初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：<em>元オボ</em>エレクトロポレーションアプローチ

ニワトリ胚の網膜からの解離細胞培養物は、広く生存^2-9、10-12分化、神経突起伸長^13、などを含む光受容体細胞生物学のさまざまな側面を研究するために使用されています。このシステムの利点は、ルーベン・アドラーと共同研究者によって1980年代に開発され、彼と他のグループ^14-20によって完成は、動物モデル²¹としてひよこの固有の特性に存在します。でも、胚の段階でニワトリ目の大きなサイズは、培養のための材料を大量に提供します。培養物は、胚日（ED）5使用して実行されたときにまた、 – 6網膜を、55 -この動物における光受容体の約86％であるので、それらの前駆細胞の80％が光受容体^{14,15,18,22,23}として区別し、コーン^24は 、これらの培養物は、この細胞型に焦点を当てた研究のために特に適しています。

我々は最近、develoを持っていますPEDは、したがって、遺伝missexpression研究^1を容易にすることによって、このシステムの有用性を広げ、これらの培養物中の細胞の高効率プラスミドトランスフェクションを可能にする簡単な方法を特徴とします。この技術の開発は、細胞自律的に遺伝子機能の研究を可能にするために、トランスフェクションの許容レベルを提供する方法の科学文献中の空隙から茎。主な神経細胞培養は^{25,26をトランスフェクトするために}悪名高い困難なので、これは一部にはあります。この目的のために以前に利用可能な最も一般的に使用される技術の一部は、3-5％の順に効率をもたらすようなリポフェクション、またはリン酸カルシウム媒介トランスフェクションなどの化学的トランスフェクション法を含めて、かなりの毒性^{27-32を発揮することができます} 。酵素レポーター系とプラスミドの使用は、信号を増幅することによって悪いトランスフェクション効率の問題を回避することができるにもかかわらず、彼らはしないでください細胞特異的な効果を識別し、その結果、全体の代表ではないかもしれない小さな細胞集団に基づいています。ひよこのもう一つの広く使用されている方法は、RCASウイルス感染は、増殖細胞にのみ適用し、このプライマリ網膜培養系³³に適していないです。

現在のプロトコルではニワトリ胚の目はステージ27（ED 5）、網膜色素上皮（RPE）が除去され、網膜のカップは、プラスミドを含む溶液で満たされたエレクトロポレーションチャンバ内に配置さで摘出し、使用してエレクトロポレーションされているカスタムメイド標準的な技術^{21を使用して}網膜の解離と培養した電極、。この手順を最適化した後、我々は、生存および分化の特性を損なうことなく、一貫して、培養中の細胞の総数の22％単独感光集団内の25％のオーダーでのトランスフェクション効率を達成することができました文化^1。ここでは、この技術の成功と再現性を確保するために、この手順のすべての重要なステップを概説し、詳細なプロトコルを提供します。