Larvale RNA interferentie in de Rode Bloem Kever,<em> Tribolium castaneum</em

1 T. castaneum Voorraden en kweken Beslis over een T. castaneum stam gebruikt voor het experiment. OPMERKING: Verschillende-lab opgericht T. castaneum stammen beschikbaar. Ga-1 (Georgia-1) is de ouderstam van Ga-2 die werd gebruikt voor genoom 3. Aangezien Ga-1 aandelen meest DNA polymorfismen (zoals single nucleotide polymorphisms, SNPs) met Ga-2 en gezonder is dan Ga-2 door minder inteelt, het is ideaal voor RNAi experimenten. Pu-11 is een andere handige stam te gebruiken , zoals de unieke verbeterde geel fluorescerend eiwit (EYFP) expressie in de toekomst vleugel primordia stelt ons in staat om de laatste larvale instar van andere stadia te onderscheiden (zie Figuur S4 van Clark-Hachtel et al. 2013 12). Het is belangrijk om te documenteren dat beetle stam werd gebruikt in het experiment, zoals genetische achtergronden bijvoorbeeld verschijnen affect de RNAi fenotypen 13. Bereid T. castaneum cultuur meel met 5% toe te voegen (in gewicht) van gist vooraf gezeefd brouwer om meel organisch volkoren (na mengen, slaan de kweek meel bij -20 ° C). Aliquot de kweek meel (bij kamertemperatuur) in 6 ml plastic Drosophila voorraad flessen (ongeveer 40 g / fles). Cultuur T. castaneum bij 30 ° C met 70% luchtvochtigheid. Gebruik een luchtvochtigheid gecontroleerde incubator indien mogelijk. Voeg 30-40 volwassenen per cultuur fles (man: vrouw verhouding 1: 1) aan de cultuur beginnen. Opmerking Hoewel matrijs zelden een probleem bij 30 ° C, lagere temperaturen (bijvoorbeeld 25 ° C) met 70% vochtigheid kunnen schimmelgroei in de kweek bloem veroorzaken. Verlaag de luchtvochtigheid als dit gebeurt. Breng de volwassenen om een ​​nieuwe cultuur fles elke twee weken voor subcultuur (zie stap 5,2-5,5 voor hoe volwassenen van bloem cultuur te isoleren). OPMERKING: Het duurt ongeveer drie weken de tijd om de larven van de laatste instar verkrijgen. Alternatieftend, T. castaneum culturen bij een lagere temperatuur (20-25 ° C) worden gehouden, zij het ​​met een lange kweekperiode (ontwikkelingstijd bij 25 ° C is ongeveer het dubbele bij 30 ° C). 2 Voorbereiding van oplossingen en instrumenten voor Larvale dsRNA Injectie Samenstel dsRNA moleculen homoloog aan het doelgen door in vitro transcriptie. Bewaren bij -80 ° C. Zie Philip en Tomoyasu 2011 11 voor gedetailleerde moleculaire biologische werkwijzen. Zie tevens voor een aantal parameters die moeten worden overwogen bij het ontwerpen dsRNA moleculen. Voeg 10 ml 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,6 bij 25 ° C) door mengen van 8,5 ml van 1 M Na 2 HPO 4 1,5 ml van 1 M NaH 2PO 4. Controleer de pH met een pH-meter en dienovereenkomstig aanpassen. Voeg 1 ml van 10x injectie buffer door 10 pl van 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,6 bij 25 ° C), 100 _6, l 0,5 M KCl, 100 ui groene voedingskleurstof en 790 ui dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O). Verdun de 10x injectie buffer om 2x injectie buffer (200 ul 10x injectie buffer + 800 ul DDH 2 O) te maken. WINKEL zowel 10x en 2x injectie buffers bij 4 ° C totdat het nodig is. Bereid Sticky glazen dia's. Bedek een hele glasplaatje met een vorm van herpositioneerbare lijm voor larvale injecties. Voor een volwassene of pupal injecties, maken twee dunne reepjes van lijm langs de lange randen van de glijbaan. Laat de lijm drogen meerdere dagen, die ervoor zorgt dat de lijm nog kleverig genoeg kevers de dia hechten, maar ook de overblijvende buigzaam genoeg om hun verwijdering na injectie te vergemakkelijken. OPMERKING: Als de lijm blijft te plakkerig, gebruik dan een vinger en tik op de lijm, die de kleverigheid zal verminderen. Elke dia kan maximaal 40 of 50 kevers, en kan worden hergebruikt totdat het er niet in slaagt om veilig te houden van de dieren. Alternatively kunnen dubbelzijdige tape worden gebruikt, hoewel de band is soms niet genoeg om de larven te houden lijm. Maak een etherisatie Mand. Verwijder de zuiger uit een 10 ml wegwerpspuit, en snijd de spuit in de helft rond de 6 ml lijn. Gooi de onderste