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Behavior

Eine Vorgehensweise, um Context-induzierte Erneuerung der Pawlowschen Anlage Alkoholsucht bei Ratten Verhalten beobachten

Published: September 19, 2014
doi:
10.3791/51898
, ,
1Department of Psychology, Center for Studies in Behavioral Neurobiology,Concordia University

Summary

Ein Verfahren, um die Kapazität von einem Alkohol verbundenen Umweltkontextstudie zur Auslösung der Erneuerung der Alkoholsucht bei der Ratte beschrieben.

Abstract

Umwelt Kontexte, in denen Drogen konsumiert werden kann Verlangen, eine subjektive Pawlowschen-konditionierte Reaktion, die Drogen-sucht Verhalten und prompte Rückfall in abstinent Drogenkonsumenten erleichtern auslösen können. Wir haben ein Verfahren, um die Verhaltens-und neuronale Prozesse, die die Auswirkungen der Kontext auf Alkohol-seeking Verhalten bei Ratten zu vermitteln studieren entwickelt. Nach Akklimatisierung an den Geschmack und die pharmakologischen Wirkungen von 15% Ethanol im Käfig, erhalten männlichen Long-Evans-Ratten Pawlow Diskriminierung Ausbildung (PDT) in Klimakammern. In jeder täglich (Mo-Fr) PDT-Sitzung, die jeweils von zwei verschiedenen 10 sec Gehöranlage Reize 16 Studien auftreten. Während eines Stimulus, der CS + 0,2 ml 15% Ethanol wird in einen Fluidanschluss für den oralen Verzehr geliefert. Der zweite Reiz, der CS, wird nicht mit Ethanol gepaart. Über die Sitzungen, Einträge in die Fluidöffnung während der CS + Zunahme, während Einträge in der CS-Stabilisierung auf einem niedrigeren Niveau, das anzeigt, dass ein Predictive Assoziation zwischen der CS + und Ethanol gewonnen. Während PDT jede Kammer mit einer bestimmten Konfiguration von visuellen, taktilen und olfaktorischen Stimuli kontextuellen ausgestattet. Nach PDT ist vom Aussterben Ausbildung in der gleichen Kammer, die jetzt mit einer anderen Konfiguration von Kontextreizen ausgestattet ist durchgeführt. Die CS + und CS sind nach wie vor präsentiert, aber Ethanol wird zurückgehalten, die einen allmählichen Rückgang in Port-Einträge während der CS + verursacht. Bei Test werden Ratten wieder in den Kontext gestellt und PDT mit dem CS + und CS nach wie vor präsentiert, aber ohne Ethanol. Diese Manipulation löst eine stabile und selektive Erhöhung der Anzahl von Eingangsports während des Alkohols prädiktiven CS +, ohne Änderung in der CS antwortet. Dieser Effekt, der als Kontext-induzierte Erneuerung genannt, veranschaulicht die leistungsstarke Kapazität von Zusammenhängen mit dem Alkoholkonsum assoziiert zu Alkohol-sucht Verhalten in Reaktion auf Alkohol Pawlow Hinweise zu stimulieren.

Introduction

Rest nüchtern ist eine große Herausforderung durch Personen, die unter Alkoholmissbrauch Erkrankungen konfrontiert. Abstinenz ist eine Zeit der Anfälligkeit für den Verhaltens, psychologischen und physiologischen Auswirkungen von Umweltreizen, die routinemäßig Alkoholkonsum zu begleiten, die können, durch Pawlowschen Konditionierung, sich mit Rausch 1,2 verbunden. Exposition gegenüber Alkohol prädiktiven Cues bedingter Reaktionen wie Alkohol Begierde, die Alkohol-Rückfall der Suche nach Verhaltensweisen, die 3,4 erleichtern fördern kann zu entlocken.

Die stereotype Verhaltenssequenzen, die den Alkoholkonsum führen kann bestimmte Arten von Stimuli, routinemäßig unmittelbar vor den pharmakologischen Wirkungen von Alkoholkonsum erlebt werden. Zum Beispiel der Anblick, den Geruch und Geschmack von Alkohol sind die sensorischen Eigenschaften von Alkohol, die zuverlässig voraus Rausch. Zusätzlich zu solchen Signale, die als "diskrete" oder "proxima bezeichnet werdenl 'Cues, Umwelt Kontexte, in denen Medikamente werden regelmäßig verwendet wird, kann auch provozieren Verlangen 5,6. Exposition gegenüber physikalischen Standorten, an denen Medikamente haben bisher verwendet wurden, kann daher eine kritische Auslöser für den Rückfall 7 sein.

Tiermodelle wurden entwickelt, um die neuronalen Mechanismen, die die Auswirkungen der Droge verbunden Kontexte auf Drogen-sucht Verhalten 8-13 vermitteln studieren. Das hierin beschriebene Verfahren erlaubt die Untersuchung, wie Kontexte mit Alkoholkonsum kann Alkohol-sucht Verhalten, das durch eine diskrete, Alkohol prädiktiven Pavlovian Cue ausgelöst wird modulieren.

Pawlow Diskriminierung Ausbildung in einem spezifischen ökologischen Kontext, wo Ratten sind verhaltens zwischen zwei Gehöranlage Reize, eine CS +, die mit Alkohol kombiniert wird, und ein CS, die nicht zu unterscheiden geschult durchgeführt. Extinktion Einheiten werden dann in einem anderen Zusammenhang, in dem die Reaktion auf den CS durchgeführt+ Abnimmt, wenn ein Ergebnis der Alkohol zurückgehalten. Anschließend Reexposition zum Alkohol assoziiert, Pavlovian Ausbildung Kontext löst eine selektive Zunahme des Alkoholsuchverhalten der CS + hervorgerufen, ohne Änderung in Reaktion auf die CS. Dieses Ergebnis, das haben wir konsequent repliziert 9,14-16 erstreckt sich Erkenntnisse aus der instrumentellen Konditionierungsverfahren, in dem Drogen Kontexten gefunden worden, um die Erneuerung der operanten Reaktionen mit Drug-Delivery 10,13 assoziiert zu stimulieren.

