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Um procedimento para Observar Renovação induzida por Contexto de pavloviano condicionado Comportamento Álcool-seeking em Ratos

Published: September 19, 2014
doi:
10.3791/51898
, ,
1Department of Psychology, Center for Studies in Behavioral Neurobiology,Concordia University

Summary

Um procedimento para o estudo da capacidade de um álcool associado contexto ambiental para desencadear a renovação do comportamento de procura de álcool em ratos, está descrito.

Abstract

Contextos ambientais em que as drogas de abuso são consumidos podem desencadear o desejo, a resposta subjetiva pavloviano-condicionado que pode facilitar o comportamento droga-seeking e rápida recaída em usuários de drogas em abstinência. Temos desenvolvido um procedimento para estudar os processos comportamentais e neurais que medeiam o impacto do contexto sobre o comportamento de procura de álcool em ratos. Após a aclimatação ao paladar e efeitos farmacológicos de etanol a 15% na gaiola, ratazanas Long-Evans machos receber formação discriminação Pavloviana (PDT), em câmaras de condicionamento. Em cada sessão diária (de segunda a sexta) PDT, 16 ensaios de cada um dos dois estímulos diferentes de 10 segundos auditivo condicionado ocorrer. Durante um estímulo, o CS +, 0,2 ml de etanol a 15% é fornecido a uma porta de fluido para consumo oral. O segundo estímulo, o CS, não está emparelhado com etanol. Entre as sessões, as inscrições para o porto de líquidos durante o aumento CS +, enquanto que as entradas durante o CS se estabilizar em um nível mais baixo, indicando que a predictive associação entre o CS + e o etanol é adquirido. Durante PDT cada câmara está equipada com uma configuração específica de estímulos contextuais visuais, olfativas e táteis. Seguindo PDT, formação de extinção é realizado na mesma câmara que já está equipado com uma configuração diferente de estímulos contextuais. O CS + e CS são apresentados como antes, mas o etanol é retido, o que causa um declínio gradual na entrada do porto durante o CS +. No momento do teste, os ratos são colocados de volta no contexto PDT e apresentados com o CS CS + e, como antes, mas sem etanol. Esta manipulação desencadeia um aumento robusto e seletiva do número de entradas de porta feitos durante o álcool preditivo CS +, sem alteração na resposta durante o CS. Este efeito, referido como renovação induzida pelo contexto, ilustra a capacidade potente de contextos associados com o consumo de álcool para estimular o comportamento de procura de álcool, em resposta a sinais de álcool de Pavlov.

Introduction

Permanecer sóbrio é um desafio considerável enfrentado por pessoas que sofrem de transtornos de abuso de álcool. A abstinência é um período de vulnerabilidade ao impacto comportamental, psicológica e fisiológica de estímulos ambientais que habitualmente acompanham o uso de álcool, o que pode, através de condicionamento pavloviano, tornar-se associados com a embriaguez 1,2. A exposição a sinais preditivos de álcool pode provocar respostas condicionadas, como desejo de álcool, que podem promover comportamentos de busca de álcool que facilitam recaída 3,4.

As seqüências estereotipadas de comportamento que levam ao consumo de álcool pode causar certos tipos de estímulos a serem rotineiramente experimentou imediatamente antes de os efeitos farmacológicos do consumo de álcool. Por exemplo, a visão, cheiro e sabor de álcool são propriedades sensoriais do álcool que antecedem confiavelmente intoxicação. Além desses sinais, que são referidos como "discreto" ou "proximapistas de l ', contextos ambientais em que as drogas são regularmente usados ​​também podem provocar ânsia 5,6. A exposição a locais físicos em que as drogas foram anteriormente utilizados podem, portanto, ser um gatilho importante para a recaída 7.

Os modelos animais têm sido desenvolvidas para estudar os mecanismos neurais que mediam os efeitos de drogas sobre o comportamento associados contextos de procura de droga 8-13. O procedimento aqui descrito permite a investigação de como os contextos associados ao consumo de álcool pode modular o comportamento de busca do álcool, que é provocada por um discreto, álcool preditivo sugestão pavloviano.

