Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em> Ex-ovo</em> Eletroporação Approach

Culturas de células dissociadas de retinas de pintainho embrionário têm sido amplamente utilizados para o estudo de vários aspectos da biologia celular de fotorreceptores, incluindo a sua sobrevivência ^{2-9, 10-12} diferenciação, crescimento de neuritos ^13, e mais. As vantagens deste sistema, desenvolvido na década de 1980 por Ruben Adler e colaboradores e aperfeiçoados por suas e de outros grupos ^14-20, residem nas características intrínsecas do pinto como um modelo animal ^21. O grande tamanho do olho do pintainho, mesmo em estádios embrionários, fornece grandes quantidades de material para culturas. Além disso, quando as culturas são realizadas utilizando dia embrionário (ED) 5 – 6 retinas, 55 – 80% das suas células progenitoras diferenciam como fotorreceptores ^{14,15,18,22,23,} e desde cerca de 86% dos fotorreceptores nesse animal são ²⁴ cones, estas culturas são particularmente adequados para estudos que focalizam o tipo de célula.

Temos recentemente desenPED e caracterizada uma técnica simples que permite um processo de alta eficiência de transfecção de plasmídeo das células nestas culturas, alargando assim a utilidade deste sistema, facilitando estudos missexpression genética ^1. O desenvolvimento desta técnica resultou de um vazio na literatura científica de métodos que proporcionem um nível aceitável de transfecção para permitir o estudo da função dos genes de uma maneira autónoma da célula. Isto é em parte porque as culturas primárias neuronais são notoriamente difíceis de transfectar ^25,26. Algumas das técnicas mais comumente usadas anteriormente disponíveis para o efeito métodos de transfecção incluiu químicos, tais como lipofecção ou cálcio transfecção mediada por fosfato, que resultam em eficácia na ordem de 3-5% e pode exercer toxicidade considerável ^27-32. Embora a utilização de plasmídeos com um sistema de repórter enzimático pode contornar o problema da falta de eficiência de transfecção por amplificação do sinal, eles não fazemdiscriminar efeitos específicos de células, e os seus resultados são baseados em uma população de células pequenas que podem não ser representativas do conjunto. Outro método amplamente utilizado na pintinho, infecção por vírus RCAS, só é aplicável a células em proliferação e, portanto, não é adequado para este sistema de cultura de retina primário ^33.

No protocolo de corrente pintainho embrionário olhos são enucleados na fase 27 (ED 5), o epitélio pigmentado da retina (RPE) é removido, e o copo da retina é colocado numa câmara de electroporação preenchido com uma solução contendo o plasmídeo e electroporadas utilizando feito por encomenda eléctrodos, seguido pela dissociação da retina e de cultura usando técnicas convencionais. ²¹ Depois de optimizar este procedimento, temos sido capazes de conseguir de forma consistente eficiências de transfecção na ordem de 22% do número total de células em cultura e de 25% na população de fotorreceptores por si só, sem comprometer as características de sobrevivência e diferenciação de aculturas ^1. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado descrevendo todas as etapas importantes deste processo, a fim de garantir o sucesso e reprodutibilidade desta técnica.