Protocol

Alle Verfahren werden von der Animal Research Ethics Committee an der Concordia Universität genehmigt und stimmen mit den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care. 1. Tiere Erhalten männlichen Long-Evans-Ratten (220 – 240 g bei Ankunft). Pflegen Ratten in einem Temperatur (21 ° C) und Luftfeuchtigkeit (44%) kontrolliert Tierstation, auf einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus mit Lichtern auf 7:00 Uhr. Paar-Haus Ratten bei der Ankunft. Nach 3 Tagen, Hausratten einzeln in Plastikkäfigen Schuhkarton mit Beta-Chip-Bettwäsche, eine Nylon-Knochen und freien Zugang zu Standardrattenfutter und Wasser. Verwenden Käfig Deckel, die doppelte Ösen für die nachfolgende Platzierung einer zweiten Flasche ermöglichen, zusätzlich zu der Wasserflasche zu haben. HINWEIS: Die Ratten einzeln untergebracht werden, sobald sie in der Tierstation ankommen. Beginnen, Ratten täglich behandeln. HINWEIS: Als Richtwert ist eine Woche der Behandlung in der Regel ausreichend, um sie als pi akklimatisierencked und vom Experimentator behandelt. 2. Gelegentliche Ethanol-Zugang im Käfig HINWEIS: Verhaltens intermittierende Ethanol-Zugang in den eigenen Käfig, um sicherzustellen, dass Ratten wird physiologisch relevanten Mengen von Ethanol, bevor das Verhaltenstraining Phase des Experiments beginnt 17-19 trinken. Initiieren dieses Verfahren während der Lichtphase, obwohl sie jederzeit während der hellen oder dunklen Zyklus initiiert werden. Bereiten Sie zwei Flaschen für jede Ratte. Verwenden Sie ein 100-ml-Plastikmesszylinder als Ethanol-Flasche und einer 473 ml Standard-Kunststoff-Wasserflasche. Verwenden Sie eine relativ geringe Kapazität Ethanol-Flasche, fast auf maximale Lautstärke Kapazität gefüllt, um den Verlust von Ethanol durch Leckage und Verdunstung zu minimieren. Füllen Sie eine Flasche mit 15% Ethanol, 95% durch Verdünnen Ethanol in Leitungswasser. HINWEIS: Andere Ethanolkonzentrationen, wie 10% oder 20%, können anstelle von 15% Ethanol verwendet werden. Fiwerde die zweite Flasche mit Leitungswasser. Legen Sie eine Gummistopfens mit einer Zuführungsschlauch, der ein Kugellager, um ein Auslaufen zu minimieren, in jede Flasche enthält. Bis zwei Steuer Käfige, identisch zu den Käfigen mit der Ausnahme, dass die Steuer Käfige haben Ratten oder Bettwäsche enthalten behandelt eingestellt. Bereiten Ethanol und Wasser-Flaschen für die Steuer Käfige wie in den Schritten 2.1.1 – 2.1.4. Verwenden Sie die von den Steuer Käfige erhalten, um für Verschütten und / oder Verdampfung, die im Laufe des Ethanols Zugriffssitzung auftreten können (wie in den Schritten 2.8.1 beschrieben – 2.8.2) Schutzmaßnahmen. Wiegen alle Ethanol und Wasser-Flaschen. Notieren Sie alle Gewichte. Wiegen alle Ratten. Notieren Sie alle Gewichte. Legen Sie das Ethanol-Flasche und die Wasserflasche auf jedem Heimkäfig Käfig und Kontrolle zugleich. Lassen Sie beide Flaschen auf die Käfige für 24 Stunden. Am Ende des 24-Stunden-Zeitraum, entfernen Sie die beiden Flaschen aus derKäfige gleichzeitig. Wiegen alle Ethanol und Wasser-Flaschen. Notieren Sie alle Gewichte. Um zu bestimmen, wie viel Ethanol und Wasser wurde während des 24 Stunden-Zeitraum verbraucht wird, subtrahiert das Gewicht jeder Flasche, wenn es aus dem Käfig aus dem Gewicht der Flasche entfernt werden, wenn es auf dem Käfig 24 Stunden früher für jede Ratte gegeben. Machen Sie dasselbe für die beiden Regel Käfige, und dann die Berechnung der Durchschnittsbetrag der Verschüttung für jede Flüssigkeit. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Menge von Ethanol und Wasser Verschütten bzw. aus den entsprechenden Ethanol-und Wasserverbrauch Maßnahmen für jede Ratte. Verwenden Sie diese Verschütten gesteuert Unterschied Maßnahmen zur Ethanolkonsum in g / kg, Verbrauch von Wasser und Ethanol Vorlieben zu berechnen. Ethanol Verbrauch (g / kg), das erste Gewicht (g) Ethanol-Lösung in das Volumen (ml) verbraucht zu konvertieren, basierend auf der Dichte der gesamten Lösung (Ethanol + Wasser-Komponenten) zu berechnen, nachder Formel Volumen (ml) = Gewicht (g) / Dichte (g / ml). HINWEIS: Die Dichte der Lösung wird als Funktion der Ethanolkonzentration variieren. Als Nächstes multiplizieren das Volumen (ml) Ethanol-Lösung durch die Dichte (g / ml) Ethanol für die spezifische Anteil Lösung verwendet skaliert verbraucht, um das Gewicht (g) an Ethanol zu erhalten. Teilen Sie das Gewicht (g) Ethanol durch das Rattengewicht (kg) verbraucht, um die g / kg Maß der Ethanolkonsum zu erhalten. Ethanol Vorlieben zu berechnen, ausdrücken Ethanolaufnahme (ml) als Prozentsatz des Gesamtflüssigkeit (Ethanol + Wasser, ml) Aufnahme. Bringen Sie die Wasserflasche nur zurück nach Hause Käfig der Ratte. Für die nächsten 24 Stunden, geben die Ratten Zugang zu Wasser, aber nicht zu Ethanol. Statt einer Flasche Ethanol, legen Sie ein vorgewogen zweite Wasserflasche auf dem Käfig. Am Ende des 24-Stunden-Zeitraum, entfernen Sie die beiden Wasserflaschen aus dem Käfig in der gleichen Zeit. Wiegen beide Arten von Wasser-Flaschen. Notieren Sie alle weights. Subtrahieren das Gewicht jeder Flasche, wenn es aus dem eigenen Käfig von dem Gewicht der Flasche entfernt werden, wenn sie auf der Heimkäfig 24 Stunden zuvor gelegt, Subtrahieren der durchschnittlichen Verschütten Maßnahme aus Steuer Käfige erhalten wie in den Schritten 2.8.1 beschrieben – 2.8.2. Verwenden Sie diese Verschütten gesteuerte Unterschied Maßnahmen zur Wasserverbrauch zu berechnen. Beginnen Sie den Zyklus erneut, indem sowohl Ethanol und Wasser-Flaschen an Ratten, wie in den Schritten 2.1 bis 2.14 beschrieben. Wiederholen Sie diesen Zyklus für mehrere (ca. 12) Sitzungen, um eine hohe und stabile Ebenen der Ethanolkonsum zu induzieren. Siehe Abbildung 1 für repräsentative Ergebnisse der Ethanolkonsum (g / kg) im Käfig. Abwechselnd die räumliche Lage der Ethanol und Wasserflasche auf dem Käfigdeckel über die Sitzungen, die Entwicklung von Seitenpräferenz zu verhindern. Machen Sie eine frische Ethanollösung einmal pro Woche, um genaue und stabile Ethanolkonzentration über zu gewährleistenSitzungen. Minimierung der Auswirkungen der Verdampfung von Ethanol über eine längere Zeitdauer unter Verwendung dieses Ansatzes. 3. Geräte Haus jeder Klimakammer in einer belüfteten, schalldämpfenden Kabine. Konstruieren jedes Konditionierungskammer aus einem Edelstahl-Metallstab Stock, eine klare Polycarbonat Decke, klarem Polycarbonat Rückwand und Fronttür und Aluminium Metallplatte Seitenwände. Installieren Sie eine Fluidöffnung zentral in der Nähe der Basis der rechten Seitenwand Metall. Rüsten den Eingang der Fluidanschluss mit einem Infrarot-Lichtschranke, um Einträge in die Öffnung zu erfassen. Verbinden Polyethylenschlauch von der Rückseite des Fluidöffnung zu einer 20 ml Spritze mit Ethanol unter Verwendung eines stumpfen Nadel. Legen Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe außerhalb der schalldämpfenden Schrank gelegen. Für Pawlow Diskriminierung Schulungen, laden Ethanol in die Spritze, bevor Sie es in die Pumpe. Prime der Schlauch by manuell Förderung der Pumpe, und wischen Sie das überschüssige Ethanol aus dem Fluidanschluss. Auf der linken Seitenwand, installieren Sie einen weißen houselight zentral in der Nähe der Decke der Kammer. Installieren Sie einen Clicker (2 Hz-Zyklus) und einen weißen Rauschgenerator mit Lautsprecher in der linken oberen Ecke des linken Seitenwand. Statten Sie jeden Klimakammer mit einer bestimmten Konfiguration von visuellen, olfaktorischen und taktilen Reizen zu einem unverwechselbaren Kontext zu schaffen. Verwenden Sie zwei unterschiedliche Kontexte, bezeichnet Kontext 1 und Kontext 2. Konfigurieren Sie die Hälfte der Klimakammern als Kontext 1 und die andere Hälfte als Kontext 2. Um Kontext 1 zu erstellen, legen Sie schwarze Pappe Platten über die Decke und die vorderen und hinteren Wänden der Kammer, Spray Zitronenduft (10% v / v, durch Verdünnen Zitronenöl in Leitungswasser) in eine Petrischale und legen Sie sie in der Mitte eines Metallabfallfach unter dem Boden der Kammer, und legen Sie eine klare Polycarbonat Bodenplatte über dem Metall rod Boden. Säumen den Abfallbehälter mit einem saugfähigen Papiertuch oder Bank-Liner. Um Kontext 2 zu erstellen, lassen Sie die Decke und Vorder-und Rückwände der Kammer aufgedeckt, so dass sie klar sind, sprühen Mandelgeruch (10% v / v, durch Verdünnen Benzaldehyd in Leitungswasser) in eine Petrischale und legen Sie sie zentral in einem Metallabfallfach unter dem Boden der Kammer, und legen Sie eine perforierte Metallbodenplatte über die Metallstange Boden. Säumen den Abfallbehälter mit einem saugfähigen Papiertuch oder Bank-Liner. 