Treino de discriminação pavloviano é conduzida em um contexto ambiental específico, onde os ratos são treinados para comportamentalmente distinguir entre dois estímulos auditivos condicionado, a + CS que está emparelhado com álcool e um CS que não é. Sessões de extinção são, então, realizado em um contexto diferente, onde respondendo ao CS+ Diminui como resultado do álcool a ser retido. Posteriormente, a reexposição ao álcool associado contexto de formação pavloviano desencadeia um aumento seletivo em comportamento de busca do álcool induzida pela CS +, sem alteração na resposta ao CS. Este resultado, que temos consistentemente replicados 9,14-16, estende-se resultados de procedimentos instrumentais condicionado em que foram encontrados os contextos de drogas para estimular a renovação das respostas operantes associados com a entrega de drogas 10,13.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade de Concordia e concordar com as recomendações do Canadian Council on Animal Care. 1. Os animais Obter ratos machos Long-Evans (220-240 g à chegada). Manter ratos em uma temperatura (21 ° C) e umidade (44%), controlada biotério, em um ciclo claro-escuro de 12 horas com as luzes acesas às 7:00 am. Ratos da casa-Pair na chegada. Após 3 dias, os ratos da casa individualmente em gaiolas caixa de sapatos de plástico com cama beta-chip, um osso de nylon, e acesso livre à ração padrão e água. Use tampas gaiola que tem ilhós duplas para permitir a posterior colocação de uma segunda garrafa, para além da garrafa de água. NOTA: Os ratos podem ser alojados individualmente, assim que chegar na unidade de cuidados animais. Comece a lidar com os ratos diariamente. NOTA: Como um guia, uma semana de manipulação é geralmente suficiente para se aclimatar-los a ser picked acima e tratadas pelo experimentador. 2. intermitente Etanol Acesso no Lar da gaiola NOTA: Conduta acesso etanol intermitente na gaiola casa para garantir que os ratos vão beber quantidades fisiologicamente relevantes de etanol antes da fase de treinamento comportamental do experimento começa 17-19. Iniciar este procedimento durante a fase de luz, embora possa ser iniciada em qualquer momento durante o ciclo de luz ou escuro. Prepare duas garrafas para cada rato. Use um 100 ml de plástico cilindro graduado como a garrafa de álcool e uma garrafa de água de plástico padrão de 473 ml. Use uma pequena garrafa de etanol de capacidade cheia quase a capacidade máxima de volume, para minimizar a perda de etanol devido ao vazamento e evaporação. Encher um frasco com etanol a 15%, feito por diluição de etanol a 95% em água da torneira. NOTA: Outras concentrações de etanol, tal como 10% ou 20%, pode ser utilizado em lugar de 15% de etanol. Fill a segunda garrafa com água da torneira. Coloque uma tampa de borracha, com um tubo sipper que contém um rolamento de esferas para minimizar as fugas, em cada frasco. Configure duas gaiolas de controle, tratados de forma idêntica às gaiolas com a ressalva de que as gaiolas de controle não contêm ratos ou roupas de cama. Prepare etanol e garrafas de água para as gaiolas de controle, conforme especificado nas etapas 2.1.1 – 2.1.4. Utilizar as medidas obtidas das gaiolas de controlo para controlar o derramamento e / ou evaporação que pode ocorrer ao longo da sessão de acesso etanol (conforme descrito nos passos 2.8.1 – 2.8.2). Pesar todos os frascos de etanol e água. Anote todos os pesos. Pesar todos os ratos. Anote todos os pesos. Inserir o frasco de etanol e a garrafa de água em cada gaiola e controlar gaiola ao mesmo tempo. Deixe as duas garrafas nas gaiolas para 24 hr. No final do período de 24 horas, remover ambas as garrafas dagaiolas ao mesmo tempo. Pesar todos os frascos de etanol e água. Anote todos os pesos. Para determinar a quantidade de etanol e água foi consumida durante o período de 24 horas, subtrair o peso de cada frasco em que foi retirado da gaiola de origem a partir do peso da garrafa, quando foi colocado na gaiola 24 horas antes de cada rato. Faça o mesmo para as duas gaiolas de controle, e depois calcular a quantidade média de derrame para cada fluido. Subtrair o valor médio do etanol e derramamento de água, respectivamente, a partir das medidas de etanol e consumo de água correspondentes para cada rato. Use esses derrames controlado diferença medidas para calcular o consumo de etanol em g / kg, o consumo de água, e de preferência etanol. Para calcular o consumo de etanol (g / kg), primeiro converter o peso (g) de uma solução de etanol consumido em volume (ml) com base na densidade da solução total, (componentes de etanol + água), de acordopara o volume de fórmula (ml) = peso (g) / densidade (g / ml). NOTA: A densidade da solução irá variar como uma função da concentração de etanol. Em seguida, multiplicar o volume (ml) de uma solução de etanol consumida pela densidade (g / ml) de etanol escalado para a solução percentagem específica utilizada, para se obter o peso (g) de álcool consumido. Dividir o peso (g) de álcool consumido pelo peso do rato (kg) para se obter o g / kg medida de consumo de etanol. Para calcular a preferência etanol, expressar a ingestão de etanol (ml) como uma percentagem do total de fluido (etanol + água, mL) de admissão. Retorne a garrafa de água só volta a gaiola do rato. Para as próximas 24 horas, dar o acesso à água ratos, mas não o etanol. Em vez de uma garrafa de etanol, colocar uma segunda garrafa de água pré-pesado na gaiola de alojamento. No final do período de 24 horas, remover ambas as garrafas de água a partir da gaiola ao mesmo tempo. Pesar os dois conjuntos de garrafas de água. Grave tudo weights. Subtrair o peso de cada frasco em que foi retirado da gaiola de origem a partir do peso da garrafa, quando foi colocado na gaiola 24 horas mais cedo, subtraindo a média da medida de derramamento obtida a partir de gaiolas de controlo tal como descrito nos passos 2.8.1 – 2.8.2. Use essas diferenças medidas controlado por derrames para calcular o consumo de água. Iniciar o ciclo de novo, proporcionando tanto as garrafas de água e etanol em ratos, tal como descrito nas etapas 2.1 a 2.14. Repita esse ciclo por múltiplos (cerca de 12) sessões para induzir níveis elevados e estáveis ​​de consumo de etanol. Ver Figura 1 para resultados representativos do consumo de etanol (g / kg) na gaiola de alojamento. Alternar a posição espacial da garrafa de etanol e de água na tampa através de sessões de gaiola para evitar o desenvolvimento de um lado de preferência. Faça uma solução de etanol fresco uma vez por semana para garantir a concentração de etanol preciso e estável em toda asessões. Minimizar o impacto da evaporação de etanol ao longo de períodos prolongados de tempo usando essa abordagem. 