工作流的高含量，荧光标记的万能工具显微镜数据，支持开源软件的单个细胞定量

所产生的示例图像组使用反向转染的siRNA筛选方案已准备和使用Cell Profiler软件进行分析。所得数值的原始数据是这样的，每一个细胞都单独表示的，可追溯回其图像和良好的原点，测定几个荧光强度参数（ 图6A）。对于确定的平均核荧光强度为P S780 RB1抗体和整合的DNA的强度为DNA染料定义核掩模每个单元被确定。 GFP平均强度值的每个细胞的细胞核和细胞质的区域也被记录下来，允许核的计算相对于GFP-CDK2记者细胞质荧光。下游的这些算法荧光强度测量使用了这些单个单元数据的以限定栅极两个测定中，核抗体染色和GFP-CDK2记者。细胞在th随后注释的测定结果，并使用这些标签，以使特定亚群ë依据待进一步的特征在于描述了第三个测量值（核DNA含量）。 直方图收集对每个试验中的原始荧光强度数据是评估细胞亚群的行为不同的条件下的一种有效方式。在图6B的直方图示出了从一式三份孔的每个RNAi敲低条件个别单元数据的人口分布。向左是用于核抗体强度和右边的数据被用于GFP-CDK2记者相应的数据。为P-S780 RB1抗体数据表明，细胞广泛存在于两个种群对本翻译后修饰和细胞群与RB1磷酸对S780的损失，可以区分作为细胞核强度的一个左手峰被富集当CDK6是的siRNA撞倒。同样的左手峰值当RB1本身是RNAi靶，反映了完全除去蛋白质，从而P-S780 RB1染色可见。与此相反，在相同的实验条件下对相同的细胞中，当通过将GFP-CDK2报告基因分析观察到的，显示出不同的动态中的各个单元中的数据。连续分布观察，只用单一的峰，但siRNA的扰乱细胞周期（siCDK6），使在该分布的右手肩部的延伸积累在G1期的结果（ 即指示增强细胞表示存在增加在核/细胞质的GFP比，绘制在X轴）。 也示于图6B的直方图栅值（竖线）所选择的这两组实验数据的分布的基础上。用于P-S780 RB1抗体数据的规则是确定门位置为半高：在主的左肩最大宽度位置（右）峰值考虑阴性对照细胞的数据时（非靶向siRNA）。数据突出显示红色的细胞减少和缺乏P-S780 RB1，这是认同这个门。类似的门定位在所述比率值分布的相对肩部用于GFP-CDK2记者。将所得的高比率亚群的细胞，缺乏或功能降低CDK2活性，示于绿色。为了说明这两个实验的多路分析图6C显示了使用2_gate_classifier.pl perl脚本的原始数据（ 图6A）转换成下面的批注文件既门价值的实现。这个新文件包括原始数据一起类标签的每个小区的新的列和用于区分它们两个闸值（0.004对抗体的数据和1.5的GFP-CDK2记者此时门分别使用） 。 经分类的各个细胞˚FROM中的两种测定现在有可能使用这些类的标签，以协助重复测定数据的注释的基础上，各敲低的条件。 图7示出散点图各个单元数据为P S780 RB1和GFP-的CDK2测定从例如数据对所有三个RNAi的条件设定。号码标注的散点图象限显示每个门控亚群的相对百分比，以整个为该击倒上下文和使用上述类标签R中产生。这些图表明，相对于转染的细胞与非靶向siRNA（ 图7B），转染的细胞siCDK6揭示的净数据配给移都向下的Y轴（表示无RB1的磷酸化在丝氨酸780），并在正确的在X轴（表示低CDK2活性， 图7C）。这两个变化，预计这一目标击倒。与此相反，在从SIR数据B1转染的细胞（ 图7A）显示抗体染色的符合表位的损失的损失，但影响不大在用于CDK2的记者的数据分布相比转染非靶向siRNA，暗示对GFP的没有很大的影响控制-CDK2记者源于RB1击倒。 为了进一步探索利用单个单元格数据，亚群分类和分析复用图8所示的散点图从综合DNA强度图7C一起配对直方图型材siCDK6数据。直方图的对涉及到的整个人口的相对的半部，分为两种抗体强度（散点图右）或GFP-CDK2记者比值（散点图以上）的基础上。核DNA强度为这些人群的定量展示了两个高峰的特点2N和4N DNA含量的左，右峰值，分别为。在我在图中所示的闸门的ntentions 6，7和8是这样的细胞识别为低用于P-S780 RB1（标记：P-S780-）或与来自GFP-CDK2记者高比率值（标记为：G1）会是在细胞周期的G1期。事实上，确定与任一这些测定的DNA图谱直方图亚群主要含有细胞，用2N DNA含量。在相反门人口DNA图谱（标记：P-S780 +或非G1）含有细胞的分布范围从2N至4N，符合这些细胞通过一系列的细胞周期的位置后G1期。 