Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in<em> Apc<sup> Min / +</sup</em> Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
Myeloïde cellen zijn de meest voorkomende immune cellen in tumoren en is aangetoond tumorprogressie promoten. Moderne intravitale beeldvormende technieken maken de observatie van live-cellulaire gedrag in het orgel, maar kan een uitdaging in sommige vormen van kanker als gevolg van organen en tumor toegankelijkheid zoals darm. Directe waarneming van darmtumoren is niet eerder gerapporteerd. Een hier beschreven chirurgische ingreep maakt directe observatie van myeloïde cel dynamiek binnen de darmtumoren in levende muizen met behulp van transgene fluorescerende reporter muizen en injecteerbare tracers of antilichamen. Voor dit doel, heeft een vier-kleur, multi-regio, micro lensed spinning disk confocale microscoop die op lange termijn continue beeldvorming met snelle beeldopname maakt gebruikt. Apc Min / + muizen die meerdere adenomen in de dunne darm te ontwikkelen zijn gekruist met c-fms-EGFP muizen myeloïde cellen te visualiseren en ACTB-ECFP muizenintestinale epitheelcellen van de crypten visualiseren. Procedures voor de etikettering verschillende tumor componenten, zoals bloedvaten en neutrofielen, en de procedure voor het positioneren van de tumor beeldvorming via serosale oppervlak beschreven. Time-lapse films samengesteld uit verscheidene uren beeldvorming kan de analyse van myeloïde celgedrag in situ in de intestinale micro.
Introduction
Overweldigend bewijs blijkt nu dat de tumor micro-omgeving, bestaande uit heterogene celpopulaties, waaronder fibroblasten, endotheelcellen, immune en inflammatoire cellen, extracellulaire matrix en oplosbare factoren, speelt een cruciale rol in de ontwikkeling en progressie van vaste tumoren door tot bijna alle kenmerken van kanker 1. Inderdaad, bij tumorprogressie, er voortdurend dynamische interacties tussen getransformeerde kankercellen en stromale cellen die zich ontwikkelen tot een micro gunstig maligniteit 2 genereren. Onder de immune cellen die de tumor micro infiltreren, myeloïde cellen zijn de meest voorkomende 3. Bestaande uit tumor-geassocieerde macrofagen (TAM), myeloide suppressor cellen (MDSCs), dendritische cellen (DC) en neutrofielen (PMN), myeloïde cellen worden gerekruteerd uit beenmerg en geleidelijk infiltreren tumoren vrijgeven cytokines, groeifactoren en proteasen die kan bevorderentumorgroei en verspreiding 4. De overspraak tussen kankercellen en myeloïde cellen is complex en dynamisch. Dus het begrip van de aard van hun interacties cruciaal voor het bepalen waarom deze cellen te promoten kankerprogressie plaats van deelnemen aan een anti-tumor immuunreactie, en kunnen helpen om nieuwe targets te beheersen vinden.
Directe observatie door opklaren geeft informatie over mobiele dynamiek binnen de weefsels van levende muizen 5. Een vier-kleur, multi-regio, micro lensed spinning disk confocale systeem werd ontworpen om stromale cellen te bestuderen binnen borsttumoren 6. Deze benadering maakt langdurige continue beeldvorming en bevat diverse voordelen zoals (a) snelle beelden overname bewegingsartefacten minimaliseren, (b) langdurige anaesthesie, (c) vier kleuren overname verschillende celtypen volgen, (d) fluorescentielabelling verschillende tumorale componenten, en (e) observatie van verschillende tumor micro-omgevingen within dezelfde muis muis om de muis variabiliteit 7-9 voorkomen. Met deze technologie zijn andere cel gedrag vastgesteld in de mammaire tumor virus (MMTV)-promotor aangedreven polyoma midden T oncogen (PyMT) model dat geleidelijk van tumorigenese weergeeft. Regulatoire T-lymfocyten (Tregs, gevisualiseerd door de Foxp3 EGFP transgen) migreren bij voorkeur in de nabijheid van de bloedvaten terwijl DCS (CD11c-DTR-EGFP),-carcinoom geassocieerd fibroblasten (FSP1 + / + -EGFP) en myeloïde cellen (c-fms -EGFP) vertonen een hogere beweeglijkheid op de tumor periferie dan binnen de tumor. In de toestand van acute systemische hypoxie, cellen gemigreerd anders: Tregs stop migreren in tegenstelling tot myeloïde cellen die blijven bewegen 6. Bovendien, in hetzelfde muismodel, is aangetoond dat doxorubicine gevoeligheid verandert met tumor stadium is geneesmiddelverdeling verband met drugs respons en doxorubicinebehandeling verkrijgt men CCR2-afhankelijke rekrutering van myeloïde cellen tumoren. Aldus kunnen levende beeldvorming worden gebruikt om inzicht in drug reacties in situ en de biologie van chemoresistance 10,11 verkrijgen.
Adenomateuze polyposis coli (APC) genmutaties vaak voorkomen in humane colorectale adenomen en carcinomen 12 en mutatie van een enkele kopie van het Apc-gen resultaten in familiaire adenomateuze polyposis (FAP), die een uitzonderlijk hoog risico op colonkanker 13 verleent. De muis stam Apc Min / + draagt een truncatie mutatie op codon 850 van het APC-gen en spontaan ontwikkelt meerdere darmadenomen over de dunne darm 14-16. Langdurige intravitale beeldvorming van de darm is uitdagend door de invasiviteit van de procedure, aangezien het openen van de buikholte noodzakelijk om toegang tot de darm. Korte termijn live-imaging studies zijn eerder gepubliceerd op gezonde darm 17,18, maar langdurige directe waarneming van darmtumoren is niet gemeld. Een chirurgische ingreep is ontwikkeld en verfijnd om tumoren te visualiseren door het serosale oppervlak van de darm via de intravitale draaiende schijf microscopiesysteem voorheen het beeld borsttumoren 6,10. In dit document wordt een protocol beschreven waarmee men het gedrag van myeloïde cellen in de tumoren in de dunne darm te volgen met Apc Min / + muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze paper wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor spinning disk confocale beeldvorming van myeloïde cel dynamiek in darmtumoren gedurende enkele uren in een levend dier, belicht vanuit de serosal kant van de darm.
Om ontsteking te voorkomen en optimale fysiologische voorwaarden, beeldvorming van de darm moet worden gedaan op de intacte orgaan. Echter, weergave van de serosale zijde van de darm is een uitdaging, omdat het licht moet door verschillende weefsellagen zoals gladde s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Ying Yu bedanken voor Apc Min / + muizen genotypering. Deze studie werd ondersteund door fondsen van INSERM en subsidies (CA057621 en AI053194) van de National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
