Summary

עכבר עוברי כבד מערכת התרבות לנתח פונקציות היעד ג'ין בשלבים המוקדמים ומאוחרים של המסוף erythropoiesis

Published: September 09, 2014
doi:

Summary

אנו מציגים מערכת במבחנה עכבר עוברית erythroblast כבד תרבות שמנתחת את השלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. מערכת זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של גנים מסוימים בשלבי התפתחות שונים.

Abstract

Erythropoiesis כרוך בתהליך דינמי שמתחיל ביחידות פרץ erythroid מחויב להרכיב (BFU-Es) ואחריו המתחלק במהירות המושבה erythroid להרכיב יחידות (CFU-Es). לאחר CFU-Es, תאי מורפולוגית לזיהוי ובדרך כלל מכונה erythroblasts מסוף. אחד האתגרים לחקר erythropoiesis המסוף הוא חוסר גישות ניסיוניות לנתח פונקציות גן באופן כרונולוגי. בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה ייחודית כדי לקבוע פונקציות גן בשלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. במערכת זו, TER119 העכבר העוברי כבד (סמן תא erythroid הבוגר) erythroblasts השלילי היו מטוהר וtransduced עם ביטוי אקסוגני של cDNAs או RNA קטן סיכת הראש (shRNAs) לגנים של עניין. התאים היו בתרבית לאחר מכן בגורמי גדילה בינוניות המכיל מלבד אריתרופויאטין (EPO) כדי לשמור על הבמה אביהם עבור שעות 12 תוך מתן האפשרות לcDNAs אקסוגניים או shRNAsלהביע. התאים שונו עד בינוני Epo לאחר שעה 12 לגרום התמיינות תאים והתרבות ואילו החומרים גנטיים אקסוגני כבר הביעו. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של פונקציות גן בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף. ללמוד erythropoiesis מסוף שלב מאוחר, תאים היו בתרבית באופן מיידי במדיום Epo לאחר התמרה. בדרך זו, התאים היו כבר הבדילו לשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף כאשר החומרים גנטיים transduced באו לידי ביטוי. אנו ממליצים יישום כללי של אסטרטגיה זו, שיסייע להבין את פונקציות גן מפורטות בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף.

Introduction

Erythropoiesis הוא התהליך של התמיינות של תאי גזע hematopoietic multipotent להבשיל אריתרוציטים. תהליך הדרגתי זה כולל הקמת יחידות פרץ erythroid מחויב להרכיב (BFU-Es), היחידות המתחלקות במהירות erythroid המושבה להרכיב (CFU-Es), ומורפולוגית erythroblasts זיהוי 1,2. erythropoiesis מסוף מתאי אב CFU-E כרוך אריתרופויאטין תלוי רציף ושלבים עצמאיים 2,3. בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף, אריתרופואטין (EPO) נקשר לקולטן שלו על פני התא וגורם לסדרה של מסלולי איתות במורד הזרם המונעים אפופטוזיס תא ולקדם חלוקות תא מהירות וביטוי גני 1,4. בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף, erythroblasts לעבור יציאת תא מסוף מחזור, הכרומטין ועיבוי גרעין, ושחול של הגרעינים מרוכזים מאוד 5.

ההבנה של מסוף שלנוerythropoiesis השתפר מאוד בעשורים האחרונים, שהוא במידה רבה עקב השימוש המוצלח של כמה במבחנה ובמודלים של עכברי vivo 6-9. בין הדגמים הללו, בתרבות במבחנה של erythroblasts כבד עכבר עוברי מספק יתרונות רבים, כולל את הקלות של טיהור תא, התפשטות מהירה ובידול, וקרוב יותר לחקות לerythropoiesis אדם 10,11. במערכת זו, מספר גדול של תאי אב erythroid מכבדים עובריים של עכבר יכול להיות מבודד בקלות על ידי הטיהור היחידה צעד של TER119 (סמן לתאי erythroid הבוגרים) erythroblasts השלילי. במהלך התרבות בת היומיים של erythroblasts, ההתמיינות של תאים אלה יכול להיות במעקב על ידי ניתוח התזרים cytometric מבוסס על ביטוי פני השטח של קולט transferrin (CD71) ואנטיגן TER119 12. בנוסף, אנוקלאציה של erythroblasts בידול סופני יכולה להיות מזוהה על ידי יצרנית DNA (Hoechst 33342) 13. יתר על כן, האבות המטוהרים ניתן מהונדסים גנטי על ידי ביטוי אקסוגני של cDNAs או RNA קטן סיכת הראש (shRNAs) לגנים של עניין, המאפשר מחקרים מכניסטית של הפונקציות של ביטוי גנים בerythropoiesis 11,13,14.

