Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen
Summary
Allergischen Reaktionen, gekennzeichnet durch die Aktivierung von Mastzellen und Basophilen, durch die Quervernetzung von IgE und Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren zurückzuführen. Eine quantitative Beurteilung von allergischen Reaktionen können mit Evans Blue-Farbstoff auf Veränderungen der vaskulären Permeabilität nach Allergenprovokation überwachen erreicht werden.
Abstract
Allergische Reaktionen sind das Ergebnis der Aktivierung von Mastzellen und Basophilen und die nachfolgende Freisetzung von vasoaktiven und proinflammatorische Mediatoren. Exposition gegenüber einem Allergen in einem sensibilisierten Individuum kann in der klinischen Symptome, die von leichten Hautrötung bis zu lebensbedrohlichen Anaphylaxie variieren führen. Im Labor wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt worden, um die Mechanismen, die allergische Reaktionen zu verstehen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Messung von Veränderungen der vaskulären Permeabilität, um lokalisierte allergische Reaktionen zu quantifizieren. Die lokale Anaphylaxie-Assay wurde in den 1920er Jahren berichtet, und hat sich von der von Kojima et al Technik angepasst. 2007. 1 In diesem Test Mäuse-OVA sensibilisiert sind im linken Ohr mit Vehikel und im rechten Ohr mit OVA in Frage. Dies wird durch eine intravenöse Injektion von Evans Blue-Farbstoff gefolgt. Zehn Minuten nach der Injektion von Evans Blue, wird das Tier getötet und der Farbstoff, der in den Gefäßen hatin den Ohren wird über Nacht in Formamid extrahiert. Die Absorption der extrahierten Farbstoffs wird dann mit einem Spektrophotometer quantifiziert. Diese Methode zuverlässig eine visuelle und quantifizierbare Manifestation einer lokalen allergischen Reaktion.
Introduction
Typ-I-Hypersensitivität durch Antigen-induzierte Vernetzung von IgE auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen vermittelt. Dies führt zu zellulären Degranulation und Freisetzung vasoaktiver und proinflammatorische Mediatoren, wie Histamin, Tryptase und Plättchen-aktivierender Faktor 2. Nach der Veröffentlichung der vorgeformten Mediatoren während der Degranulation, Mastzellen zu synthetisieren und frei Prostaglandinen und Leukotrienen, die Gefäßdurchlässigkeit 3 weiter zu erhöhen. Die ersten klinischen Reaktion schnell erfolgt und wird als eine "sofortige Reaktion" bezeichnet. In der Haut, ist eine Quaddel-und-Flare Reaktion innerhalb von Minuten nach Antigenexposition gut sichtbar. In Abhängigkeit von der Dosis der Herausforderung ist es möglich, ein "Spätphasenreaktion" ein paar Stunden später zu beobachten. Spätphase Schwellung ist durch lokalisierte Ödeme und die Rekrutierung von Leukozyten in das Gewebe 2. Histamin, allgemein als der Hauptmediator sein, die anallergische Sofortreaktionen, wirkt auf Histamin-Rezeptor-1 (HR1) bezogen auf die Gefäße und Histamin-Rezeptor-2 (HR2) bezogen auf die glatte Muskulatur. Die kombinierte Wirkung erhöht den Blutfluss und die vaskuläre Permeabilität in der Entzündungsstelle 4.
Eine Vielzahl von Tiermodellen für Allergie haben, um die Mechanismen bei allergischen Entzündungen beteiligt, darunter Modelle von allergischem Asthma, systemische Anaphylaxie, und lokale Anaphylaxie studieren entwickelt. Intravenöse Verabreichung Farbstoff verwendet wurde, um lokalisierte allergische Reaktionen in Tiermodellen für fast ein Jahrhundert zu messen, mit Veröffentlichungen, die diese Technik aus dem 1920er Jahren 5. Kaninchen und Meerschweinchen waren die ersten Tiermodelle verwendet werden, um sofortige Überempfindlichkeitsreaktionen zu testen, und die empfindlichsten Antworten wurden in der Regel im Ohr 5,6 gefunden. Der Test wurde später für den Einsatz in Ratten und Mäusen 7 8 validiert.