4. Habituation Gewöhnen Ratten auf die Verhaltenstraining Raum und jeder der beiden Kontexte innerhalb Anlage Kammern. In dieser Phase des Experiments nicht Ethanol in den 20 ml Spritzen geladen. Ratten zu gewöhnen, um den Prozess der von der Tierstation auf die Verhaltensschulungsraum im Labor in zwei kurzen Gewöhnungs Sitzungen transportiert. In der ersten Sitzung, laden die Ratten in ihre Käfige auf einem Rollwagen in der Tierstation, und transportieren sie zu den Verhaltens-Schulungsraum im Labor. Beleuchten die Raumbeleuchtung, schalten Sie auf die Fans in jedem schalldämpfenden Schrank, den Raum zu verlassen, schließen Sie die Tür und ließ die Ratten anpassen, um diese neue Umgebung für 20 Minuten, während sie in ihre Käfige auf dem Wagen zu bleiben. Am Ende dieser 20 Minuten Zeit, kehren die Ratten in die Tierstation. In der zweiten Sitzung, bringen die Ratten auf die Verhaltensschulungsraum im Labor. Nach wie vor, das Licht und Schrank Fans in den Raum. Bleiben im Zimmer, bei geschlossener Tür, um Ablenkungen zu minimieren und zu behandeln und wiegen jede Ratte in der Verhaltensschulungsraum. Notieren Sie sich die Gewichte, und dann die Ratten zurück zum Tierstation. Gewöhnen Ratten zu den Klimakammern in zwei kurzen Gewöhnungs Sitzungen. Transportieren die Ratten auf die Verhaltensschulungsraum, notieren das Gewicht jeder Ratte,und laden Sie jede Ratte in die Klimakammer bezeichnet. In der ersten Sitzung festgelegt Gewöhnung bis die Hälfte der Kammern als Kontext 1 und den Rest als Kontext 2. In der zweiten Sitzung Gewöhnung jede Kammer einzurichten mit dem Kontext, die nicht in der vorherigen Sitzung verwendet wurde. Gewöhnung führen Sitzungen in einer Art und Weise ausgeglichen, so dass die Hälfte der Ratten werden zunächst Kontext 1 ausgesetzt, gefolgt von Kontext 2, und die andere Hälfte sind erste Kontext 2 ausgesetzt, gefolgt von Kontext 1. Idealerweise führen beide Gewöhnung Sitzungen in der am gleichen Tag, auch wenn sie sich über zwei Tage verteilt werden könnte, wenn nötig. Für Gewöhnung Sitzungen, verwenden Sie ein Computerprogramm, um die houselight 1 min zu beleuchten, nachdem das Programm ausgegeben wurde. Notieren Sie sich die Gesamtzahl der Fluidanschluss Einträge während eines 20 Minuten-Sitzung gemacht. Am Ende der Sitzung, programmieren die houselight zu deaktivieren. Ethanol oder jede Merkmale während Gewöhnung Sitzungen präsentieren nicht. </li> Ratten zu entfernen aus den Kammern, kehren sie in ihre Heimatkäfige, und transportieren sie zurück in die Tierstation. Reinigen Sie das Gerät (zB Bodenplatten, Abfallschalen, Petrischalen). Siehe Schritt 5.7 für weitere Details. 5. Pawlowdiskriminierungstraining (PDT) Zug Ratten, die verhaltens unterscheiden zwischen einem Gehör Cue, die mit Ethanol und einem zweiten Gehör Cue, die nicht gepaart ist. In dieser Phase des Experiments, füllen die 20 ml Spritzen mit 15% Ethanol. Statten Sie jeden Klimakammer mit einer bestimmten Konfiguration von visuellen, olfaktorischen und taktilen Reizen zu einem unverwechselbaren Kontext zu schaffen, wie in den Schritten 3.3.2 und 3.3.3 beschrieben Weisen Sie die Hälfte der Ratten Kontext 1 und die andere Hälfte zum Kontext 2 in einem Gegengewichts Mode, basierend auf Ethanolkonsum und Vorzugs gemittelt über die letzten 2 Sitzungen des Heimkäfig Ethanol Zugangsverfahren. Beziehen sich auf die Fortsetzungext während PDT verwendet als Kontext A. HINWEIS: Jede Ratte sollte nur einen Kontext zu erleben in dieser Phase der Ausbildung. Stellen Sie sicher, dass die Geruchsreizes ist die letzte Kontextreiz, jedem Behandlungsraum hinzugefügt werden. Schließen Sie die Türen der Kammer und dem schalldämpfenden Kabine, um den olfaktorischen Reiz enthalten und die Vermischungen künftig von verschiedenen Gerüche zu minimieren. Bringen die Ratten in der Verhaltensschulungsraum, notieren das Gewicht jeder Ratte, und laden Sie jede Ratte in die Klimakammer bezeichnet. Starten Sie den Computer-Programm, das die folgende Sequenz von Ereignissen während jeder Sitzung PDT steuert. 5 min nach dem Programm ausgegeben wurde, beleuchten die houselight. Präsentieren Sie das weiße Rauschen Reiz und der Clicker Reiz 16 Mal jeweils. Bestimmen Sie eine dieser auditive Reize, um die CS + und die andere, um die CS sein, in einer Art und Weise ausgeglichen über beide Kontexte. Machen jedes CS + und CS-Studie last 10 sek. Liefern 0.2 ml Ethanol in die Fluidöffnung in den letzten 6 sec des CS +. Keinerlei Ethanol während der CS nicht liefern. Machen jedes PDT-Sitzung letzten 58 min im Durchschnitt. Präsentieren Sie die CS + und CS die jeweils auf einer variablen Zeit 67 sec Zeitplan. Datensatz Fluidöffnung Eingaben während der 10 sec CS Intervalls (10 s bei CS Präsentation), die 10 