מצד השני, שיעור צמיחת תאים המהיר יכול להיות חרב פיפיות, שכן קשה לאפיין פונקציות גן בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף. ברוב המקרים, קשה לקבוע אם פונקציות גן ספציפיות בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף מאז על ידי הזמן cDNAs או shRNAs הביע, התאים כבר עברו את השלב המוקדם. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו מערכת ייחודית לנתח המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. עבור השלב המוקדם של erythropoiesis מסוף, TER119 erythroblasts השלילי המהונדס גנטי היה בתרבית במדיום Epo נטול אבל מכיל תאי גזע גורם (SCF), IL-6 וFLT3ליגנד כדי לשמור על מעמד אביהם ולאפשר cDNAs transduced או shRNA לביטוי 13. התאים שונו למדיום המכיל Epo לאחר שעה 12 לגרום התפשטות תאים והתמיינות. בדרך זו, כאשר התאים התחילו להבחין, cDNAs transduced או shRNAs כבר הביעו. עבור השלב מאוחר של erythropoiesis מסוף, TER119 erythroblasts השלילי היו בתרבית בEpo המכיל בינוני מייד לאחר התמרה. לכן, ניתן לנתח את הפונקציות של הגנים של עניין בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף. לסיכום, יישום רחב של מערכת זו יעזור פונקציות גן לנתח בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף.

Protocol

הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת נורת'ווסטרן מוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש. .1 הכנת בינוני התרבות הכן פתרון פיברונקטין. הו…

Representative Results

איור 1 מתאר את האסטרטגיות הניסיוניות. הפרוטוקול מורכב משני תנאים עצמאיים למיקוד הפונקציות של מולקולות איתות בשלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. TER119 erythroblasts כבד העובר השלילי היו מטוהר מן עובר עכבר E13.5. ניתוח תזרים cytometric של תאי erythroid כבד העובר לפנ?…

Discussion

כאן אנו מציגים מערכת ייחודית לניתוח erythropoiesis מסוף כבד העובר עכבר כרונולוגי. באמצעות היישום של תנאי תרבות שונים, נתחנו בהצלחה erythropoiesis מסוף בתחילת וסוף השלבים. הדבר חשוב במיוחד על מנת לקבוע את המנגנונים של גנים עם פונקציות מרובות. לדוגמא, GTPases Rac לשחק תפקידים חשובים בשלב…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי NIH R00HL102154, ואגודה אמריקנית של הפרס חוקר המטולוגיה לP ג'י.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) Gibco 12440-053
Fetal bovine serum (FBS) GEMINI Bio-product 700-102P
b-mecaptoethanol Sigma M6250 0.1 M in IMDM,  4℃stock
Penicillin-Streptomycin solution Hyclone SV30010 100 X
L-Glutamine Hyclone SH30034.01 200 mM
Stem cell factor (SCF) STEMCELL TECH 2630 100 ng/ul, -20℃ stock
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) BD Biosciences  14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)  GEMINI Bio-product 300-327P
fibronectin BD Biosciences  354008
Bovine Serum Albumin (BSA) STEMCELL TECH 9300 10% stock in IMDM
Insulin solution, human Sigma I9278 4℃ stock
holo-transferrin human Sigma T0665 50 mg/ml in Water -20℃ stock
Erythropoietin(Epo) PROCRIT NOC 59676-303-00 3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus BD Pharmingen 557812
EasySep Magnet STEMCELL TECH 18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml FALCON 352063

References

  1. Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
  2. Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
  3. Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
  4. Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
  5. Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
  6. Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
  7. Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
  8. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
  9. Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
  10. Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
  11. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  12. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  13. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
  14. Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
  15. Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
  16. Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
  17. Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. New insights into erythropoiesis. Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).

Play Video

Cite This Article
Zhao, B., Mei, Y., Yang, J., Ji, P. Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis. J. Vis. Exp. (91), e51894, doi:10.3791/51894 (2014).

View Video