Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un<em> Ex-ovo</em> Enfoque electroporación

Cultivos de células disociadas de retinas de embriones de pollo se han utilizado ampliamente para estudiar diversos aspectos de la biología de las células fotorreceptoras, incluyendo su supervivencia ^2-9 diferenciación ^10-12, el crecimiento de neuritas ^13, y más. Las ventajas de este sistema, desarrollado en la década de 1980 por Rubén Adler y colaboradores y perfeccionadas por él y para otros grupos de ^14-20, residen en las características intrínsecas de la chica como un modelo animal ^21. El gran tamaño del ojo polluelo, incluso en las etapas embrionarias, proporciona grandes cantidades de material para cultivos. Por otra parte, cuando los cultivos se realizan con el día embrionario (ED) 5 – 6 retinas, el 55 – 80% de sus células progenitoras diferenciar como fotorreceptores ^{14,15,18,22,23,} y desde aproximadamente el 86% de los fotorreceptores en este animal son conos ^24, estas culturas son especialmente adecuados para estudios centrados en este tipo de células.

Recientemente hemos desaped y caracterizado una técnica sencilla que permite una alta eficiencia plásmido transfección de las células en estos cultivos, ampliando así la utilidad de este sistema, facilitando estudios missexpression genética ^1. El desarrollo de esta técnica se deriva de un vacío en la literatura científica de métodos que proporcionen un nivel aceptable de la transfección para permitir el estudio de la función génica en una célula de manera autónoma. Esto es en parte debido a cultivos neuronales primarios son notoriamente difíciles de transfectar ^25,26. Algunas de las técnicas más comúnmente utilizadas previamente disponibles para este propósito incluyen métodos de transfección químicos tales como lipofección o calcio transfección mediada por fosfato, que se traducen en una mayor eficacia en el orden de 3-5% y puede ejercer una toxicidad ^{considerable, 27-32.} A pesar de que el uso de plásmidos con un sistema reportero enzimática puede eludir el problema de la pobre eficiencia de la transfección mediante la amplificación de la señal, no lo hacendiscriminar los efectos específicos de la célula, y sus resultados se basan en una población de células pequeñas que pueden no ser representativos del conjunto. Otro método ampliamente utilizado en el pollo, infección por el virus RCAS, sólo es aplicable a las células en proliferación y por lo tanto no es adecuado para este sistema de cultivo primario de la retina ^33.

En el protocolo actual ojos de embriones de pollo se enucleados en la etapa 27 (ED 5), se retira el epitelio pigmentado de la retina (RPE), y la copa de la retina se coloca en una cámara de electroporación llena con una solución que contiene el plásmido y electroporación utilizando a medida electrodos, seguido por la disociación de la retina y de cultivo utilizando técnicas estándar ^21. Después de la optimización de este procedimiento hemos sido capaces de alcanzar consistentemente las eficacias de transfección en el orden del 22% del número total de células en cultivo y 25% dentro de la población de los fotorreceptores solo, sin comprometer las características de supervivencia y diferenciación de lasculturas ^1. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que describa todos los pasos importantes de este procedimiento a fin de garantizar el éxito y la reproducibilidad de esta técnica.