كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل<em> السابقين البيضة</em> Electroporation للمنهج
Summary
الجنينية الفرخ الثقافات خلايا شبكية تشكل أدوات قيمة لدراسة مبصرة علم الأحياء. قمنا بتطوير تقنية نقل الجينات الفعالة القائمة على البيضة السابقين البلازميد Electroporation للمن شبكية العين قبل الثقافة. هذا الأسلوب يزيد إلى حد كبير من الكفاءة ترنسفكأيشن عبر بروتوكولات المتوفرة حاليا، مما يجعل من الممكن التلاعب الجيني لهذا النظام.
Abstract
أصبحت الثقافات التخصيب مبصرة مخروط المستمدة من شبكية العين الفرخ الجنينية أداة لا غنى عنها للباحثين في جميع أنحاء العالم دراسة بيولوجيا الخلايا العصبية للشبكية، وبخاصة خلايا مستقبلة للضوء. تطبيقات هذا النظام تتجاوز البحوث الأساسية، لأنها يمكن بسهولة أن تتكيف مع تقنيات إنتاجية عالية لتطوير الأدوية. ومع ذلك، فقد ثبت التلاعب الجيني للخلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين في هذه الثقافات أن تكون صعبة للغاية، مما يشكل قيدا هاما لفائدة النظام. لقد وضعت مؤخرا والتحقق من صحتها والبيضة السابقين تقنية البلازميد Electroporation للأن يزيد من معدل ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية في هذه الثقافات من خمسة أضعاف بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات المتوفرة حاليا 1. في هذه الطريقة يتم منزوعة النواة عيون الفرخ الجنينية في المرحلة 27، تتم إزالة RPE، ويتم وضع الكأس في شبكية العين في حل تحتوي على البلازميد و electroporated باستخدام اخملصصة شيدت بسهولةأقطاب بها. ثم يتم فصلها شبكية العين ومثقف باستخدام الإجراءات القياسية. ويمكن تطبيق هذه التقنية لدراسات overexpression وكذلك إلى downregulation التعبير الجيني، على سبيل المثال من خلال استخدام تكنولوجيا رني يحركها البلازميد، وتحقيق عادة التعبير التحوير في 25٪ من السكان مبصرة. فإن صيغة الفيديو من هذا المنشور جعل هذه التكنولوجيا في متناول الباحثين في هذا المجال، مما يتيح دراسة وظيفة الجين في الثقافات الشبكية الأولية. لقد قمنا بإدراج أيضا شرح مفصل لخطوات حاسمة من هذا الإجراء لتحقيق نتيجة ناجحة والتكاثر.
Introduction
وقد استخدمت على نطاق واسع مزارع الخلايا فصلها من شبكية العين الفرخ الجنينية لدراسة مختلف جوانب بيولوجيا الخلايا المستقبلة للضوء، بما في ذلك بقائهم 2-9، والتمايز 10-12، ثمرة neurite 13، وأكثر من ذلك. مزايا هذا النظام، وضعت في 1980s من قبل روبن أدلر والمتعاونين والكمال من قبل له وغيرها من الجماعات 14-20، يقيمون في الخصائص الجوهرية للفرخ كنموذج للحيوانات 21. الحجم الكبير للعين الفرخ، حتى في المراحل الجنينية، يوفر كميات كبيرة من المواد للثقافات. وعلاوة على ذلك، عندما يتم تنفيذ الثقافات باستخدام اليوم الجنينية (ED) 5-6 شبكية العين، 55-80٪ من الخلايا الاصلية التي تفرق كما مبصرات 14،15،18،22،23، ومنذ ما يقرب من 86٪ من خلايا مستقبلة للضوء في هذا الحيوان هي المخاريط 24، هذه الثقافات هي مناسبة خاصة للدراسات التركيز على هذا النوع من الخلايا.
