Isolamento di distinte popolazioni cellulari dal cervelletto in via di sviluppo da Microdissection
Summary
Progenitori nestina-esprimendo sono una popolazione recentemente identificato di progenitori neuronali del cervelletto in via di sviluppo. Utilizzando la tecnica di microdissezione qui presentata in combinazione con fluorescenza-attivato cell sorting, questa popolazione cellulare può essere purificato senza contaminazione da altre regioni cerebellari e può essere coltivato per ulteriori studi.
Abstract
Microdissezione è una nuova tecnica in grado di isolare le regioni specifiche di un tessuto ed eliminare la contaminazione da fonti cellulari in aree adiacenti. Questo metodo è stato utilizzato nello studio di nestina-esprimendo progenitrici (NEP), una popolazione di recente identificato delle cellule dello strato germinativo cerebellare esterno (EGL). Utilizzando microdissection in combinazione con l'ordinamento delle cellule fluorescenti-attivata (FACS), una popolazione pura di NEP è stato raccolto separatamente dagli convenzionali precursori neuronali dei granuli in EGL e da altri contaminanti cellule nestina-esprimono nel cervelletto. Senza microdissezione, analisi funzionali della NEP, non sarebbe stato possibile con i metodi attualmente disponibili, come Percoll centrifugazione in gradiente e microdissezione laser. Questa tecnica può essere applicata anche per l'utilizzo con vari tessuti che contengono sia regioni riconoscibili o cellule fluorescenza marcata. Ancora più importante, un grande vantaggio di questo microdissectiotecnica n è che le cellule isolate vivono e possono essere coltivate per ulteriori sperimentazioni, che non è attualmente possibile con altri metodi descritti.
Introduction
Il cervelletto è costituito da più strati di cellule, ciascuna contenente tipi cellulari distinti. Durante lo sviluppo, la EGL contiene proliferazione dei precursori neuronali dei granuli (PNL), mentre lo strato molecolare e strato di Purkinje contengono Bergmann glia e neuroni di Purkinje, rispettivamente. Nel profondo del cervelletto si trova la sostanza bianca, che contiene le cellule staminali neurali (NSC) e oligodendrociti 1.
Sonic hedgehog (Shh) svolge un ruolo critico nella regolazione dello sviluppo cerebellare e, in particolare, promuove la proliferazione di PNL tramite legame al suo recettore Patched (Ptc), un regolatore negativo di Shh segnalazione 2-4. L'attivazione aberrante di segnalazione Shh genera medulloblastoma (MB), il tumore cerebrale maligno più comune nei bambini 5,6.
Ptc MB mutanti modelli di topi transgenici sono strumenti potenti per lo studio di MB e si sviluppano i tumori che assomigliano MB umano 7,8. L'utilizzo di questitopi, si è scoperto che PNL sono la cellula di origine per riccio di tipo MB 7. Inoltre, oltre al PNL, abbiamo recentemente identificato una popolazione unica di progenitori neuronali all'interno EGL del cervelletto sviluppo che può anche dar luogo a MB. Queste cellule esprimono alti livelli di tipo VI, proteina dei filamenti intermedi, Nestin, e sono chiamati NEP 9. NEP si trovano all'interno della parte profonda della EGL ed esistono transitoriamente solo durante lo sviluppo cerebellare neonatale. Essi si sono impegnati per la linea cellulare dei granuli come PNL, ma sono distinte come sono quiescenti e non esprimono Math1, un marker ben consolidata per la PNL convenzionali 10. Inoltre, NEP danno luogo a MB più efficiente rispetto PNL dopo l'attivazione della via di segnalazione Shh 9, che li un romanzo origine per MB tumorigenesi fa.
Abbiamo già NEP dalla cerebellare EGL isolati al giorno postnatale 4 (P4) con la tecnica microdissezionedescritto qui 9. Microdissezione tramite la visualizzazione microscopica diretta del tessuto permette di specifico dissezione del cerebellare EGL. Questo è necessario in quanto Nestin viene espressa anche dal NSC nella sostanza bianca cerebellare e da Bergmann glia nello strato molecolare 1,7,11,12 ed era fondamentale che queste cellule non essere inclusi, come avrebbero confondere l'analisi. Le cellule isolate dal tessuto microdissezione possono essere utilizzati immediatamente per l'analisi molecolare oppure possono essere coltivati per ulteriori applicazioni.
Per aiutare in modo specifico microdissecting la EGL e per purificare ulteriormente NEP, topi Math1-GFP (green fluorescent protein) sono stati incrociati con topi Nestin-CFP (proteina fluorescente ciano). Il fattore di trascrizione Math1 è specificamente espresso da PNL e l'espressione della GFP è chiaramente visibile nella EGL 9,13. Topi Nestin-PCP esprimono una forma nucleare di PCP e possono essere facilmente visualizzati nello strato molecolare 9,14. Insieme, GFP e di espressione CFP creano confini per microdissezione del EGL (vedi Figura 1). NEP CFP-positivi sono stati poi isolati da FACS, dopo dissociazione enzimatica delle EGLS sezionati.
Attualmente, il metodo più ben utilizzato per isolare le cellule dal EGL è Percoll centrifugazione in gradiente di tutto il tessuto cerebellare 15,16. Questo metodo, tuttavia, è in grado di escludere completamente popolazioni di cellule nestina + dal livello molecolare e la materia bianca e pertanto non può essere utilizzato per lo studio della NEP. Laser cattura microdissezione, che utilizza il trasferimento di energia laser per rimuovere le cellule di interesse, è un altro metodo usato per isolare cellule specifiche all'interno di un tessuto eterogeneo 17,18 ma cellule catturate possono essere utilizzate solo per il recupero di DNA, RNA e proteine e non sono in grado di essere coltivato.
Questo protocollo fornisce un modo per isolare in particolare un vivo, popolazione pura della NEP dal EGL.Questa tecnica può essere applicata a diversi tipi di tessuto che hanno o architettura anatomica riconoscibile o fluorescente cellule / regioni. Pertanto, il principale vantaggio di incorporare questa nuova tecnica di microdissezione nei protocolli di isolamento delle cellule è che le cellule possono essere isolate dalle regioni tissutali specifici per eliminare la contaminazione dei tessuti vicini e le cellule possono essere raccolte immediatamente per l'analisi o in coltura per altre applicazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo microdissezione qui descritto è il primo procedimento in grado di isolare una popolazione pura di cellule viventi per uso nelle analisi molecolari e funzionali. Come dimostrato da Li et al. 9, NEP ottenuti con tale metodo può essere coltivato e incorporati in vari esperimenti e per la loro elevata purezza, possono essere utilizzati anche per analisi microarray.
E 'molto importante prendersi il tempo per diventare esperti con questa tecnica micro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare James Oesterling per citometria a flusso assistenza. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione da parte del US National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) e una sovvenzione US National Institutes Postdoctoral formazione (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).
