Efficient Gene Transfer dans Chick rétines pour cellulaires primaires études sur la culture: Un<em> Ex-ovo</em> Approche d'électroporation

Des cultures de cellules dissociées à partir de rétines embryonnaires de poulet ont été largement utilisés pour étudier les différents aspects de la biologie des cellules de photorécepteur, y compris leur survie ^{09/02, 12/10} différenciation, la croissance des neurites ^13, et plus encore. Les avantages de ce système, mis au point dans les années 1980 par Ruben Adler et collaborateurs et perfectionné par ses et d'autres groupes ^14-20, résident dans les caractéristiques intrinsèques de la nana comme un modèle animal ^21. La grande taille de l'œil de poulet, même à des stades embryonnaires, fournit de grandes quantités de matériel pour les cultures. En outre, lorsque les cultures sont réalisées en utilisant jour embryonnaire (ED) 5 – 6 rétines, de 55 à 80% de leurs cellules progénitrices différencier en photorécepteurs ^{14,15,18,22,23,} et puisque environ 86% des photorécepteurs de cet animal sont cônes ^24, ces cultures sont particulièrement adaptés pour les études portant sur ​​ce type de cellule.

Nous avons récemment déveped et caractérisé une technique simple qui permet à haut rendement plasmide transfection des cellules dans ces cultures, élargissant ainsi l'utilité de ce système en facilitant les études de génétique missexpression ^1. Le développement de cette technique découle d'un vide dans la littérature scientifique des méthodes qui permettraient un niveau acceptable de transfection pour permettre l'étude de la fonction des gènes d'une manière autonome cellulaire. Ceci est en partie à cause des cultures de neurones primaires sont notoirement difficiles à transfecter ^25,26. Certaines des techniques les plus couramment utilisées précédemment disponibles à cet effet inclus méthodes de transfection chimiques tels que la lipofection ou phosphate de calcium, transfection qui se traduisent par des rendements de l'ordre de 3-5% et peuvent exercer une toxicité considérable ^27-32. Même si l'utilisation de plasmides avec un système rapporteur enzymatique peut contourner le problème de la mauvaise efficacité de la transfection par l'amplification du signal, ils ne le font pasdiscriminer les effets spécifiques des cellules, et leurs résultats sont basés sur une petite population de cellules qui peuvent ne pas être représentative de l'ensemble. Une autre méthode largement utilisée dans le poussin, infection par le virus RCAS, est applicable uniquement aux cellules proliférantes et ne conviennent donc pas pour cette primaire système de culture de la rétine ^33.

Dans le protocole actuel yeux chiches embryonnaires sont énucléés à l'étape 27 (ED 5), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est enlevée, et la coupe de la rétine est placé dans une chambre d'électroporation rempli d'une solution contenant le plasmide et électroporation en utilisant sur mesure des électrodes, suivie de dissociation de la rétine et de la culture en utilisant des techniques standards ^21. Après l'optimisation de cette procédure, nous avons été en mesure de réaliser systématiquement des efficacités de transfection de l'ordre de 22% du nombre total de cellules en culture et 25% au sein de la population de photorécepteur seul, sans compromettre les caractéristiques de survie et la différenciation descultures ^1. Ici, nous fournissons un protocole détaillé décrivant toutes les étapes importantes de cette procédure afin d'assurer le succès et la reproductibilité de cette technique.