מטוס אחד תאורת מודול וגישת מיקרו-נימים למיקרוסקופ שדה רחב
Summary
מודול למיקרוסקופיה תאורת מטוס בודד (SPIM) מתואר אשר מותאם בקלות למיקרוסקופ שדה הרחב הפוך ומותאם במיוחד לתרביות תאים 3 ממדים. המדגם ממוקם בתוך נימים מלבניות, ובאמצעות צבעי ניאון מערכת microfluidic, יכולים להיות מיושמים סוכנים או תרופות תרופות בכמויות קטנות.
Abstract
מודול לגיליון אור או מיקרוסקופ תאורת מטוס בודד (SPIM) מתואר אשר מותאם בקלות למיקרוסקופ שדה הרחב הפוך ומותאם במיוחד לתרביות תאים 3 ממדים, למשל, spheroids רב תאי גידול (MCTS). צורות עירור SPIM מודול ומסיט את האור כך שהמדגם הוא מואר על ידי אור גיליון בניצב לדרך זיהוי של המיקרוסקופ. המערכת מאופיינת בשימוש בנימים מלבניות להחזקה (ובגרסה מתקדמת גם על ידי גישת מיקרו נימים לסיבוב) הדגימות, על ידי התאמה סינכרונית של גיליון האור המאיר ועדשה האובייקטיבית המשמשת לגילוי הקרינה, כמו גם על ידי התאמה של מערכת microfluidic ליישום של צבעי ניאון, סוכנים או תרופות תרופות בכמויות קטנות. פרוטוקול לעבודה עם מערכת זו הוא נתון, וכמה פרטים טכניים שדווחו. נציג תוצאות כוללות (1) מדידות של עדלקחת תרופת cytostatic (דוקסורוביצין) והמרתו החלקית למוצר השפלה, (2) מדידות חיזור על ידי שימוש בחיישן גלוטתיון מקודד גנטי על תוספת של סוכן חמצון, ו (3) ייזום ותיוג של נמק תא על עיכוב של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה. הבדלים ויתרונות של מודול SPIM הנוכחי בהשוואה למערכות קיימות נדונים.
Introduction
בנוסף לשיטות מבוססות היטב (מיקרוסקופיה confocal או במיקרוסקופ סריקת לייזר רב פוטון 1-4, מובנה התאורה 5,6) גיליון אור או מיקרוסקופ מטוס בודד תאורה (SPIM) הוכיח להיות שיטת ערך של 3D ההדמיה 7,8, 9. מעניין במיוחד הוא היישום שלה לתרבויות 3 ממדי תא, למשל, spheroids גידול רב תאי (MCTS), אשר נמצא בשימוש יותר ויותר למחקר לגילוי תרופות 10,11. יתר על כן, SPIM הוא שיטה מועדפת, כאשר גם בחשיפה ארוכת טווח או מדידות חוזרות ונשנות מינוני אור נמוכים נדרשים לשמור על כדאיות של המדגם, שכן למדידה של כל מטוס המדגם רק המטוס הזה נחשף לאור. זאת בניגוד לשיטות מיקרוסקופיה אחרות, שבו לגילוי של כל מטוס מוקד המדגם כולו מואר, כך שעם הקלטה של מטוסים רבים סכומי מינון אור ועלול לגרום נזק למדגם 12. </p>
מיקרוסקופיה גיליון אור או SPIM מבוססת על תאורה של המדגם בכיוון מאונך לנתיב התצפית או על ידי שימוש בעדשה גלילית או על ידי סריקת קרן הלייזר המרגש (לסקירה ראה נ"צ. 8). זה בדרך כלל דורש תאים מיוחדים מדגם 13,14 או מטריצות, למשל, agarose 7,15, מיושם במיקרוסקופים גבוהה בעלות מיוחדת. כחלופה למערכות אלה מכשיר תאורה פשוט comparably לSPIM פותח והותאם למיקרוסקופ הקונבנציונלי הפוך 16 (ראה איור 1). הוא מורכב מקרן לייזר התרחבה לקוטר של 8 מ"מ וממוקד על ידי עדשה גלילית (אורך מוקד: 50 מ"מ, צמצם מספרי: 0.08) לגיליון אור של 6-10 עובי מיקרומטר על עומק השדה של כ 100 מיקרומטר . דוגמאות נמצאות בנימים מלבניות של 600-900 מיקרומטר קוטר פנימי להציב מול len האובייקטיבי מיקרוסקופים לגילוי הקרינה. התכונות העיקריות אלה הושלמו כיום ומותאמים על ידי השימוש בגישות מיקרו נימים מתקדמות להחזקה ולמסתובב דגימות, ההתאמה סינכרוני של גיליון האור המאיר (בכיוון צירי) ועדשה האובייקטיבית המשמשות לגילוי הקרינה (נתיב אופטי זהה אורכים של עקירה דורשים תיקון של ההזנה המכנית), וההסתגלות של מערכת microfluidic ליישום של צבעי ניאון, סוכנים או תרופות תרופות, וכך לצמצם את הכמויות והוצאות הנדרשות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב היד הנוכחית מתארת גיליון אור או מכשיר מיקרוסקופיה תאורת מטוס בודדת (SPIM) אשר מותאם במיוחד עבור מערכות תא 3 ממדים, למשל, spheroids רב תאי גידול (MCTS). שלושה יישומים למופת כוללים (1) ספיגה של תרופת cytostatic והמרה החלקית שלה למוצר פגום (תרומה ליעילות כימותרפיות שעדיין נשא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי הארץ באדן וירטמברג, כמו גם על ידי האיחוד האירופי, יורופאישר Fonds für die Regionale Entwicklung. המחברים מודים ריינר יטיג (ILM Ulm) לאספקת קו U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 התא וקלאודיה Hintze לקבלת סיוע טכני מיומן.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Lippert, H., Wald, M., Radt, B. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , (2013).