helft van de spuit. Kort verwarmen het snijvlak van het bovenste gedeelte van de spuit met een gasbrander en snel op een stuk nylon mesh duwen de gesmolten kunststof die de mazen op de injectiespuit lijm. Knip het overtollige gaas zodra de plastic verhardt. Bereid de ether fles. Voeg 30 ml ether in een smalle mond 100 of 250 ml glazen fles. Voeg verschillende stukken vloeipapier om de verdamping van ether verbeteren. OPMERKING: Ether levert brandgevaar en is ook schadelijk. Handvat ether altijd onder een afzuigkap. Sluit het deksel stevig vast terwijl het niet in gebruik is. OPMERKING: Het ijs kan worden gebruikt als een veiliger alternatief (zoals in een klaslokaal), hoewel de sedation is minder effectief. 3 Voorbereiding van Larval Injectie Apparatus Een XY kruistafel op een dissectie microscoop. OPMERKING: XY mechanische stadia zijn verkrijgbaar bij grote microscoop bedrijven. Alternatief kan goedkoop microscoop fasen worden gebruikt voor de meeste ontleden microscopen met enkele wijzigingen (zie Materialen tabel bijvoorbeeld). Plaats een mechanische manipulator naald in de buurt van de XY kruistafel. Monteer een injectie spuit. Gebruik een vier-weg kraan (met Luer verbindingen) een 30 ml wegwerpspuit verbinding met een glas naaldhouder, waardoor manipulatie van de injectiespuit zonder de druk in de injectienaald (zie Philip en Tomoyasu 2011 11 voor het openen injectiespuit assemblage). 4 Pulling injectienaalden Trek borosilicaatglas naalden (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm lang) met eennaald trekker. OPMERKING: Voor Sutter P-87 of P-97, gebruikt u de instelling "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tijd = 90" of volg hoofdstuk 2 van de Pipette Kookboek Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, en zebravis – Aanbevolen Programma. De optimale instellingen variëren afhankelijk van het model van de naald trekker. Het decor voor een generieke Drosophila injectienaald is een goed uitgangspunt. Winkel trok naalden in een plastic behuizing (bijvoorbeeld een plastic cd-doosje) en zet deze vast met afneembare montage stopverf. 5 Isolatie en Selectie van Larven Plaats een # 25 zeef op een zeef ontvanger. Breng de inhoud van de Kultuurfles (kevers en meel cultuur) op zeef onmiddellijk zeef de inhoud. Laat de inhoud van de zeef niet verlaten zonder het ziften, zoals larven zullen snel proberen te graven door de zeef en vast komen te zitten. Agressief ziften de inhoud aan de bloem te laten vallendoor en laat oudere larven (meestal 6e en 7e instar larven), poppen en volwassen (samen met hun afgedankte cuticula, exuviae) achter bovenop de zeef. Breng het op de zeef (kevers en exuviae) het zaad pan materialen. Houd de pan om te voorkomen dat de kevers ontsnapt tikken. Verwijder de exuviae en bloemdeeltjes dat op het oppervlak van de kevers door zachtjes blazen via zaad pan. Tik het zaad pan om de inhoud naar de onderkant van de pan. Dan, laat de pan nog niet aangeboorde gedurende enkele seconden. Wachten voor de volwassenen, die mobieler dan andere stadia zijn, om uit te komen van de stapel. Verwijder volwassenen met een kunst penseel (bijvoorbeeld 1 cm breedte). Afzonderlijke poppen door voorzichtig kloppen de zaad pan terwijl de monding van de pan iets omlaag, zoals poppen neiging om sneller naar de mond rollen. Gebruik een penseel om de poppen te verwijderen, waardoor alleen de larven op het zaad pan. Place de geïsoleerde larven in een schone petrischaal. Selecteer een geschikt stadium van de larven voor injectie en plaats ze in een aparte petrischaal. OPMERKING: larven Begin vorig instar (1-2 dagen na de laatste larvale molt) zijn vaak geschikt zijn bij het analyseren van de RNAi effect op volwassen morfologie als op metamorfose. Het is echter soms noodzakelijk om RNAi presteren op de voorlaatste (of zelfs eerder) stadium te vroeg gen-functie te evalueren (bijvoorbeeld figuren 3E-3H. Zie ook Clark-Hachtel et al. 2013 12). Gebruik poppen als een grootte verwijzing naar de instar larven identificeren. De larven laatste instar zijn iets langer dan de poppen. Alternatief kan pu-11 worden gebruikt om de laatste instar larven identificeren en het tijdsverloop van de ontwikkeling van larven laatste instar (Figuur S4 van Clark-Hachtel et al. 2013 12) te bepalen. Houd de geselecteerde larven in een petrischaal tot etherisatie. Leg de restvan larven en in andere stadia van kevers (zoals poppen en volwassenen) terug in een cultuur fles met bloem en terug te sturen naar de couveuse. 