Sekunden vor-CS Intervalls (10 s unmittelbar vor Beginn CS) und 10 sec nach der CS Intervalls (10 s sofort folgenden CS-Offset) sowohl für CS + und CS-Präsentationen, sowie der Gesamtfluidanschluss Einträge für die gesamte Sitzung. Auch aufzeichnen die Dauer der einzelnen Port-Eintrag in diesen Intervallen. Am Ende der Sitzung, drehen Sie den houselight aus. Ratten zu entfernen aus den Kammern, kehren sie in ihre Heimatkäfige, und transportieren sie zurück in die Tierstation. Überprüfen Sie die Fluidanschlüsse, um sicherzustellen, dass Ratten, die verbraucht 3,2 ml Ethanol in jeder PDT s geliefertession. Spülen Sie das Ethanol aus dem Polyethylenschlauch mit einer 60 ml Spritze mit einer kleinen Menge Wasser. Dann passieren 60 ml Luft durch den Schlauch mit einem zweiten, leeren Spritze, um sicherzustellen, dass es trocken ist. Reinigen Sie das Gerät. Für die tägliche Reinigung, waschen Sie die Bodenplatten, Abfallfächer und Petrischalen. Einmal in der Woche, reinigen Sie die gesamte Konditionierungskammer. Verwenden Sie keine Reinigungsmittel duftende Einführung zu vermeiden unerwünschte Gerüche in die Versuchsapparatur. Weiter PDT-Sitzungen täglich bis Ratten zeigen stabile Diskriminierung in ihrem Port-Eintrag Antworten auf die CS + vs CS. HINWEIS: Port-Eintrag in Reaktion auf den CS + gemacht sollte über Sitzungen zu erhöhen, während Porteinträge in Reaktion auf die CS hergestellt tief bleiben. Die genaue Anzahl der PDT-Sitzungen notwendig, diskriminiert zu erreichen Anlage reagiert, kann variieren, aber, wie ein Führer, planen etwa 20 Sitzungen. 6. Extinction Statten Sie jeden Anlage Chamber mit visuellen, olfaktorischen und taktilen Reizen, um einen Kontext, der sich von der einen die Ratten während der PDT-Sitzungen erlebt zu schaffen. Wenn zum Beispiel 1 wurde im Kontext PDT verwendet, konfigurieren die Kammer Kontext 2 zum Löschen Sitzungen. Erhalten Sie über die während der Extinktion als Kontext B verwendet Führen Aussterben Sitzungen identisch PDT-Sitzungen, aber keine Ethanol während der CS + zu liefern. Verwenden Sie die gleiche Computerprogramm, das während der PDT verwendet wurde, um den CS + und CS zu präsentieren. Um die Konsistenz über den Phasen des Experiments zu erhalten, legen Sie eine leere Spritze in die Spritzenpumpe, und lassen Sie die Pumpe eingeschaltet. Stellen Sie sicher, dass die Polyethylen-Schlauch nicht Ethanol enthalten vor Aussterben Sitzungen. Weiter Aussterben Sitzungen täglich bis Ratten nicht mehr diskriminiert Show reagiert zwischen dem CS + und CS. HINWEIS: Port-Eintrag in Reaktion auf den CS + gemacht schrittweise über Extinktion Sitzungen sinken, bis es keine differenz zwischen Anschlusseinträge in Reaktion auf die CS + gemacht und Anschlusseinträge in Reaktion auf die CS hergestellt. Die genaue Zahl der vom Aussterben Sitzungen notwendig, Anlage reagiert, kann variieren löschen, aber als Führer, planen etwa 8 Sitzungen. Reinigen Sie das Gerät am Ende jeder Sitzung, wie in Schritt 5.7 beschrieben. 7. Context-induzierte Renewal-Test Anlegen jeder Klimakammer mit den visuellen, olfaktorischen und taktilen Reizen, um den Kontext, die während der PDT-Sitzungen erlebt wurde erstellen. Zum Beispiel, wenn eine bestimmte Ratte erlebt Kontext 1 in der PDT-Sitzungen konfigurieren seiner Kammer als Kontext 1 in der Testsitzung. Erhalten Sie über die während der Erneuerung Test als Kontext verwendet A. Führen Sie den Kontext-induzierte Erneuerung Test identisch mit PDT-Sitzungen, aber keine Ethanol während der Erneuerung Test liefern. Präsentieren die CS + und CS nach wie vor während der PDT-Sitzungen, aber zurückhalten, das Ethanol. Verwenden Sie den gleichen Computer prOgram, die während der PDT verwendet wurde, um den CS + und CS zu präsentieren. Um die Konsistenz Phasen zu erhalten, laden Sie eine leere Spritze in die Spritzenpumpe, und lassen Sie die Pumpe eingeschaltet. Stellen Sie sicher, dass die Polyethylen-Schlauch nicht Ethanol enthalten, bevor der Testsitzung. Beachten Kontext-induzierte Erneuerung der Pawlowschen Anlage Alkoholsucht Verhalten. ANMERKUNG: Diese Erneuerung Effekt wird offensichtlich sein, durch eine selektive Erhöhung der Anzahl von Eingangsports in Abhängigkeit von der CS + gemacht, ohne Veränderung der Eingangsöffnung Verhalten in Reaktion auf die CS, bezogen auf CS + und CS hergestellt Reagieren auf die beobachtete Ende des Aussterbens Ausbildung. Reinigen Sie das Gerät am Ende der Sitzung, wie in Schritt 5.7 beschrieben.