3 Aparelho Casa cada câmara condicionado dentro de um ventilado, cubículo atenuantes de som. Construir cada câmara de condicionamento de um piso de haste de aço inoxidável metal, um teto de policarbonato transparente, policarbonato transparente parede traseira e porta da frente, e as paredes laterais do painel de metal de alumínio. Instalar uma porta de fluido centralmente perto da base da parede lateral direita de metal. Equipar a entrada para a porta de fluido com uma célula fotoeléctrica infravermelha para detectar a entrada na porta. Conectar tubos de polietileno a partir da parte de trás da porta de fluido para uma seringa de 20 ml, contendo etanol, utilizando uma agulha de ponta romba. Colocar a seringa numa bomba de seringa, localizada fora do compartimento amortecedor de som. Para as sessões de treinamento discriminação de Pavlov, carregar etanol para a seringa antes de colocá-lo para dentro da bomba. Primeiro o tubo by avançar manualmente a bomba e limpe o excesso de etanol a partir do porto de líquidos. Na lateral esquerda, instale um houselight branco central, perto do teto da câmara. Instale um clicker (2 ciclo Hz) e um gerador de ruído branco com alto-falante no canto superior esquerdo da parede lateral esquerda. Equipe cada câmara condicionado com uma configuração específica de visuais, olfativas e táteis para criar um contexto distinto. Use dois contextos diferentes, designado Contexto 1 e Contexto 2 Configure metade das câmaras de condicionamento como Contexto 1 ea outra metade como Contexto 2. Para criar um contexto, colocar painéis pretos de papelão sobre o teto e paredes frontal e traseira da câmara, odor spray de limão (10% v / v, feita através da diluição de óleo de limão na água da torneira) em uma placa de Petri e colocá-lo no centro de uma bandeja de resíduos de metal sob o chão da câmara, e inserir um painel claro piso de policarbonato sobre o metal rpiso od. Forre a bandeja de resíduos com papel absorvente ou forro de banco. Para criar Contexto 2, deixar o tecto e as paredes da frente e de trás da câmara de descoberto, de modo que eles são claros, spray odor de amêndoa (10% v / v, preparada por diluição de benzaldeído em água da torneira) em uma placa de Petri, e colocá-lo centralmente em uma bandeja de resíduos de metais sob o chão da câmara, e inserir um painel perfurado chão de metal no chão haste de metal. Forre a bandeja de resíduos com papel absorvente ou forro de banco. 4. Habituação Habituar ratos para a sala de treino comportamental e cada um dos dois contextos dentro de câmaras de condicionamento. Para esta fase do experimento, não carregue o etanol em 20 ml seringas. Habituar ratos para o processo de ser transportados a partir da instalação de cuidados animais para a sala de treino comportamental no laboratório em duas sessões de habituação curtos. Na primeira sessão, carregar os ratos in suas gaiolas em uma carroça com rodas na unidade de cuidados de animais e transportá-los para a sala de treinamento comportamental em laboratório. Iluminar as luzes da sala, ligar os ventiladores em cada som atenuando cubículo, saia da sala, feche a porta e deixe os ratos ajustar a este novo ambiente por 20 minutos, mantendo-se em suas gaiolas no carrinho. No final deste período de 20 min, os ratos retornar para a instalação de cuidados animais. Na segunda sessão, trazer os ratos para a sala de treino comportamental no laboratório. Como antes, deixe as luzes e os ventiladores cubículo na sala. Permanecer no quarto, com a porta fechada para minimizar as distrações, e manusear e pesar cada rato na sala de treinamento comportamental. Registre os pesos, e depois devolver os ratos para a instalação de cuidados com os animais. Habituar ratos para as câmaras condicionado em duas sessões de habituação curtas. Transportar os ratos para a sala de treinamento comportamental, gravar o peso de cada rato,e carregar cada rato na sua secção designada condicionado. Na primeira sessão de habituação configurar metade das câmaras como Contexto 1 eo restante como Contexto 2. Na segunda sessão de habituação configurar cada câmara com o contexto em que não foi utilizado na sessão anterior. Realizar sessões de habituação, de forma contrabalançada, de tal modo que a metade dos ratos são primeiro expostos a um contexto, seguido de Contexto 2, e a outra metade são primeiro expostos a Contexto 2, seguido de Contexto 1. Idealmente, conduzir ambas as sessões de habituação na mesmo dia, embora possam ser repartidos ao longo de dois dias, se necessário. Para as sessões de habituação, use um programa de computador para iluminar o houselight 1 min após o programa ter sido emitido. Registre o número total de entradas de porta fluidos feitas durante uma sessão de 20 min. No final da sessão, programar o houselight para desligar. Não apresenta nenhum etanol ou sugestões durante as sessões de habituação. </li> Remover ratos das câmaras, devolvê-los às suas gaiolas, e transportá-los de volta para a unidade de cuidados animais. Limpe o equipamento (por exemplo, painéis de chão, bandejas de lixo, placas de Petri). Veja o passo 5.7 para mais detalhes. 