6 Voorbereiding van injectienaalden Plaats een eerder getrokken glazen naald op een glazen objectglaasje met behulp van kleverige tack of dubbelzijdig tape. Behulp van een tang, het testen van de getrokken uiteinde van de naald tijdens het kijken door de microscoop ontleden om te zien waar de punt bochten. Pak het gebied enigszins in de richting van de punt kant van waar de naald bochten met de tang en draai te breken. Houd goede naalden en gooi anderen. Overweeg een goede naald als het hebben van een opening die is niet te groot of te klein (ongeveer 0,05 mm diameter. Figuren 1A en 1B), en een hoek om de penetratie van de larvale cuticula makkelijker (Figuren 1B en 2A-2B) te maken. Overweeg een slechte naald als (i) te klein is, waardoor de opname van dsRNA oplossing in de naald moeicult (stap 7) (figuren 1D en 2D), (ii) te groot, waardoor larven schade en mogelijke letaliteit bij injectie (Figuren 1C en 2F), (iii) stomp, waardoor penetratie van de cuticula moeilijke en toenemende verwondingen. Steek de naald in de naaldhouder. Eerst draai de punt van de naaldhouder en plaats de achterkant van de naald in de houder tip. Plaats vervolgens de rubber afdichting onder de houder tip (minimaal 1 cm vanaf de achterkant van de glazen naald). Plaats de achterkant van de naald in de houder, met de rubberen pakking geheel in de opening van de naaldhouder. Schroef de tip terug op de houder. Plaats de geassembleerde naaldhouder op de naald manipulator. Houd de naald houder dicht bij horizontaal. Pas de positie van de manipulator, zodat de punt van de naald is gelegen in het centrum van het zicht bij het kijken door de microscope. 7 Frontloading dsRNA Oplossing in de Naald Bereid de dsRNA injectieoplossing net vóór injectie door aanpassing van de concentratie DDH 2 O en mengen van de dsRNA oplossing gelijke volumes 2x injectie buffer (stap 2.3). Houd de gemengde oplossing op ijs. Zie discussie over de dsRNA concentratie. Snijd de punt van een 20 ul wegwerp pipet tip. Pipetteer 10 ul van de oplossing in de bijgesneden pipetpunt. Verwijder voorzichtig de pipet tip van de pipet terwijl u de vloeistof aan het uiteinde door het verstrekken van tegendruk. Alternatief, verwijder voorzichtig de punt en vervolgens de oplossing op het einde van de tip door druk met een vinger. Plaats de pipetpunt met dsRNA oplossing op de microscooptafel middels kleverig kopspijker met de opening naar de punt van de naald. Kijken door de microscoop, langzaam bewegen de geladen tip in de richting van de naald tot aan de punt van denaald zich net in de geladen pipet en in de oplossing. Kijk door de microscoop, trek de zuiger van de injectiespuit langzaam trek de dsRNA oplossing in de naald. OPMERKING: Raak de naald niet te vol. Als het einde van het dsRNA oplossing zal de punt van de naald, vertragen de snelheid van het trekken en stoppen laden van de oplossing vóór de punt van de naald zou lucht bereikt. Als er lucht de tip bereikt, zal de oplossing snel worden getrokken in de naaldhouder, wat resulteert in ernstige verontreiniging kwesties. Gedetailleerde reinigingsprocedures van de naaldhouder worden beschreven in Philip en Tomoyasu 2011 11. Haal de druk van de injectie spuit en naald houder door het openen van de kraan. Beweeg de pipet uit de buurt van de punt van de naald. Zet de naald omhoog vanaf het podium om te voorkomen dat per ongeluk schade aan de naald, terwijl het plaatsen van de larven op het podium. Verwijder het geleegd pipet tip van het podium. </ol> 8 dsRNA Injectie Plaats de larven in de etherisatie mand. Met minder dan 10 larven als het leren van de techniek. Gebruik 30-40 larven in een ronde eenmaal vertrouwd bent met de