Historischeine Vielzahl von experimentellen Methoden verwendet worden, einschließlich der Injektion des Antigens vor der Injektion von Farbstoff Injektion von Farbstoff vor der Injektion des Antigens, und gleichzeitiges Einspritzen von Farbstoff und Antigen. Intravenöse Verabreichung Farbstoff als ein Mittel zum Messen allergischen Reaktionen ist ein vielseitiges Assay kann zur Messung aktiv, passiv verwendet werden, und Rückwärts passive Reaktionen 5,9. Zahlreiche Farbstoffe wurden verwendet, um allergische Reaktionen, einschließlich Trypanblau, Pontamine Sky Blue, Evans-Blau, Blau 536 Geigy, und Tusche 5,6,9 bewerten. Eine Lösung von 0,5% Evans-Blau ist derzeit der Standard-Farbstoff zum Messen allergischen Reaktionen in der Haut.
Der anaphylaktische Reaktion auf Herausforderung ist vergänglich; maximale Intensität innerhalb von 10 erreicht – 15 min der Farbstoffinjektion, und keine Reaktion ist sichtbar, wenn Farbstoff mehr als 30 min nach der Exposition verabreicht werden, unabhängig von der zugrunde 9 Tiere. Quantifizierung der Farbstoff Extravasation war ursprünglichly erhalten durch Messung Quaddel Größe wie durch den blauen Farbstoff 7-9 angegeben. Zusätzlich können Zählungen degranulierten Mastzellen durch Ausschneiden Hautgewebe von der Stelle der Reaktion und Färbung mit Toluidinblau 7 quantifiziert werden. Mastzelldegranulation wird oft als Marker für Haut, IgE-vermittelten allergischen Reaktionen verwendet werden, wie Mastzellen sind die wichtigsten lokalen Zellpopulation des hochaffinen IgE-Rezeptors FcsRI ausdrückt. Spektrophotometrische Techniken zur Messung Farbstoff Extravasation in das Gewebe wurde für die passive kutane Anaphylaxie (PCA) bei Ratten 10 und der Maus 11 in den 1990er Jahren entwickelt.
Die folgenden lokalen Anaphylaxie Assay-Protokoll wurde von Kojima et al angepasst. 1 und nutzt Hühnerei Ovalbumin (OVA) als Antigen für die Auslösung allergischer Reaktionen. Jedoch können andere als OVA-Antigene, wenn gewünscht, verwendet werden. Der Assay verwendet dann Evans Blue-Farbstoff auf Veränderungen der vaskulären permeabilit überwacheny, die durch Zell IgE Vernetzung und Freisetzung von Histamin Mast auftreten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zahlreiche Markierungen von allergischen Erkrankungen verwendet werden, um die Stärke der allergischen Reaktionen nach Allergenprovokation, einschließlich Änderungen in der Konzentration von zirkulierendem Histamin, Th2-Cytokin Produktion und Zellrekrutierung in der bronchoalveolären Flüssigkeit in der Umgebung der Atemwegs Herausforderung zu bewerten. Während die Überwachung Änderungen dieser Parameter ist wichtig für die Untersuchung allergischen Reaktionen, biologische Marker nicht immer mit klinischen aller…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Ellen M. Fox for her work regarding this model of local anaphylaxis. This work was supported by the Uniformed Services University of the Health Sciences grant number R073UE.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
- Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis. Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).
- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
- Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).
- Ramsdell, S. G. The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs. The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).
- Chase, M. W. Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions. The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).
- Goose, J., Blair, A. M. J. N. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate. Immunology. 16, 749-760 (1969).
- Ovary, Z. Passive cutaneous anaphylaxis in the mouse. The Journal of Immunology. 81 (4), 355-357 (1958).
- Ovary, Z. Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin. Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).
- Akiyama, H., et al. Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).
- Teshima, R., et al. Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse. Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).