Representative Results

Intermittierende Ethanol Zugang im Käfig: Ethanol Verbrauch (g / kg) und Ethanol bevorzugt Anstieg über Sitzungen der intermittierenden Ethanol Zugang im Käfig, in der Regel erreicht ein stabiles Niveau in 8 – 12 Sitzungen (Abbildung 1). In der in 1 gezeigten Datensatz gemittelt stabile Ethanolkonsum in den letzten beiden Sitzungen Käfig Ethanol Zugang reichten von 1,33 bis 6,44 g / kg für einzelne Ratten. Der Käfig Ethanolkonsum Phase des Experiments kann gestoppt werden, sobald die g / kg Verbrauch ein Plateau erreicht hat, und Ratten sind in diesem stabilen Niveau von Trinkwasser für eine Anzahl von Sessions gehalten. Um Daten aus dieser Phase zu analysieren, führen getrennte wiederholter Maßnahmen Varianzanalyse (ANOVA) über die intraindividuelle Faktor Sitzung für Ethanolkonsum (g / kg) und Ethanol Präferenz. Schematische Darstellung der Kontext-induzierte Verlängerungsverfahren: Jede Phase desVersuchsdurchführung (PDT, Aussterben, Erneuerung Test) ist in Abbildung 2 veranschaulicht. Siehe die Bildunterschrift für weitere Details. Reaktionsmaßnahmen und Datenanalyse: In allen nachfolgend beschriebenen Verhaltensphasen, sind Port-Eintrag Antworten während der CS + und CS gemacht normiert mit Bezug auf Eintrag Antworten Baseline-Port-CS vor. Um die normierten CS Maßnahmen erstellen, ziehen Sie die Anzahl der Anschlusseinträge während der Pre-Baseline-Intervall CS gemacht (die 10 Sekunden unmittelbar vor der CS Beginn) aus der Anzahl der Port-Einträge während der Präsentationen des CS + und CS gemacht. Die normalisierte CS + und CS-normierten Maßnahmen dienen als Indikatoren für Verhalten hervorgerufen insbesondere durch CS-Präsentationen, über den Ausgangswerten erhöht. Führen getrennte wiederholte Messungen ANOVA mit wiederholten intraindividuelle Faktoren der Sitzung und CS-Typ (CS + vs CS) für die PDT und Aussterben Phasen. Für Vergleiche zwischen Phase (PDT, Aussterben, erneuernal-Test), gemittelt Verwendung von Daten über den letzten beiden Sitzungen der PDT und Extinktion und einer Sitzung der Erneuerung Testdaten in wiederholten ANOVA Messungen. Im Nachgang zu signifikanten Haupteffekten und Wechselwirkungen, die Verwendung post hoc t-Tests für unabhängige oder gepaarte Stichproben, die für multiple Vergleiche korrigiert. Kriterium für die Bedeutung ist bei α = 0,05 festgelegt. PDT: Port Eintrag Antworten auf die CS + Anstieg über PDT-Sitzungen, während Port-Eintrag Antworten auf die CS nach wie vor niedrig und stabil, insgesamt. Beachten Sie, dass Port-Eintrag Antworten auf die CS in den ersten Sitzungen der PDT Training leicht erhöhen; Jedoch Anschlusseinträge in Reaktion auf die CS hergestellt Stabilisierung bei einem viel niedrigeren Niveau als die in Reaktion auf die CS + hergestellt. Erfolgreicher Diskriminierung wird durch eine statistisch signifikante Erhöhung in der Anschlusseinträge bei der CS + belegt verglichen mit dem CS (Abbildung 3). Dieses Ergebnis zeigt, dass Pawlowanlage Alkoholsucht Verhalten haten auf den CS +, nicht jedoch für die CS. Extinction: Port Eintrag Antworten auf die CS + allmählich über Aussterben Sitzungen sinken. Port-Eintrag Antworten auf die CS bleiben niedrig und stabil über Aussterben Sitzungen. Idealerweise unterschieden Reaktion wird durch das Ende der Löschung Ausbildung beseitigt, wie durch das Fehlen einer statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Eingangsports zu den CS + und CS belegt. Es ist jedoch nicht ungewöhnlich gewissen diskriminiert reagiert bleiben, auch am Ende der Extinktion Ausbildung. In diesem Fall ist es wichtig, am Ende des Aussterbens Ausbildung sind statistisch niedriger als Port-Eintrag Antworten auf die CS + zu Beginn des Aussterbens, als auch am Ende der PDT zu überprüfen, dass die Port-Eintrag Antworten auf die CS + (Abbildung 3) . Dieses Muster der Ergebnisse zeigt, dass Pawlowanlage Alkoholsucht Verhalten wurde deutlich ausgelöscht. Kontext-induzierte Erneuerung Test: PortEintrag Antworten auf die CS + Zunahme Rahmen induzierte Verlängerung Test, bezogen auf CS + am Ende der Ausbildung Extinktion beobachtet Anschlusseinträge. Dieser Anstieg ist auf die selektive CS + als Hafen Einträge in die CS unverändert bleiben. Zusätzlich sind Anschlusseinträge zum CS + statistisch erhöhte im Vergleich zu Portangaben zu der CS im Rahmen induzierte Verlängerung Test (Abbildung 4). Statistische Vergleiche der Bestätigung der CS + Porteinträge zwischen Aussterben und Test, sowie Vergleiche von CS + und CS-Anschluss Einträge innerhalb Test, ein Indikator für eine Erneuerung der Pawlowschen Anlage Alkohol-sucht Verhalten durch den Alkohol zugeordneten Kontext bei Test induziert. Abbildung 1. Eskalation der Ethanolkonsum und Vorzugs durch intermittierende Ethanol-Zugang in den Heimkäfig induziert. Bedeuten und# 177; SEM (A) Ethanol Verbrauch (g / kg) und (B) Ethanol bevorzugt über 12 Sitzungen der intermittierenden Ethanol Zugang im Käfig. Beide Maßnahmen in der Regel über mehrere Sitzungen zu erhöhen und dann zu stabilisieren. Stabilen Ethanolkonsum gemittelt über die letzten beiden Sitzungen des Heimkäfig Ethanol Zugang reichten von 1,33 bis 6,44 g / kg für einzelne Ratten. Diese Daten wurden unter Verwendung von männlichen Long-Evans-Ratten Trink 15% (v / v) Ethanol. . Abbildung 2. Ein Schema des Versuchsverfahren Das Verfahren besteht aus drei Phasen: Pawlow Diskriminierung Ausbildung (PDT), Aussterben, und Kontext-induzierte Erneuerung Test. Während jeder Sitzung PDT erhalten Ratten 16 Studien, die ein Gehör bedingten Reiz (CS +), die die Lieferung von Ethanol und 16 Studien von Signaleneine zweite auditorischen Reizes (CS), die nicht mit Ethanol Lieferung verbunden ist. PDT-Sitzungen finden in Kontext A, der eine bestimmte Konfiguration von visuellen, olfaktorischen und taktilen Reizen zusammen. Während Extinktion Sitzungen, die im Kontext B durchgeführt werden, von einem anderen Satz von visuellen, Geruchs und taktilen Reizen besteht, die CS + und CS dargestellt, aber Ethanol zurückgehalten. Für den Kontext-induzierte Erneuerung Test werden Ratten Kontext Ein zurückgegeben und die CS + und CS sind ohne Ethanol vorgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Erwerb und Erlöschen der Pawlowschen diskriminiert Anlage reagiert für Ethanol. Mittelwert ± SEM normiert Porteinträge made während der CS + und CS für PDT (Sitzungen 1-18) im Kontext A und Extinktion (Sessions 19-26) in Zusammenhang B. Diese Daten wurden erhalten unter Verwendung von männlichen Long-Evans-Ratten mit 10% ausgebildet (v / v) Ethanol als unbedingter Reiz (US), die in Verbindung mit der CS + während der PDT präsentiert wurde. * P <0,05, im Vergleich zu CS + CS. Abbildung ursprünglich in Chaudhri, Sahuque & Janak (2008) veröffentlicht. Verwendung mit Genehmigung von Elsevier. Abbildung 4. Kontext-induzierte Erneuerung der Pawlowschen Anlage reagiert für Ethanol. Mittelwert ± SEM normiert Porteinträge während der CS + und CS in der PDT-Sitzungen im Kontext A, Aussterben Sitzungen im Kontext B und Erneuerung Test in Context A. Daten sind gemittelt über die letzten beiden Sitzungen für die PDT und Aussterben; die Erneuerung Test ist eine einzige Sitzung. DieseDaten wurden unter Verwendung von männlichen Long-Evans-Ratten mit 10% (v / v) Ethanol als unbedingter Reiz (US), die in Verbindung mit der CS + bei PDT dargestellt ausgebildet wurde, erhalten. * P <0,05; ** P <0,001, im Vergleich zu CS + CS. #p <0,05, CS + PDT gegenüber CS + Aussterben bedroht. ^ P <0,05, CS + Aussterben gegen CS + Test. Abbildung ursprünglich in Chaudhri, Sahuque & Janak (2008) veröffentlicht. Verwendung mit Genehmigung von Elsevier.