5. pavloviano Discriminação Training (PDT) Ratos de trem para comportamentalmente discriminar entre um sinal sonoro que é emparelhado com etanol e um segundo sinal sonoro que não é. Para esta fase da experiência, encher as seringas de 20 ml com 15% de etanol. Equipe cada câmara condicionado com uma configuração específica de visual, olfativo e estímulos táteis para criar um contexto distinto, conforme descrito nas etapas 3.3.2 e 3.3.3 Atribuir metade dos ratos a um contexto e a outra metade para Contexto 2 de uma forma contrabalançado, com base no consumo de etanol e de preferência na média entre os dois últimos sessões do procedimento de acesso etanol gaiola de origem. Consulte a context usado durante PDT como Contexto A. NOTA: Cada rato só deve ter um contexto nesta fase de treinamento. Certifique-se de que o estímulo olfativo é o último estímulo contextual para ser adicionado a cada câmara de condicionamento. Fechar as portas da câmara e o compartimento com atenuação de som que contém o estímulo olfativo e minimizar o comingling de odores diferentes. Traga os ratos na sala de treinamento comportamental, gravar o peso de cada rato, e carregar cada rato em sua câmara designado condicionado. Inicie o programa de computador que controla a seguinte seqüência de eventos durante cada sessão PDT. No foi concedida em 5 min, após o programa, iluminar a houselight. Apresentar o estímulo ruído branco eo clicker estímulo 16 vezes cada. Designar um destes estímulos auditivos a ser o CS + e o outro ser a CS, de um modo contrabalançada entre ambos os contextos. Faça de cada CS + e CS julgamento last 10 seg. Entregar 0,2 ml de etanol na porta de fluido durante a última 6 seg do CS +. Não entregar qualquer etanol durante o CS. Faça com que cada sessão PDT últimos 58 min em média. Apresentar o CS + eo CS cada um em uma variável de tempo 67 seg programação. Entradas de registros de fluidos porto durante o intervalo de 10 seg CS (SEC 10, durante apresentação CS), a 10 seg intervalo pré-CS (a 10 seg imediatamente antes da CS início), e os 10 s de intervalo pós-CS (a 10 seg imediatamente seguinte compensar CS), tanto para CS + e apresentações CS, bem como o total de entradas de porta fluido por toda a sessão. Registre também a duração de cada entrada de porta feito durante esses intervalos. No final da sessão, desligue o houselight off. Remover ratos das câmaras, devolvê-los às suas gaiolas, e transportá-los de volta para a unidade de cuidados animais. Verifique as portas de fluidos para assegurar que os ratos consumiram 3,2 ml de etanol entregues em cada PDT sessão. Lavar o etanol para fora do tubo de polietileno com uma seringa de 60 ml contendo uma pequena quantidade de água. Em seguida, passar 60 ml de ar através do tubo usando um segundo, seringa vazia, para se certificar de que está seco. Limpe o equipamento. Para a limpeza diária, lavar os painéis de chão, bandejas de resíduos e placas. Uma vez por semana, limpar toda a câmara de condicionamento. Não use produtos de limpeza perfumados para evitar a introdução de odores indesejados dentro do aparelho experimental. Continuar sessões PDT diariamente até ratos mostram discriminação estável em suas respostas entrada de porta para o CS + vs CS. NOTA: As entradas de porta feitos em resposta ao CS + deve aumentar ao longo sessões, enquanto que as entradas de portas feitas em resposta ao CS deve permanecer baixa. O número exato de sessões PDT necessário para atingir discriminados condicionado responder pode variar, mas, como um guia, pensando em aproximadamente 20 sessões. 6 Extinção Equipe cada cham condicionadober com visuais, olfativas e táteis para criar um contexto que é distinta da que os ratos experimentaram durante as sessões de PDT. Por exemplo, se um contexto foi utilizado em TFD, configurar a câmara de Contexto 2 para as sessões de extinção. Consulte o contexto utilizado durante a extinção em Contexto B. Realizar sessões de extinção de forma idêntica para sessões PDT, mas não entregar qualquer etanol durante o CS +. Use o mesmo programa de computador que foi usado durante PDT para apresentar o + CS e CS. Para manter a consistência entre as fases do experimento, carregar uma seringa vazia na bomba de seringa, e deixar a bomba ligada. Verifique se o tubo de polietileno não contém etanol antes das sessões de extinção. Prosseguir com as sessões de extinção diariamente até ratos já não mostram discriminados responder entre o CS + e CS. NOTA: As entradas de porta feitos em resposta ao CS + deve diminuir gradualmente ao longo das sessões de extinção, até que não haja diference entre entradas de porta feitos em resposta ao CS + e entradas de portos, realizado em resposta ao CS. O número exato de sessões de extinção necessário para extinguir condicionado responder pode variar, mas como um guia, pensando em aproximadamente 8 sessões. Limpar o equipamento na extremidade de cada sessão, como descrito na etapa 5.7. 7-Contexto induzida Renovação Teste Equipar cada câmara de condicionamento com os visuais, olfativas e táteis para criar o contexto que foi experimentado durante as sessões de PDT. Por exemplo, se uma dada ratazana experimentado Contexto 1 em sessões de PDT, configurar a câmara como um Contexto da sessão de teste. Consulte o contexto utilizado durante o ensaio renovação como Contexto A. Realizar o teste de renovação induzida pelo contexto de forma idêntica para sessões de PDT, mas não entregar qualquer etanol durante o teste de renovação. Apresentar o CS + e CS como antes durante as sessões de PDT, mas reter o etanol. Use o mesmo pr computadorogram que foi usado durante PDT para apresentar o CS + e CS. Para manter a consistência entre as fases, carregar uma seringa vazia na bomba de seringa, e deixar a bomba ligada. Certifique-se o tubo de polietileno não contém etanol, antes da sessão de teste. Observe renovação induzida pelo contexto do comportamento álcool-seeking pavloviano condicionado. NOTA: Este efeito de renovação será evidente pelo aumento seletivo do número de entradas de portos, realizado em resposta ao CS +, sem qualquer alteração no comportamento entrada de porta feito em resposta ao CS, em relação ao CS + e CS respondendo observado no final do treinamento extinção. Limpar o equipamento no final da sessão, como descrito na etapa 5.7.