لدينا develo مؤخراإدخال رقم التعريف الشخصي وتتميز تقنية بسيطة التي تسمح للذات الكفاءة العالية البلازميد ترنسفكأيشن من الخلايا في هذه الثقافات، وبالتالي توسيع فائدة هذا النظام من خلال تسهيل الدراسات الجينية missexpression 1. تطوير هذه التقنية تنبع من فراغ في الكتابات العلمية من الأساليب التي من شأنها أن توفر مستوى مقبول من ترنسفكأيشن للسماح لدراسة وظيفة الجين بطريقة خلية مستقلة. هذا هو في جزء منه بسبب الثقافات العصبية الأولية من الصعب المعروف ل transfect 25،26. وشملت بعض من الأكثر استخداما التقنيات المتاحة مسبقا لهذا الغرض طرائق نقل المواد الكيميائية مثل lipofection أو الكالسيوم ترنسفكأيشن بوساطة الفوسفات، مما يؤدي إلى زيادة الكفاءة في ترتيب 3-5٪ ويمكن أن تمارس سمية كبيرة 27-32. على الرغم من أن استخدام البلازميدات مع مراسل النظام الأنزيمي يمكن الالتفاف على مشكلة سوء كفاءة ترنسفكأيشن عن طريق تضخيم إشارة، لم يفعلوا ذلكتميز آثار خلية محددة، وتستند نتائجها على السكان الخلية الصغيرة التي قد لا تكون ممثلة للمجلس بكامل هيئته. آخر الطريقة المستخدمة على نطاق واسع في الفرخ، عدوى فيروس تقييمات النتائج والكفاءات، لا ينطبق إلا على الخلايا المتكاثرة، وبالتالي لا تصلح لهذا النظام الثقافة الشبكية الأساسي 33.
في البروتوكول الحالي ومنزوعة النواة عيون الفرخ الجنينية في المرحلة 27 (ED 5)، تتم إزالة الظهارة الصباغية الشبكية (RPE)، ويتم وضعها في كوب شبكية العين في غرفة Electroporation للمليئة حل تحتوي على البلازميد و electroporated باستخدام حسب الطلب الأقطاب، تليها التفكك شبكية العين والثقافة باستخدام التقنيات القياسية 21. بعد تحسين هذا الإجراء كنا قادرين على تحقيق باستمرار الكفاءة ترنسفكأيشن بناء على أمر من 22٪ من العدد الكلي للخلايا في الثقافة و25٪ بين السكان مبصرة وحده، دون المساس البقاء على قيد الحياة والتمايز خصائصثقافات 1. هنا نقدم بروتوكول مفصلة تبين جميع الخطوات الهامة في هذا الإجراء من أجل ضمان نجاح واستنساخ هذه التقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الأكثر أهمية لنجاح هذا البروتوكول هو اختيار المرحلة المناسبة من الأجنة. في المنشورات السابقة، وتعطى مجموعة من المراحل الجنينية لهذه الثقافات، الذي يعرف عادة قبل أيام من الحضانة أو الجنينية أيام (ED)؛ وبالتالي فإنه عادة ما يفترض أن استخدام ED 5 إلى 6 ED الأجنة سوف ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge David O’Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.
Materials
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0115 model 512 | Gold tipped electrode used as anode |
| Polyimide Tubing | Vention Medical | custom made | Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode |
| 2.5mm square box filament, 4.5mm wide | Sutter Instrument Company | FB245B | Used to make cathode electrode |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco – Life Technologies | 14175-095 | |
| Moloney forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
| Dumont tweezers 5/45 | Roboz | RS-5058 | Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length |
| Bonn micro forceps, 1×2 teeth | Roboz | RS-5172 | Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width |
References
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., O’Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
- Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
- Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
- Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
- Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
- Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
- Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
- Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
- Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
- Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
- Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).
- Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
- Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
- Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
- Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
- Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the ‘window-labeling’ technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
- Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
- Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
- Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).
- Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
- Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
- Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
- Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
- Boatright, J. H., et al. The 5′ flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
- Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
- Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
- Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
- Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
- Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
- Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
