Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em> Ex-ovo</em> Elektroporation Ansatz

Dissoziierten Zellkulturen von embryonalen Hühnernetzhaut wurden allgemein verwendet, um verschiedene Aspekte der Photorezeptor Zellbiologie, einschließlich deren Überleben ^2-9, Differenzierung ^10-12, Neuritenwachstum ¹³ und mehr zu studieren. Die Vorteile dieses Systems, in den 1980er Jahren von Ruben Adler und Mitarbeiter entwickelt und von seinem und anderen Gruppen ^14-20, perfektioniert liegen in den intrinsischen Eigenschaften des Kükens als Tiermodell ^21. Die Größe des Hühnerauge, auch bei embryonalen Stadien, bietet große Mengen an Material für Kulturen. Außerdem, wenn Kulturen mit embryonalen Tag (ED) durchgeführt 5 – 6 Retinae, 55 – 80% ihrer Vorläuferzellen zu differenzieren, wie Photorezeptoren, ^{14,15,18,22,23,} und da etwa 86% der Photorezeptoren in diesem Tier sind Kegel ²⁴ sind diese Kulturen besonders geeignet für die Studien, die sich auf dieser Zelltyp.

Wir haben vor kurzem developed und dadurch eine einfache Technik, die für hocheffiziente Plasmid Transfektion der Zellen in diesen Kulturen ermöglicht, wodurch die Erweiterung der Nützlichkeit dieses Systems durch Erleichterung genetische Studien missexpression ^1. Die Entwicklung dieser Technik ergab sich aus einem Hohlraum in der wissenschaftlichen Literatur von Methoden, die ein akzeptables Niveau der Transfektion bereitstellen würde, um für die Untersuchung der Gen-Funktion in einer Zelle autonom zu ermöglichen. Dies ist zum Teil, weil primären neuronalen Kulturen sind notorisch schwer zu transfizieren ^25,26. Einige der am häufigsten verwendeten Techniken, die zuvor für diesen Zweck zur Verfügung enthalten chemische Transfektionsverfahren wie Lipofektion oder Calciumphosphat-vermittelte Transfektion, die in Wirkungsgrade in der Grßenordnung von 3-5% führen und kann beträchtliche Toxizität ^27-32 auszuüben. Obwohl die Verwendung von Plasmiden mit einem enzymatischen Reporter-Systems kann das Problem der schlechten Transfektionseffizienz durch Verstärken des Signals zu umgehen, sie nichtdiskriminieren zellspezifische Wirkungen, und ihre Ergebnisse werden auf einer kleinen Zellpopulation, die nicht repräsentativ für die gesamte erweisen. Eine andere weit verbreitete Methode in der Küken, RCAS Virus-Infektion, ist nur auf proliferierende Zellen anwendbar und somit nicht für diese primäre Netzhautkultursystem ³³ geeignet ist.

Im aktuellen Protokoll embryonalen Hühneraugen werden in Stadium 27 (ED & sub5;), der retinalen Pigmentepithel (RPE) wird entfernt, und das Netzhautbecher in einer Elektroporationsküvette Kammer mit einem Plasmid enthaltenden Lösung gefüllt war enukleiert und Elektroporation mit maßgeschneiderten Elektroden, gefolgt von retinalen Dissoziation und Kultur unter Verwendung von Standardtechniken ^21. Nach der Optimierung dieses Verfahrens waren wir, ohne die Überlebensrate und Differenzierungsmerkmale der Lage zu Transfektionseffizienzen erzielen durchweg in der Größenordnung von 22% der Gesamtzahl der Zellen in der Kultur und 25% innerhalb der Photorezeptorpopulation AlleinKulturen ^1. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll umreißt alle wichtigen Schritte dieses Verfahrens, um den Erfolg und die Reproduzierbarkeit dieser Technik zu gewährleisten.