Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An<em> Ex-ovo</em> Elettroporazione Approach

Colture di cellule dissociate da retine pulcino embrionali sono stati ampiamente utilizzati per studiare vari aspetti della biologia cellulare dei fotorecettori, tra cui la loro sopravvivenza ^2-9, differenziazione ^10-12, crescita dei neuriti ^13, e altro ancora. I vantaggi di questo sistema, sviluppato nel 1980 da Ruben Adler e collaboratori e perfezionati dai suoi e altri gruppi ^14-20, risiedono nelle caratteristiche intrinseche del pulcino come un modello animale ^21. Le grandi dimensioni dell'occhio pulcino, anche a stadi embrionali, fornisce una grande quantità di materiali per le culture. Inoltre, quando le culture vengono eseguite utilizzando giorno embrionale (ED) 5 – 6 retine, 55-80% dei loro cellule progenitrici differenziarsi come fotorecettori ^{14,15,18,22,23,} e dal momento che circa il 86% dei fotorecettori in questo animale sono coni ^24, queste culture sono particolarmente adatti per studi che mettono in questo tipo cellulare.

Abbiamo recentemente sviped e caratterizzato una semplice tecnica che consente ad alta efficienza plasmide trasfezione delle cellule in queste culture, ampliando così l'utilità di questo sistema facilitando studi missexpression genetica ^1. Lo sviluppo di questa tecnica derivava da un vuoto nella letteratura scientifica di metodi che fornisca un livello accettabile di trasfezione per consentire lo studio della funzione genica in maniera autonoma cella. Ciò è in parte perché colture neuronali primarie sono notoriamente difficili da trasfettare ^25,26. Alcune delle tecniche più utilizzate in precedenza disponibili per questo scopo inclusi metodi di transfezione chimici quali lipofezione o calcio trasfezione fosfato-mediata, che determinano efficienze dell'ordine del 3-5% e possono esercitare una notevole tossicità ^27-32. Anche se l'uso di plasmidi con un sistema reporter enzimatico può aggirare il problema della scarsa efficienza di trasfezione amplificando il segnale, non lo fannodiscriminare effetti specifici delle cellule, ed i loro risultati sono basati su una piccola popolazione di cellule che potrebbe non essere rappresentativo dell'intero. Un altro metodo ampiamente usato al pulcino, infezione da virus RCA, è applicabile solo alle cellule proliferanti e quindi non adatto a questo sistema di coltura retinico primario ^33.

Nel protocollo corrente occhi pulcino embrionale sono enucleati nella fase 27 (ED 5), l'epitelio pigmentato retinico (RPE) viene rimosso, e la coppa retinica è posto in una camera di elettroporazione riempita con una soluzione plasmide contenente e elettroporate con misura elettrodi, seguita da dissociazione della retina e della cultura utilizzando tecniche standard ^21. Dopo ottimizzare questa procedura siamo stati in grado di ottenere sempre efficienza di trasfezione dell'ordine del 22% del numero totale di cellule in coltura e 25% nella popolazione fotorecettore sola, senza compromettere le caratteristiche di sopravvivenza e la differenziazione delleculture ^1. Qui forniamo un protocollo dettagliata che illustra tutte le fasi importanti di questa procedura al fine di assicurare il successo e la riproducibilità di questa tecnica.