Representative Results

Acesso etanol intermitente na gaiola: O consumo de etanol (g / kg) e preferência aumento de etanol através de sessões de acesso etanol intermitente na gaiola, geralmente atingindo níveis estáveis ​​dentro de 8-12 sessões (Figura 1). No conjunto de dados mostrado na Figura 1, o consumo de etanol estável na média entre as duas últimas sessões de acesso etanol gaiola variou 1,33-6,44 g / kg para os ratos individuais. A fase de consumo de etanol gaiola do experimento pode ser interrompida assim que o g / kg estacionou o consumo, e os ratos são mantidos neste nível estável de beber por um certo número de sessões. Para analisar os dados desta fase, realizar separado análise de medidas repetidas de variância (ANOVA) através do fator intra-sujeito da sessão de consumo de etanol (g / kg) e de preferência etanol. Esquemática do procedimento de renovação induzida pelo contexto: Cada fase doprocedimento experimental (PDT, extinção, teste de renovação) é ilustrada na Figura 2. Veja a figura legenda para mais detalhes. Resposta medidas e análise de dados: Em todas as fases comportamentais descritas a seguir, as respostas entrada de porta feitos durante o CS + e CS são normalizados em relação às respostas entrada de porta de linha de base pré-CS. Para criar as medidas CS normalizados, subtraia o número de entradas de portas feitas durante o intervalo da linha de base pré-CS (a 10 seg imediatamente antes da CS início) a partir do número de entradas de porta feitas durante as apresentações do CS + e CS. A normalizada CS + e medidas cs- normalizados servem como indicadores de comportamento provocada especificamente por apresentações CS, elevado acima dos níveis basais. Realizar medidas repetidas separadas ANOVA com os fatores assunto dentro repetidas de sessão e tipo CS (CS + vs CS) para o PDT e fases de extinção. Para as comparações entre fase (PDT, extinção, renovarteste al), os dados de uso de média entre as duas últimas sessões de PDT e extinção ea uma sessão de dados de teste de renovação em medidas repetidas ANOVA. Para acompanhar efeitos significativos principais e interações, t-testes uso pós hoc para amostras independentes ou pareadas que são corrigidas para comparações múltiplas. Critério de significância foi fixado em α = 0,05. PDT: respostas entrada da porta ao aumento CS + em todas as sessões PDT, ao passo que as respostas entrada portuária à CS- permanecer baixa e estável, de modo geral. Note-se que as respostas entrada da porta para o CS pode aumentar ligeiramente em primeiras sessões de treinamento PDT; no entanto, entradas de porta feitos em resposta ao CS estabilizar a um nível muito mais baixo do que as feitas em resposta ao CS +. Discriminação de sucesso é evidenciado por um aumento estatisticamente significativo nas entradas da porta durante o CS + em comparação com o CS (Figura 3). Este resultado indica que o comportamento álcool-seeking pavloviano condicionado tem seren estabelecida para o CS +, mas não o CS. Extinção: respostas entrada da porta ao CS + diminuir gradualmente ao longo das sessões de extinção. Respostas entrada de porta para o CS permanecer baixa e estável em todas as sessões de extinção. Idealmente, discriminados responder é abolida até o final do treinamento extinção, como evidenciado pela falta de uma diferença estatisticamente significativa entre as entradas de portas para o CS + e CS. No entanto, não é incomum para um certo grau de discriminação de responder a permanecer, até ao final da formação de extinção. Neste caso, é importante verificar que as respostas de entrada da porta para o CS + no final do treino de extinção são estatisticamente menor do que as respostas de entrada de porta para o CS + no início de extinção, bem como no final da PDT (Figura 3) . Este padrão de resultados indica que o comportamento álcool-seeking pavloviano condicionado foi extinto de forma significativa. Teste renovação induzida por Contexto: Portrespostas de entrada para o aumento CS + no teste de renovação induzida pelo contexto, em relação a entradas de porta CS + observados no final do treinamento extinção. Este aumento é seletiva para o CS +, como entradas de porta para o CS permanecem inalterados. Além disso, as entradas de portas para o CS + são estatisticamente elevados em comparação com as entradas da porta para o CS no ensaio de renovação induzida pelo contexto (Figura 4). Confirmação estatística da comparação das entradas de porta CS + entre extinção e teste, bem como comparações de CS + e entradas de porta CS dentro de teste, indica uma renovação seletiva de comportamento pavloviano condicionado em busca de álcool induzida pelo contexto álcool associado ao teste. Figura 1 Escalonamento de consumo de etanol e de preferência induzida por etanol acesso intermitente na gaiola. Média &# 177; SEM (A) consumo de etanol (g / kg) e (B), de preferência o etanol através de 12 sessões de acesso etanol intermitente na gaiola. Ambas as medidas tendem a aumentar em todas as sessões e depois estabilizar. Consumo de etanol estável na média entre as duas últimas sessões de acesso etanol gaiola variou 1,33-6,44 g / kg para ratos individuais. Estes dados foram obtidos em ratos Long-Evans machos potável de 15% (v / v) de etanol. . Figura 2 Um esquema do procedimento experimental O procedimento consiste em três fases: formação discriminação pavloviano (PDT), extinção e teste de renovação induzida pelo contexto. Durante cada sessão PDT, os ratos recebem 16 ensaios de um estímulo auditivo condicionado (CS +) que assinala a entrega de etanol e 16 ensaios deum segundo estímulo auditivo (CS) que não está associado com a entrega do etanol. Sessões de PDT, ocorrem num contexto A, composto por uma configuração específica de visual, olfativo e estímulos táteis. Durante as sessões de extinção, que são realizados em Contexto B, composto por um conjunto diferente de estímulos visuais, olfativos, táteis e, o CS + e CS são apresentados, mas o etanol é retido. Para o teste de renovação induzida pelo contexto, os ratos são devolvidos ao Contexto A, eo CS + e CS são apresentadas sem etanol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 Aquisição e extinção da discriminados pavlovianas condicionado responder para o etanol. Média ± SEM entradas de porta normalizada made durante o CS + e CS através PDT (sessões 1-18) no contexto de um e de extinção (sessões 19-26) em Contexto B. Estes dados foram obtidos utilizando ratos Long-Evans do sexo masculino, treinado com 10% (v / v) etanol como o estímulo incondicionado (US), que foi apresentado em associação com a + CS durante PDT. * P <0,05, CS + contra CS. Figura publicado originalmente em Chaudhri, Sahuque, e Janak (2008). Usado com permissão da Elsevier. Figura 4 renovação de entradas pavlovianas condicionado responder para o etanol. Média ± SEM porta normalizada feitas durante o CS + e CS em sessões PDT no contexto de um, sessões de extinção no Contexto B, e teste de renovação em Contexto A. Os dados são induzidas por Contexto rendimento médio das duas últimas sessões de PDT e extinção; o teste de renovação é uma única sessão. Estesos dados foram obtidos em ratos machos Long-Evans, formados com 10% (v / v) de etanol como o estímulo não condicionado (US), que foi apresentado em associação com o CS + durante a PDT. * P <0,05; ** P <0,001, CS + contra CS. #p <0,05, CS + PDT contra CS + extinção. ^ P <0,05, CS + extinção contra teste CS +. Figura publicado originalmente em Chaudhri, Sahuque, e Janak (2008). Usado com permissão da Elsevier.