techniek. Plaats de mand met larven in de ether fles en sluit het deksel. OPMERKING: Ether levert brandgevaar en is ook schadelijk. Voer deze stap onder een afzuigkap. Etherize larven gedurende ongeveer 3 minuten. Controleer de larven voor beweging na 3 min. Weer terugplaatsen in de ether fles nog 30 seconden als ze nog steeds in beweging. Niet Etherize langer dan 5 minuten en deze letaliteit kan verhogen. OPMERKING: De optimale etherisatie kan variëren afhankelijk van de temperatuur en vochtigheid. Breng de etherized larven van de mand om de kleefvrije rand van een glas kleverige dia. Met behulp van een tang en terwijl kijken door de microscoop, pick-up elke larven een voor een en leg ze op de dia. Leg ze opzij en tik zachtjes naar beneden hun lichaam from kop tot staart met de tang, ze iets in rekken als je gaat, om ervoor te zorgen dat ze worden bevestigd op de dia. Leg de kleverige dia met larven op de microscoop podium. Steek de dsRNA geladen naald voorzichtig in de dorsale zijde van de larven te voorkomen dat schade aan het centrale zenuwstelsel. Ook voorkomen dat de dorsale middellijn, als de larvale hart is hier gevestigd. In deze en volgende stappen altijd de fase de larven over de naald (plaats van de naald manipulator om de naald te bewegen). OPMERKING: De specifieke injectieplaats maakt niet uit als RNAi in T. castaneum lijkt systemisch zijn. Het is echter gewoonlijk het gemakkelijkst om te injecteren op de dorsale zijde van de thoracale of abdominale segmenten. Na het inbrengen van de naald in de larven, trek de naald iets terug naar de kamer zorgen voor de dsRNA om de larvale lichaamsholte voeren. Druk voorzichtig op de injectiespuit totdat de larven worden groen (of de kleur van de injectie buffer) en een stretched en vol. OPMERKING: Indien de techniek leert, probeer zoveel mogelijk injecteren om de hoeveelheid oplossing die kan worden geïnjecteerd in een larve zonder noemenswaardige letaliteit bepalen. Het is gewoonlijk ongeveer 0,5-0,7 pl. Trek de naald uit de larven. Tijdens het verwijderen van de naald, iets terug te trekken op de injectie spuit om dsRNA verlies te voorkomen (ook voorzichtig zijn niet te trekken in de lucht). Injecteren alle larven op de dia. Zorg ervoor dat de larven die niet met succes werden geïnjecteerd verwijderen. Compleet injectie voordat larven wakker (in ongeveer 10 min). Verwijder de dia met ingespoten larven van de injectie microscoop en laat de dia nog 5 minuten totdat alle larven te herstellen van de verdoving. Met een tang en onder een microscoop ontleden, til de larven van kop tot staart om ze los te maken van de kleverige glijbaan. Plaats de onlangs vrijgegeven larven in een schone petrischaal. Laat de larven op de petrischaal voor 10-15 minuten om de injectie toe wond te stollen. Plaats de larven in een nieuwe fles met schone meel en label met de naam passend stam, het type dsRNA geïnjecteerd concentratie van dsRNA, aantal larven geïnjecteerd en de datum. Cultuur de larven geïnjecteerd bij 30 ° C met 70% luchtvochtigheid. Let op de larven voor RNAi fenotypes regelmatig. OPMERKING: De laatste larven verpoppen instar binnen 7 dagen. Vervolgens wordt de poppen Eclose tot volwassenen na 7 dagen (als er geen afwijking in timing door RNAi). 9 Bevestiging van Knockdown en fenotypische analyses Overweeg beoordeling efficiëntie van RNAi neerslaan door verschillende moleculaire biologische technieken, zoals kwantitatieve reverse transcriptie-PCR (qRT-PCR) en Western Blotting. Zie Miller et al. 2012 7 en Philip en Tomoyasu 2011 11 voor gedetailleerde qPCR en Western Blot-protocol, respectievelijk. Analyseer RNAi-gerelateerde fenotypes. OPMERKING: RNAi verwantefenotypen worden waargenomen op verschillende stadia en onder verschillende kweekomstandigheden, afhankelijk van de genen die waren gericht. RNAi kan invloed hebben op de kever morfologie, metamorfose, fysiologie en gedrag. Hoe vaak de aanwezigheid van fenotype wordt gecontroleerd en onder welke voorwaarden de kevers worden gefokt moeten worden toegesneden op de specifieke vragen die worden onderzocht door middel van RNAi.