetti umani e PTBA derivati che consentono di migliorare il tasso di recupero renale nei mammiferi, fornendo così la prova di principio che di crossover è possibile 23,31-33.
Indipendentemente da queste insidie, la genetica chimici e questo approccio minimal-risorsa ha molto da offrire alla comunità di ricerca. Genetica chimica è particolarmente utile nel pesce zebra e continueranno a svolgere un ruolo fondamentale nel interrogatori percorso molecolare e scoperta di nuovi farmaci. Schermi chimici a base di bersagli molecolari discreti sono storicamente soggetti ad un alto tasso di fallimento a causa di ciò che è noto come la costellazione di assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione, e tossicologici (ADMET) 51 proprietà. Schermi chimici che utilizzano zebrafish perconcentrarsi su un processo, piuttosto che un obiettivo discreta, può aggirare diversi problemi ADMET e identificare composti che sono efficaci nel contesto dell'intero organismo. Con la crescente pool di risorse disponibili per la ricerca zebrafish, tra cui attuali ceppi mutanti e la possibilità di utilizzare la modifica del genoma per creare mutanti genetici mirati e transgenici, ci sono praticamente un numero illimitato di potenziali schermi genetici chimici utilizzando zebrafish. Molte biblioteche chimiche sono state curate, e le collezioni di span con bioattivi noti, nuovi composti, strutturalmente diverse e di struttura simile. Questi reagenti forniscono una vasta gamma di interessanti opportunità per le combinazioni di schermate che sono attualmente disponibili e che sono destinata a crescere ulteriormente nei prossimi anni. Con queste possibilità in mano, questo protocollo manuale e high-throughput fornisce un modo pratico e user-friendly per aumentare la capacità dei gruppi di ricerca di intraprendere schermi genetici chimici utilizzando zebrafish.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento al laboratorio di ricerca Wingert dal seguente: National Institutes of Health concede K01 DK083512, DP2 OD008470, e R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar concessione di una sovvenzione # 5-FY12-75; avviare i fondi presso l'Università di Notre Dame College of Science e del Dipartimento di Scienze Biologiche; e un generoso dono alla Università di Notre Dame di Elizabeth e Michael Gallagher, a nome della famiglia Gallagher per promuovere la ricerca sulle cellule staminali. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta dei dati e l'analisi, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Ringraziamo Paul T. Kroeger, Jr. per fornire un feedback critico sul manoscritto. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche per il loro sostegno, e il Centro per la Ricerca Zebrafish a Notre Dame per il loro straordinario impegno nella cura e il benessere della nostra colonia zebrafish. Infine, ringraziamo i membri del nostro researlaboratorio ch per i loro commenti, discussioni e approfondimenti su questo lavoro.
Materials
| JoVE 51922 MATERIALS | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
| 1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
| 1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
| 10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| 20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| 24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
| 4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
| 48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| 50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
| 96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
| 96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
| anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
| block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
| glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
| glass pipette | VWR | 14673-010 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| glycine | Sigma | G8898 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
| INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
| MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
| MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
| multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
| plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
| pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
| Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
| small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
| staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |
References
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