尽管这里的重点是产生和从荧光染色图像个别单元数据的分析，它也是有用的能够采取这些数据和良好的由阱基础总结每个测定以监测重复和性能之间的变异所有的井跨越数据整盘给定的实验中。 <stron克>图9示出了从各siRNA处理归纳为平均值从一式三份孔的栅极内的百分比的细胞施加到A中的数据）在P-S780 RB1数据和B）中的GFP-CDK2记者数据。绘制在A和 B的值是由设有该手稿两个附加的Perl脚本生成; 'antibody_fluorescence_summary.pl'和'G1assay_summary.pl'上。这些脚本使用每孔用细胞探查（Nuclei.csv）创建的原始数据和报表数据为我）每个测量细胞总数以及，ii）本门内细胞的数量，iii）本门内％的细胞和IV）的算术指的是衡量，原始数据的井。如图此包括作为，着眼于个体治疗数据使用单独的单元数据的多路复用评估之前适于寻找跨越大套测定数据的选项<stro纳克>图7和8。图表此处为两个实验，其适合看出对于在图6B中的直方图为P-S780 RB1和GFP-CDK2数据的非正常的数据分布“栅内ⅲ）百分细胞的显示图。这些脚本还计算“ⅳ）测得的，原始数据为该井的算术平均值”，这将适合于同质种群的反应和前和实验后扰动正常数据分布的数据进行分析。 图1：在工作流来定量分析荧光标记的显微镜图像数据的步骤概述工作流在这里表示为4步骤（A）首先，有必要通过实验制备的细胞用于荧光成像。这里所描述的例子是，一个屏，其中siRNA治疗粘附人肿瘤细胞生长48小时，固定和染色在96孔组织培养板。不同的RNA干扰条件都存在一式三份，在板块内部不同孔。细胞染色用DNA染料，具体为RB1磷酸对CDK4和6选择性靶位丝氨酸-780（P-S780 RB1）的抗体，它们也稳定表达GFP-CDK2-记者，报告的G1细胞周期出口。统称这些荧光探针构成两个测定中的工作流中分别评估。（B）的生成，并命名为包括信息通过该图像分析软件可以组织数据并行显微镜图像为每个荧光探针（信道）。（C）中图像文件被加载到细胞Profiler软件，这在算法识别单个细胞和细胞核的相关对和细胞质屈服强度测量的三个荧光探针检测之前编辑只。（D）最后，Perl脚本用于组织生产的原料定量数据。此步骤适用大门的荧光强度数据，每一个细胞，有效分档细胞亚群成，可绘制，跟踪和盘问。 请点击此处查看该图的放大版本。 图2：实验数据可以通过图像分析从实施例的数据集进行成像和相应的强度测量每个细胞的采取得到的固定的，siRNA治疗，荧光标记的细胞。代表图像数据示出用于在图像分析记录的各参数（A）的核DNA的强度：核DNA染料的染色强度是用来收率每细胞核的DNA的量度（B）的磷酸化RB1核强度：免疫染色使用主（黑色）抗体和荧光标记的第二抗体（红色）使RB1磷酸化的强度测量在特定的用于P-S780 RB1 。S780每核（C）的 GFP-CDK2记者：使用稳定表达GFP标记报道蛋白，在与细胞周期的一组模式的细胞核和细胞质之间易位的细胞。成对的核和细胞质的GFP强度对每个小区的双重测量允许每细胞的比例，可以用来区分G1期从细胞周期的其余部分的计算。 3个siRNA目标将被用来说明数据;一个非靶向阴性对照siRNA; CDK6的siRNA作为阳性对照在扰动RB1磷酸化和细胞周期进展; RB1的siRNA建立抗体的特异性。K“>点击此处查看该图的放大版本。 图3：组织图像文件之前的图像分析从组织培养板拍摄的图像会以允许图像分析软件对图像数据涉及回原始实验上下文系统命名。该信息被放置在文件名 ​​的每个图像内：（A）由于各孔上的实验片可以对应于不同的RNAi目标或治疗，文件名 ​​的井地址形式的一部分。（B）中的帧号是文件名 ​​的一部分。由于每个孔成像收集多个不重叠的帧（C）的各帧的荧光探针分别成像;因此文件名也需要以反映通道的每个图像涉及到。 <stron克>（D）的实施例的文件名 ​​，与井（G12），帧（2）与每个图像代表频道（蓝 ​​，红，绿）中的一个。虚线连接的文件名 ​​元素为好，框架和通道的相关示意图，分别请点击此处查看该图的放大版本。 图4：使用细胞探查来测量核DNA和抗体染色随着提供管道文件中的设置（3_channels_pipeline.cppipe），核DNA和细胞探查图像分析软件测量荧光强度值抗体结合有关个别细胞（A）核被确定在DNA染色的“蓝色”通道图像。（B）< /强>将DNA染色的核的位置暂时在一个“核掩模'保持。该核掩模然后覆盖到（C）的蓝色和红色通道图像（DNA和抗体的荧光数据，分别地）和荧光值从图像片段，与掩模重叠记录针对每个识别出的小区。