Discussion

Results from this procedure reveal that discrete environmental stimuli that routinely accompany alcohol delivery can acquire the capacity to drive alcohol-seeking behavior. They also demonstrate that contextual stimuli associated with the prior availability or absence of alcohol can guide conditioned behavioral responses to discrete alcohol-predictive cues.

Critical steps within the protocol

Contexts in the present task incorporate stimuli that are external to the rat. However, the interoceptive state of the rat at test can also constitute a ‘context’ that could affect renewal20. It is therefore important to habituate rats to any procedures that may occur before the renewal test and change their interoceptive state, like intracranial microinfusions or systemic injections. Moreover, habituation to microinfusions or systemic injections should be conducted prior to both extinction and PDT sessions, to prevent such procedures from becoming associated with one specific phase of the experiment.

Temporal parameters, such as CS duration, CS-US interval, and intertrial interval (ITI), have long been known to influence conditioned responding in a variety of conditioning paradigms21-26. Similarly, temporal parameters may influence the observation of the renewal effect in our procedure. Any set of parameters other than those specified in the protocol should be experimentally validated in pilot studies before proceeding to employ them in larger investigations.

Modifications and troubleshooting

Previous research has found that the amount of ethanol that rats consume in the home cage can vary as a function of the supplier from which rats are purchased17,27. Supplier is therefore an important consideration for this phase of the study. Similarly, the choice of rat strain should be considered carefully, as there are numerous reports of strain differences in ethanol consumption28-31.

Prior work in an aversive conditioning paradigm has shown that the developmental age of rats influences the observation of renewal of a Pavlovian conditioned fear response32. The lack of a renewal effect in very young rats (younger than postnatal day 20) has been suggested to be due to impaired encoding of contextual information33. The developmental age of rats to be used in the present procedure should therefore be taken into consideration.

Renewal of Pavlovian conditioned alcohol-seeking behavior has been observed when 10%9,16, 15%14, or 20%15 ethanol solutions were used during the home cage ethanol access and PDT phases of the experiment. Researchers could use any of these concentrations of ethanol for the purposes of establishing this procedure in their laboratories.

During the acquisition of Pavlovian discrimination training it is important to check fluid ports after each session to ensure that all the ethanol that was delivered has been consumed. Leaving rats in the conditioning chambers for an additional 10 – 15 min after each session may be done early in PDT to encourage consumption of any ethanol that was not consumed during the session. The number of rats leaving unconsumed ethanol in the ports should decrease as PDT progresses. If by the end of PDT rats are either (a) not consuming all the ethanol and/or (b) not responding to the CS+ then these subjects should be dropped from the study. Most rats reliably respond more to the CS+ than the CS-. However, some rats may respond at high levels to both cues, thereby not showing evidence of discrimination. Rats that show high responding to both the CS+ and CS- during PDT are not dropped from the study. In our experience, these subjects show remarkable discrimination during the first extinction session in the absence of ethanol, suggesting that their high levels of responding to the CS- during PDT are driven by the presence of ethanol in the fluid port. These subjects also tend to show robust renewal effects.

Limitations of the procedure

Because the renewal test is conducted in the absence of ethanol, conditioned port entries elicited by the CS+ gradually diminish across the test session. Therefore, the overall amount of behavior generated at test, against which experimentally induced changes can be assessed, is fairly low. Because in this task responding tends to be higher at the start versus the end of the test session, it is important to examine the effects of experimental manipulations on conditioned responding on a trial-by-trial basis.

Entries into the fluid receptacle provide the main dependent measure in this task. However, an erroneous port entry might be registered if an animal is close enough to the fluid receptacle to break the infrared beam across the opening of the fluid port with its whiskers. While infrequent, erroneous responses are obvious as a dramatic increase in total port entries relative to the subject’s behavior on prior sessions. Videotaping the animals would facilitate the detection of possible erroneous responses, and allow for a more refined analysis of the behaviors exhibited by the rats throughout training and testing.

Significance of technique with respect to existing/alternative methods

Context-induced renewal of drug-seeking behavior is largely studied using an instrumental conditioning task in which the primary dependent variable is an operant response, such as a lever press8,34 or nose poke12. In the present procedure, the drug-seeking response is ‘conditioned approach’ to the fluid port that is elicited by presentations of the CS+. This response is likely acquired through Pavlovian learning, which is the learning process that mediates the formation of associations between environmental stimuli and the pharmacological effects of drugs of abuse in humans.

Future applications

This task can be used in combination with neuropharmacology, optogenetics and neurochemistry to study the neural mechanisms that are involved in context-induced renewal of Pavlovian-conditioned alcohol-seeking behavior16. In addition, behavioral and neural mechanisms that regulate the acquisition and extinction of Pavlovian-conditioned alcohol-seeking behavior can be investigated. Lastly, this task can be used to explore manipulations of extinction that might prevent renewal, an important direction for translational research aimed at reducing the impact of drug associated environmental contexts on reactivity to drug predictive cues after cue exposure therapy in human addicts.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (RO1 AA014925 awarded to Dr. Patricia H. Janak at University of California, San Francisco, CA, USA), Fonds de recherche du Quebec – Santé (NC) and the Natural Sciences and Engineering Research Council (NC, 387224-2010). The open-access publication of this article was made possible by sponsorship from Med Associates Inc.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Heavy-duty utility cart Rubbermaid #4520-88 Used to transport rats in their home cage from the colony room to the behavior room or other facilities
Rats, Long-Evans Harlan – Rats weighed 220-240g on arrival
Ohaus scale Fisher #S402421 For weighing rats; tare the bottom of a plastic container first, then put the rat in it to weigh it
Beta-chips, aspen Harlan #7090A Bedding for home cage
Nylabone Bio-Serv #K3580 Enrichment provided in the home cage
Autoclavable rodent chow Agribrands, Charles River #5075 For feeding rats
Wire bar cage lid Ancare #R20SS2B Custom made with two slots for  bottles
Cage bottom Ancare #R20PC To house rats
Stoppers Ancare #8.5 Rubber stoppers to occlude opening in water bottles & graduated cylinders; goes with ball point sipper tubes 
Ball point tubes, 1.5" length Ancare #TD-99 Inserted in stoppers, enables rats to drink from water bottles and graduated cylinders
Water bottles Ancare #FSPC8HT 473 ml (16 oz) capacity, needs to be occluded with stopper
Graduated cylinders, 100ml Fisher #0300741 To contain ethanol during alcohol exposure in the home cage; spouted end needs to be cut off to enable occlusion with stoppers
Mettler scale Mettler Toledo #MS6001S For weighing water bottles and ethanol cylinders
Polyethylene tubing, 1/32" inner diameter,  1/32" wall thickness, 3/32" outside diameter Fisher #14-169-1A To connect 20 ml ethanol syringe to fluid port
Needle, 18g, 1.5" length Fisher #B305199 To connect polyethylene tubing to ethanol syringes; needs to be filed
Syringes, 20ml, Luer-Lok non-sterile Fisher #1482316J To contain ethanol on the fluid pumps; needs to be connected to the polyethylene tubing by a 18g 1 1/2 needle
Syringes, 60ml, Luer-Lok non-sterile Fisher #14-820-11 To flush polyethylene tubing after PDT sessions
Single speed syringe pump, 3.33 rpm Med Associates Inc. #ENV-018MD To hold 20 ml ethanol syringes and deliver ethanol
Fluid port Med Associates Inc. #ENV-254-CB To enable ethanol delivery during PDT sessions; connected to ethanol syringes with polyethylene tubing
Port entry infrared detector Med Associates Inc. #ENV-215M Fixed on both sides of  fluid port; need 2 per fluid port
Houselight, 28V, 100mA Med Associates Inc. #ENV-135M Provides general lighting in conditioning chamber
Clicker module Med Associates Inc. #ENV-225SM Auditory stimulus for conditioning chamber
White noise generator with speaker Med Associates Inc. #PHM-100 Auditory stimulus for conditioning chamber
Bar floor Med Associates Inc. #ENV-009A-GF To go with modular test chamber
Bench coat, absorbant VWR #89126-790 Absorbant paper to put in metal tray, needs to be cut to fit the metal tray
Polycarbonate sheet, 1/8" thick, 12-5/8"x10" Johnston Plastics #30102515 To make smooth transparent floor insert used for context 1. Needs to be cut in 11.5"x12.25" pieces
Aluminium sheet perforated, 0.063"thick, 48"x96", 0.250" holes x 0.375" centers Anica Steel – To make perforated floor insert used for context 2. Needs to be cut in 11.5"x12.25" pieces
Black cardboard, 0.053" thick, 28"x44" Omer DeSerres #P1909 To construct panels covering the ceiling, door and back wall of the conditioning chamber in context 1. Needs to be cut to size. Each chamber needs three panels measuring approximately 11.5"x13.25". The panels can be joined by the narrower side using duct tape.
All-purpose strength duct tape, 1.88"x45yd. Duck Tape – Adhesive material to connect the black cardboard panels used to cover the back wall, ceiling and door in context 1.
Modular test chamber Med Associates Inc. #ENV-009A Conditioning chamber
Sound attenuating cubicles Med Associates Inc. #ENV-200R3AM Comes with installed 28V DC fan (#ENV-025F)
Petri dish Fisher #08748B Bottom only, to contain the sprayed solution that provides the odor stimulus; needs to be centered in the metal tray in conditioning chambers
PCI interface package Med Associates Inc. #DIG-700P2-R2 Connects tabletop interface cabinet to computer; includes 1 interface card, 1 Decode card, 1 ribbon cable and 1 28V DC power cable
Large tabletop cabinet and power supply Med Associates Inc. #SG-6510D Used to contain the 12 cards included in the SmartCrtrl 8 Input, 16 Output package
SmartCtrl 8 Input, 16 Output package Med Associates Inc. #DIG-716P2 Used to connect and control the devices in the conditioning chamber. The package includes all the cables, the interface module and the connection panel.
Med PC IV software Med Associates Inc. #SOF-735 Software to run programs. Needs to be installed on the computer.
Monitor LG, 19" LCD Concordia computer store #W1942TQ-BF Computer monitor; to go with computer running Med PC IV
HP Z200 tower workstation Concordia computer store #BZ788US#ABA Computer on which Med PC IV is run
Benzaldehyde, ≥99% Les produits chimiques OMEGA Chemical Company Inc. #B37-50 Dilute in tap water for almond context odor
Lemon oil, cold pressed, California Sigma Aldrich #W262528-1KG-K Dilute in tap water for lemon context odor
Ethyl alcohol, 95% Commercial Alcohols – Dilute in tap water to desired concentration
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References

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Context-induced RenewalPavlovian-conditioned Alcohol-seekingAlcohol RelapseEnvironmental ContextFluid Port EntriesAuditory Conditioned StimuliExtinction TrainingLong-Evans Rats

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Maddux, J., Lacroix, F., Chaudhri, N. A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats. J. Vis. Exp. (91), e51898, doi:10.3791/51898 (2014).
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