Discussion

Os resultados deste processo revelam que os estímulos ambientais distintos que em geral acompanham a entrega de álcool pode adquirir a capacidade de dirigir o comportamento de busca do álcool. Eles também demonstram que estímulos contextuais associados com a disponibilidade ou ausência de álcool antes pode guiar condicionado respostas comportamentais a estímulos álcool preditivo discretos.

As etapas críticas no âmbito do protocolo

Contextos na presente tarefa incorporar estímulos que são externos ao rato. No entanto, o estado interoceptivo do rato em teste também pode constituir um "contexto" que poderia afetar de renovação de 20. Por isso, é importante habituar ratos para quaisquer procedimentos que possam ocorrer antes do teste renovação e mudar seu estado interoceptivo, como microinfusions intracranianas ou injeções sistêmicas. Além disso, a habituação ao microinfusions ou injeções sistêmicas devem ser realizadas antes de ambos extinção e PDT sessions, para impedir que tais procedimentos de se tornar associado com uma fase específica do experimento.

Parâmetros temporais, como a duração do CS, intervalo CS-US, eo intervalo entre tentativas (ITI), têm sido conhecidos por influenciar condicionado responder em uma variedade de condicionamento paradigmas 21-26. Da mesma forma, os parâmetros temporais podem influenciar a observação do efeito de renovação no nosso processo. Qualquer conjunto de outros que não os especificados no protocolo de parâmetros devem ser validadas experimentalmente em estudos-piloto antes de prosseguir para empregá-los em pesquisas mais amplas.

Modificações e solução de problemas

Pesquisa anterior tenha verificado que a quantidade de etanol que os ratos consomem na gaiola pode variar em função do fornecedor de que os ratos são comprados 17,27. Fornecedor é, portanto, uma importante consideração para esta fase do estudo. De igual modo, a escolha da estirpe de ratos deve ser considered com cuidado, pois há inúmeros relatos de diferenças de tensão no consumo de etanol 28-31.

