אנו מציגים מערכת במבחנה עכבר עוברית erythroblast כבד תרבות שמנתחת את השלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. מערכת זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של גנים מסוימים בשלבי התפתחות שונים.
Erythropoiesis כרוך בתהליך דינמי שמתחיל ביחידות פרץ erythroid מחויב להרכיב (BFU-Es) ואחריו המתחלק במהירות המושבה erythroid להרכיב יחידות (CFU-Es). לאחר CFU-Es, תאי מורפולוגית לזיהוי ובדרך כלל מכונה erythroblasts מסוף. אחד האתגרים לחקר erythropoiesis המסוף הוא חוסר גישות ניסיוניות לנתח פונקציות גן באופן כרונולוגי. בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה ייחודית כדי לקבוע פונקציות גן בשלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. במערכת זו, TER119 העכבר העוברי כבד (סמן תא erythroid הבוגר) erythroblasts השלילי היו מטוהר וtransduced עם ביטוי אקסוגני של cDNAs או RNA קטן סיכת הראש (shRNAs) לגנים של עניין. התאים היו בתרבית לאחר מכן בגורמי גדילה בינוניות המכיל מלבד אריתרופויאטין (EPO) כדי לשמור על הבמה אביהם עבור שעות 12 תוך מתן האפשרות לcDNAs אקסוגניים או shRNAsלהביע. התאים שונו עד בינוני Epo לאחר שעה 12 לגרום התמיינות תאים והתרבות ואילו החומרים גנטיים אקסוגני כבר הביעו. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של פונקציות גן בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף. ללמוד erythropoiesis מסוף שלב מאוחר, תאים היו בתרבית באופן מיידי במדיום Epo לאחר התמרה. בדרך זו, התאים היו כבר הבדילו לשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף כאשר החומרים גנטיים transduced באו לידי ביטוי. אנו ממליצים יישום כללי של אסטרטגיה זו, שיסייע להבין את פונקציות גן מפורטות בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף.
Erythropoiesis הוא התהליך של התמיינות של תאי גזע hematopoietic multipotent להבשיל אריתרוציטים. תהליך הדרגתי זה כולל הקמת יחידות פרץ erythroid מחויב להרכיב (BFU-Es), היחידות המתחלקות במהירות erythroid המושבה להרכיב (CFU-Es), ומורפולוגית erythroblasts זיהוי 1,2. erythropoiesis מסוף מתאי אב CFU-E כרוך אריתרופויאטין תלוי רציף ושלבים עצמאיים 2,3. בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף, אריתרופואטין (EPO) נקשר לקולטן שלו על פני התא וגורם לסדרה של מסלולי איתות במורד הזרם המונעים אפופטוזיס תא ולקדם חלוקות תא מהירות וביטוי גני 1,4. בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף, erythroblasts לעבור יציאת תא מסוף מחזור, הכרומטין ועיבוי גרעין, ושחול של הגרעינים מרוכזים מאוד 5.
ההבנה של מסוף שלנוerythropoiesis השתפר מאוד בעשורים האחרונים, שהוא במידה רבה עקב השימוש המוצלח של כמה במבחנה ובמודלים של עכברי vivo 6-9. בין הדגמים הללו, בתרבות במבחנה של erythroblasts כבד עכבר עוברי מספק יתרונות רבים, כולל את הקלות של טיהור תא, התפשטות מהירה ובידול, וקרוב יותר לחקות לerythropoiesis אדם 10,11. במערכת זו, מספר גדול של תאי אב erythroid מכבדים עובריים של עכבר יכול להיות מבודד בקלות על ידי הטיהור היחידה צעד של TER119 (סמן לתאי erythroid הבוגרים) erythroblasts השלילי. במהלך התרבות בת היומיים של erythroblasts, ההתמיינות של תאים אלה יכול להיות במעקב על ידי ניתוח התזרים cytometric מבוסס על ביטוי פני השטח של קולט transferrin (CD71) ואנטיגן TER119 12. בנוסף, אנוקלאציה של erythroblasts בידול סופני יכולה להיות מזוהה על ידי יצרנית DNA (Hoechst 33342) 13. יתר על כן, האבות המטוהרים ניתן מהונדסים גנטי על ידי ביטוי אקסוגני של cDNAs או RNA קטן סיכת הראש (shRNAs) לגנים של עניין, המאפשר מחקרים מכניסטית של הפונקציות של ביטוי גנים בerythropoiesis 11,13,14.
מצד השני, שיעור צמיחת תאים המהיר יכול להיות חרב פיפיות, שכן קשה לאפיין פונקציות גן בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף. ברוב המקרים, קשה לקבוע אם פונקציות גן ספציפיות בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף מאז על ידי הזמן cDNAs או shRNAs הביע, התאים כבר עברו את השלב המוקדם. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו מערכת ייחודית לנתח המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. עבור השלב המוקדם של erythropoiesis מסוף, TER119 erythroblasts השלילי המהונדס גנטי היה בתרבית במדיום Epo נטול אבל מכיל תאי גזע גורם (SCF), IL-6 וFLT3ליגנד כדי לשמור על מעמד אביהם ולאפשר cDNAs transduced או shRNA לביטוי 13. התאים שונו למדיום המכיל Epo לאחר שעה 12 לגרום התפשטות תאים והתמיינות. בדרך זו, כאשר התאים התחילו להבחין, cDNAs transduced או shRNAs כבר הביעו. עבור השלב מאוחר של erythropoiesis מסוף, TER119 erythroblasts השלילי היו בתרבית בEpo המכיל בינוני מייד לאחר התמרה. לכן, ניתן לנתח את הפונקציות של הגנים של עניין בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף. לסיכום, יישום רחב של מערכת זו יעזור פונקציות גן לנתח בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף.
כאן אנו מציגים מערכת ייחודית לניתוח erythropoiesis מסוף כבד העובר עכבר כרונולוגי. באמצעות היישום של תנאי תרבות שונים, נתחנו בהצלחה erythropoiesis מסוף בתחילת וסוף השלבים. הדבר חשוב במיוחד על מנת לקבוע את המנגנונים של גנים עם פונקציות מרובות. לדוגמא, GTPases Rac לשחק תפקידים חשובים בשלב…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי NIH R00HL102154, ואגודה אמריקנית של הפרס חוקר המטולוגיה לP ג'י.
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
b-mecaptoethanol | Sigma | M6250 | 0.1 M in IMDM, 4℃stock |
Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100 X |
L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
Stem cell factor (SCF) | STEMCELL TECH | 2630 | 100 ng/ul, -20℃ stock |
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
Insulin solution, human | Sigma | I9278 | 4℃ stock |
holo-transferrin human | Sigma | T0665 | 50 mg/ml in Water -20℃ stock |
Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |