طائرة واحدة ومنهج وحدة الإضاءة الجزئي الشعرية لالمجهر حقل واسع
Summary
ووصف وحدة لطائرة واحدة إضاءة المجهر (SPIM) التي تتكيف بسهولة مع المجهر واسعة المجال المقلوب والأمثل لمزارع الخلايا 3 الأبعاد. يقع ضمن العينة الشعرية مستطيلة، وعبر نظام ميكروفلويديك الأصباغ الفلورية، وكلاء الصيدلانية أو المخدرات يمكن تطبيقها بكميات صغيرة.
Abstract
وحدة نمطية لورقة خفيفة أو طائرة واحدة إضاءة المجهر (SPIM) يوصف التي تتكيف بسهولة مع المجهر واسعة المجال المقلوب والأمثل لمزارع الخلايا 3 الأبعاد، على سبيل المثال، الأجسام الشبه الكروية ورم متعددة الخلايا (MCTS). وحدة الأشكال SPIM الإثارة وينحرف ضوء بحيث يضيء عينة بواسطة ورقة الخفيفة عمودي على مسار اكتشاف المجهر. يتميز النظام عن طريق استخدام الشعرية مستطيلة لعقد (وفي نسخة متقدمة أيضا نهج الشعرية الصغيرة لالدورية) العينات، قبل تعديل متزامن من الورقة إلقاء الضوء على ضوء وعدسة الهدف تستخدم للكشف عن مضان وكذلك عن طريق التكيف نظام ميكروفلويديك لتطبيق الأصباغ الفلورية، وكلاء الصيدلانية أو المخدرات بكميات صغيرة. ويرد بروتوكول للعمل مع هذا النظام، ويتم الإبلاغ عن بعض التفاصيل التقنية. وتشمل نتائج ممثلة (1) قياسات تصلتأخذ دواء تثبيط الخلايا (دوكسوروبيسين) وتحويل جزئي لمنتج تدهور، (2) قياسات الأكسدة باستخدام جهاز استشعار الجلوتاثيون المشفرة وراثيا على إضافة عامل مؤكسد، و (3) بدء ووضع العلامات من نخر الخلية على تثبيط السلسلة التنفسية الميتوكوندريا. وتناقش الخلافات ومزايا وحدة SPIM الحالية بالمقارنة مع النظم القائمة.
Introduction
بالإضافة إلى أساليب راسخة (مبائر أو متعدد الفوتون المسح المجهري بالليزر 1-4، منظم إضاءة المجهر 5،6) ورقة خفيفة أو طائرة واحدة إضاءة المجهر (SPIM) وقد ثبت أن طريقة قيمة ل3D التصوير 7،8، 9. أهمية خاصة هو تطبيقه على مزارع الخلايا 3 الأبعاد، على سبيل المثال، الأجسام الشبه الكروية ورم متعددة الخلايا (MCTS)، والتي تستخدم بشكل متزايد للبحوث اكتشاف الأدوية 10،11. وعلاوة على ذلك، SPIM هي طريقة تفضيلية عندما حتى عند التعرض على المدى الطويل أو القياسات المتكررة ويطلب جرعات الإضاءة الخافتة للمحافظة على سلامة العينة، منذ لقياس كل طائرة من العينة يتعرض فقط هذه الطائرة للضوء. هذا هو على النقيض من تقنيات الفحص المجهري الأخرى، حيث للكشف عن كل البؤري يضيء العينة كلها، حتى أنه عند تسجيل العديد من الطائرات المبالغ جرعة ضوء صعودا وقد يؤدي إلى تلف العينة 12. </P>
ويستند المجهري ورقة خفيفة أو SPIM على إضاءة العينة في اتجاه عمودي على مسار المراقبة إما عن طريق استخدام عدسة اسطوانية أو عن طريق مسح شعاع الليزر مثيرة (لمراجعة رؤية المرجع 8). هذا غالبا ما يتطلب عينة 13،14 غرف خاصة أو المصفوفات، على سبيل المثال، الاغاروز 7،15، نفذت في المجاهر الخاصة ذات الكلفة العالية. كبديل لتلك الأنظمة وقد تم تطوير جهاز إضاءة بسيطة نسبيا لSPIM وتكييفها مع مجهر التقليدي مقلوب 16 (انظر الشكل 1). وهو يتألف من شعاع الليزر توسعت ليبلغ قطرها 8 مم وتركزت بواسطة عدسة اسطوانية (البعد البؤري: 50 مم، الفتحة العددية: 0.08) إلى ورقة الخفيفة من 6-10 ميكرون سمك على عمق الميدان من حوالي 100 ميكرون . وتقع العينات في شعري مستطيلة من 600-900 ميكرون القطر الداخلي ضعت أمام المجهر يون موضوعيق للكشف عن مضان. يتم الانتهاء من هذه الميزات الرئيسية في الوقت الحاضر والأمثل عن طريق استخدام نهج الصغيرة الشعرية المتقدمة لعقد والدورية للعينات، وتعديل متزامن من ورقة ضوء توهج (في اتجاه محوري) وعدسة الهدف تستخدم للكشف عن مضان (مسار بصري متطابقة أطوال النزوح تتطلب تصحيح العلف الميكانيكية)، وتكييف نظام ميكروفلويديك لتطبيق الأصباغ الفلورية، وكلاء الصيدلانية أو المخدرات، وبالتالي التقليل من كميات والمصاريف المطلوبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف المخطوطة الحالية ورقة خفيفة أو واحد المجهري إضاءة الطائرة (SPIM) الجهاز الذي هو الأمثل لأنظمة الخلايا 3 الأبعاد، على سبيل المثال، الأجسام الشبه الكروية ورم متعددة الخلايا (MCTS). وتشمل ثلاثة تطبيقات مثالية (1) امتصاص الدواء تثبيط الخلايا وتحويل جزئي لمنتج التحلل (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل لاند بادن فورتمبيرغ فضلا عن الاتحاد الأوروبي، فندق Europäischer FONDS FÜR يموت الجهوية ENTWICKLUNG. المؤلفان بالشكر راينر فيتيغ (ILM أولم) لتوفير خط خلية U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 وكلوديا هينتز للمساعدة التقنية ماهرا.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Lippert, H., Wald, M., Radt, B. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , (2013).