Trabalhos anteriores em um paradigma aversivo condicionado tem mostrado que a idade de desenvolvimento de ratos influencia a observação de renovação de um medo condicionado Pavloviana resposta 32. A falta de um efeito de renovação em ratos muito jovens (menores de dia pós-natal 20) foi sugerido para ser prejudicada devido à codificação de informações contextuais 33. A idade de desenvolvimento de ratos a serem utilizados no presente processo, deve ser tomado em consideração.

Renovação de comportamento pavloviano álcool-seeking condicionado foi observado que 10% 9,16, 15% de 14, ou 20% 15 soluções de etanol foram utilizados durante o acesso etanol gaiola e fases PDT do experimento. Investigadores podem usar qualquer uma dessas concentrações de etanol para fins de estabelecer este procedimento em seu laboratories.

Durante a aquisição de formação discriminação Pavloviana é importante verificar entradas de fluido depois de cada sessão para garantir que todo o etanol que foi entregue foi consumido. Deixando os ratos em câmaras de condicionamento para um adicional de 10 – 15 minutos depois de cada sessão pode ser feito cedo no PDT para encorajar o consumo de todo o etanol que não foi consumido durante a sessão. O número de ratos que saem etanol não consumido nas portas deve diminuir à medida que progride PDT. Se, no final de ratos PDT são (a) não consumir todo o etanol e / ou (b) não responder ao CS +, em seguida, estes assuntos devem ser descartados do estudo. A maioria dos ratos responder de forma confiável mais para a + CS do que o CS. No entanto, alguns ratos podem responder em níveis elevados para ambas as pistas, assim, não mostrando evidências de discriminação. Os ratos que mostram elevada respondendo tanto ao CS + e CS durante PDT não são descartados do estudo. Em nossa experiência, esses assuntos mostram discriminação notáveldurante a primeira sessão de extinção na ausência de etanol, o que sugere que os altos níveis de resposta para o CS durante a TFD são conduzidos pela presença de etanol na porta de fluido. Estes temas também tendem a mostrar efeitos de renovação robustos.

Limitações do procedimento

Porque a renovação de teste é conduzido na ausência de etanol, entradas de porta condicionado induzidos pelo CS + diminuir gradualmente em toda a sessão de teste. Portanto, o montante global de comportamento gerado pelo teste, contra a qual as mudanças induzidas podem ser avaliados, é bastante baixa. Porque nessa tarefa de responder tende a ser maior no início em relação ao final da sessão de teste, é importante examinar os efeitos de manipulações experimentais sobre condicionado respondendo a título de experiência-a-julgamento.

As inscrições no receptáculo fluido fornecer a principal medida dependente nessa tarefa. No entanto, uma entrada de porta errada pode ser registered se um animal está suficientemente perto para o recipiente de fluido para quebrar o feixe de infravermelhos na frente da abertura da porta de fluido com os bigodes. Embora raras, as respostas erradas são óbvias como um aumento dramático na porta de entradas totais em relação ao comportamento do sujeito em sessões anteriores. Filmando os animais que facilitaria a detecção de possíveis respostas erradas, e permitir uma análise mais refinada dos comportamentos exibidos pelos ratos durante todo o treinamento e testes.

Significância da técnica no que diz respeito a métodos alternativos existentes /

Renovação induzida pelo contexto do comportamento droga-seeking é amplamente estudado utilizando uma tarefa condicionamento instrumental em que a variável dependente primária é uma resposta operante, tal como uma alavanca de imprensa 8,34 ou nariz picar 12. No presente procedimento, a resposta de procura da droga é "abordagem condicionado" para a porta de fluido que é provocada por apresentaçõesa + CS. Esta resposta é provavelmente adquiridas através da aprendizagem pavloviana, que é o processo de aprendizagem que medeia a formação de associações entre estímulos ambientais e os efeitos farmacológicos das drogas de abuso em seres humanos.

