Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese

Eritropoiese é o processo de diferenciação de células-tronco hematopoiéticas multipotentes para amadurecer eritrócitos. Este processo gradual inclui a formação de unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES), os que se dividem rapidamente unidades formadoras de colônias eritróides (UFC-ES), e morfologicamente eritroblastos reconhecíveis ^1,2. Eritropoiese Terminal a partir de células progenitoras CFU-E envolve sequencial estágios independentes ^{2,3-dependente} e eritropoietina. Na fase inicial da eritropoiese terminal, eritropoietina (Epo) se liga ao seu receptor na superfície da célula e induz uma série de vias de sinalização a jusante que previnem a apoptose celular e promovem a divisão celular rápida e de ^1,4 a expressão do gene. No final da fase de eritropoiese terminal, eritroblastos submeter saída do terminal ciclo celular, condensação de cromatina e núcleo, e extrusão dos núcleos altamente condensadas ^5.

Nossa compreensão do terminal deeritropoiese tem melhorado muito nas últimas décadas, que é em grande parte devido ao sucesso do uso de vários in vitro e in vivo de mouse ^6-9. Entre estes modelos, a cultura in vitro de rato fetal eritroblastos fígado proporciona muitas vantagens, incluindo a facilidade de purificação de células, proliferação e diferenciação rápida, e um mímico mais perto da eritropoiese humano ^10,11. Neste sistema, um grande número de células progenitoras eritróides a partir de fígados de rato fetais pode ser facilmente isolado por purificação a única etapa de Ter119 (um marcador para as células eritróides maduras) eritroblastos negativos. Durante a cultura de dois dias dos eritroblastos, a diferenciação destas células podem ser monitorizados por uma análise de citometria de fluxo com base na expressão de superfície do receptor de transferrina (CD71) e o antigénio Ter119 ^12. Além disso, a enucleação dos eritroblastos de diferenciação terminal pode ser detectada por uma máquina de ADN (Hoechst 33342) ¹3. Além disso, as células progenitoras purificadas, pode ser geneticamente modificada por expressão de ADNc exógeno ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse, o que facilita os estudos mecanicistas das funções de expressão do gene na eritropoiese ^11,13,14.

Por outro lado, a rápida taxa de crescimento celular podem ser uma espada de dois gumes, uma vez que é difícil de caracterizar as funções de genes em diferentes fases da eritropoiese terminal. Na maioria dos casos, é difícil determinar se a funções de genes específicos na fase precoce da eritropoiese terminal de desde pelo tempo que o ADNc ou shRNAs expressa, as células já passou da fase precoce. Para resolver este problema, foi desenvolvido um sistema único para dissecar os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Para a fase inicial da eritropoiese terminal, geneticamente modificados Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio livre de Epo, mas que contém o factor de células estaminais (SCF), IL-6 e FLT3ligante para manter seu status progenitor e permitir que os cDNAs transduzidas ou shRNA a expressão ^13. As células foram mudadas para meio contendo EPO depois de 12 horas para induzir a proliferação e diferenciação celular. Desta forma, quando as células se diferenciaram, os cDNAs foram transduzidas ou shRNAs já expressa. Para o estágio tardio da eritropoiese terminal, Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio contendo EPO, imediatamente após a transdução. Portanto, pode-se analisar as funções dos genes de interesse na fase tardia da eritropoiese terminal. Em resumo, uma ampla aplicação deste sistema ajudaria funções dos genes dissecar em diferentes estágios de eritropoiese terminal.