As aplicações futuras

Esta tarefa pode ser utilizado em combinação com neuropharmacology, Optogenetics e neuroquímica para estudar os mecanismos neuronais que estão envolvidos na renovação induzida pelo contexto de comportamento Pavloviana-condicionado à procura de álcool 16. Além disso, os mecanismos comportamentais e neurais que regulam a aquisição e extinção de comportamento álcool-seeking pavloviano-condicionado pode ser investigado. Por último, esta tarefa pode ser usado para explorar as manipulações de extinção que possam impedir a renovação, uma direção importante para a investigação translacional destinada a reduzir o impacto da droga associada contextos ambientais na reatividade a estímulos preditivos de drogas após a terapia de exposição aos estímulos em addi humanocts.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (RO1 AA014925 awarded to Dr. Patricia H. Janak at University of California, San Francisco, CA, USA), Fonds de recherche du Quebec – Santé (NC) and the Natural Sciences and Engineering Research Council (NC, 387224-2010). The open-access publication of this article was made possible by sponsorship from Med Associates Inc.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Heavy-duty utility cart Rubbermaid #4520-88 Used to transport rats in their home cage from the colony room to the behavior room or other facilities
Rats, Long-Evans Harlan – Rats weighed 220-240g on arrival
Ohaus scale Fisher #S402421 For weighing rats; tare the bottom of a plastic container first, then put the rat in it to weigh it
Beta-chips, aspen Harlan #7090A Bedding for home cage
Nylabone Bio-Serv #K3580 Enrichment provided in the home cage
Autoclavable rodent chow Agribrands, Charles River #5075 For feeding rats
Wire bar cage lid Ancare #R20SS2B Custom made with two slots for  bottles
Cage bottom Ancare #R20PC To house rats
Stoppers Ancare #8.5 Rubber stoppers to occlude opening in water bottles & graduated cylinders; goes with ball point sipper tubes 
Ball point tubes, 1.5" length Ancare #TD-99 Inserted in stoppers, enables rats to drink from water bottles and graduated cylinders
Water bottles Ancare #FSPC8HT 473 ml (16 oz) capacity, needs to be occluded with stopper
Graduated cylinders, 100ml Fisher #0300741 To contain ethanol during alcohol exposure in the home cage; spouted end needs to be cut off to enable occlusion with stoppers
Mettler scale Mettler Toledo #MS6001S For weighing water bottles and ethanol cylinders
Polyethylene tubing, 1/32" inner diameter,  1/32" wall thickness, 3/32" outside diameter Fisher #14-169-1A To connect 20 ml ethanol syringe to fluid port
Needle, 18g, 1.5" length Fisher #B305199 To connect polyethylene tubing to ethanol syringes; needs to be filed
Syringes, 20ml, Luer-Lok non-sterile Fisher #1482316J To contain ethanol on the fluid pumps; needs to be connected to the polyethylene tubing by a 18g 1 1/2 needle
Syringes, 60ml, Luer-Lok non-sterile Fisher #14-820-11 To flush polyethylene tubing after PDT sessions
Single speed syringe pump, 3.33 rpm Med Associates Inc. #ENV-018MD To hold 20 ml ethanol syringes and deliver ethanol
Fluid port Med Associates Inc. #ENV-254-CB To enable ethanol delivery during PDT sessions; connected to ethanol syringes with polyethylene tubing
Port entry infrared detector Med Associates Inc. #ENV-215M Fixed on both sides of  fluid port; need 2 per fluid port
Houselight, 28V, 100mA Med Associates Inc. #ENV-135M Provides general lighting in conditioning chamber
Clicker module Med Associates Inc. #ENV-225SM Auditory stimulus for conditioning chamber
White noise generator with speaker Med Associates Inc. #PHM-100 Auditory stimulus for conditioning chamber
Bar floor Med Associates Inc. #ENV-009A-GF To go with modular test chamber
Bench coat, absorbant VWR #89126-790 Absorbant paper to put in metal tray, needs to be cut to fit the metal tray
Polycarbonate sheet, 1/8" thick, 12-5/8"x10" Johnston Plastics #30102515 To make smooth transparent floor insert used for context 1. Needs to be cut in 11.5"x12.25" pieces
Aluminium sheet perforated, 0.063"thick, 48"x96", 0.250" holes x 0.375" centers Anica Steel – To make perforated floor insert used for context 2. Needs to be cut in 11.5"x12.25" pieces
Black cardboard, 0.053" thick, 28"x44" Omer DeSerres #P1909 To construct panels covering the ceiling, door and back wall of the conditioning chamber in context 1. Needs to be cut to size. Each chamber needs three panels measuring approximately 11.5"x13.25". The panels can be joined by the narrower side using duct tape.
All-purpose strength duct tape, 1.88"x45yd. Duck Tape – Adhesive material to connect the black cardboard panels used to cover the back wall, ceiling and door in context 1.
Modular test chamber Med Associates Inc. #ENV-009A Conditioning chamber
Sound attenuating cubicles Med Associates Inc. #ENV-200R3AM Comes with installed 28V DC fan (#ENV-025F)
Petri dish Fisher #08748B Bottom only, to contain the sprayed solution that provides the odor stimulus; needs to be centered in the metal tray in conditioning chambers
PCI interface package Med Associates Inc. #DIG-700P2-R2 Connects tabletop interface cabinet to computer; includes 1 interface card, 1 Decode card, 1 ribbon cable and 1 28V DC power cable
Large tabletop cabinet and power supply Med Associates Inc. #SG-6510D Used to contain the 12 cards included in the SmartCrtrl 8 Input, 16 Output package
SmartCtrl 8 Input, 16 Output package Med Associates Inc. #DIG-716P2 Used to connect and control the devices in the conditioning chamber. The package includes all the cables, the interface module and the connection panel.
Med PC IV software Med Associates Inc. #SOF-735 Software to run programs. Needs to be installed on the computer.
Monitor LG, 19" LCD Concordia computer store #W1942TQ-BF Computer monitor; to go with computer running Med PC IV
HP Z200 tower workstation Concordia computer store #BZ788US#ABA Computer on which Med PC IV is run
Benzaldehyde, ≥99% Les produits chimiques OMEGA Chemical Company Inc. #B37-50 Dilute in tap water for almond context odor
Lemon oil, cold pressed, California Sigma Aldrich #W262528-1KG-K Dilute in tap water for lemon context odor
Ethyl alcohol, 95% Commercial Alcohols – Dilute in tap water to desired concentration
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References

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Context-induced RenewalPavlovian-conditioned Alcohol-seekingAlcohol RelapseEnvironmental ContextFluid Port EntriesAuditory Conditioned StimuliExtinction TrainingLong-Evans Rats

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Maddux, J., Lacroix, F., Chaudhri, N. A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats. J. Vis. Exp. (91), e51898, doi:10.3791/51898 (2014).
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