成功识别的单独的，相邻的核可以在视觉上评估了核掩模的外观。为了说明，示出盘旋在这个掩模图像，就是例子，其中所选择的设置，所述算法有误确定相邻细胞核作为单个核。调整算法设置，以尽量减少这些事件的讨论部分介绍。 请点击此处查看该图的放大版本。 /ftp_upload/51882/51882fig5highres.jpg“/> 图5：使用细胞探查来测量核和细胞质的GFP强度相对于细胞的细胞周期的位置的细胞核和细胞质之间的GFP标记CDK2记者易位。在同一时间，细胞探查计算每个细胞的DNA和抗体核强度（ 图4），它也计算核到的GFP强度为每个小区的细胞质比率。（A）中的DNA染料的数据为每个图像被用于生成一个核掩模。（B）的细胞探查使用细胞核中与来自GFP-CDK2记者将GFP图像的种子各单元的位置相结合掩模，然后扩展到每个单元的外围，以估计每个单元的整体足迹。这成为一个新的，“细胞掩模'。（C）的细胞核掩模被从细胞掩模中减去，以产生一个甜甜圈状系列细胞质的轮廓，从而成为了“细胞质掩模'。（D）中的细胞核掩模和细胞质掩模被用来由细胞Profiler来测量双核和细胞质的GFP值。这些成对的值，然后利用细胞Profiler来计算比率，这是通知在细胞周期中的每个单元格的位置。 请点击此处查看该图的放大版本。 图6：数据提取-通过对测定值施加栅极加工原料个别单元数据从各个单元数据的抗体染色和GFP-CDK2报告分析生物趋势正在使用门控数据提取。原始数据直方图能识别合适的门值。然后这些强加一个Perl脚本。（一）分析与细胞探查所提供的设置图像文件的最终产品是逗号分隔值（.csv）文件。这些文件Çontain与每个不同的亚细胞片段的单个细胞的数据。文件'Nuclei.csv“包含有关使用核面具的所有选定的测量。这些测量包括核抗体强度，核DNA强度和GFP的比（核/细胞质）。核抗体强度（左）和GFP-CDK2记者比（右）从各个细胞的数据为每个siRNA敲除条件绘制的（B）的直方图。在显示的直方图的显示条为这些实验所需的停机位。上的直方图的彩色数据表示门控亚群。（C）的栅极为在乙所示的两种测定被施加到使用Perl脚本'2_gate_classifier.pl'的原始数据。脚本创建原始细胞探查器输出（Nuclei.csv）文件的修改后的副本，以协助后续的绘图。两个闸值被记录在新文件（在这里颜色突出显示）和一个新的“标签”列被添加。标签纸槽每个小区成基于对每个小区在两个门控测定值四种可能的亚组之一。这些标签用于后续的地块其特点各亚群，以及交叉引用的单元格探查产生的附加 ​​参数的贡献计算。 请点击此处查看该图的放大版本。 图7：散点图对于每种siRNA条件描绘原始数据的单个细胞和栅极位置散点图INDIVI的从对siRNA的条件的所有图像双节数据显示：（A）siRB1;（B）兴农靶向阴性对照;（C）siCDK6。暗算的Y轴是从抗P-S780 RB1核染色荧光值。作图在X轴是从GFP-CDK2记者计算出的相应的比率值。红色和绿色的条表示门，用于在P-S780 RB1栅极和GFP-CDK2记者门的位置，分别两个栅极分割的细胞分为四个亚群，并通过得到的象限的数字是从每个这些细胞的百分比数目。周围对于A轴的注释指示由2_gate_classifier.pl Perl脚本应用到每个单元中的四个可能的标签的元素。这些标签显示在相对 ​​于它们各自的测定栅极和在R-脚本（analysis.r）被用来生成图的图6，图7和<stroNG> 8。 请点击此处查看该图的放大版本。 图8：由两个G1转运测定法定义的细胞亚群符合测定结果表明2N和4N DNA图谱为siCDK6单元中的数据的散点图，从图7C重复。周围的散点图的直方图与人口的子集综合核DNA力度。这些散点图上面涉及到GFP-CDK2记者分析。那些散点图的权利涉及到单独的核磷酸RB1抗体测量。着色栅极线延伸，以显示它们之间的关系的直方图。由该单元数据被选定为这些附加的地块栅极标签也示。细胞RB1损失磷酸丝氨酸780（P-S780-），或者那些具有高GFP-CDK2记者核到细胞质的比例（表明低CDK2活性）主要展示2N般的DNA图谱，而其对面的同行对每个各测定显示2N和4N，细胞的混合，后G1期人口特征的分布。 请点击此处查看该图的放大版本。 图9：摘要地块的门控（A）P-S780 RB1数据和三孔每个siRNA敲除条件（B）GFP-CDK2数据的每一个siRNA的情况汇总数据图门检测值。值是从使用的原始细胞探查器输出（Nuclei.csv）计算Perl脚本，“antibody_fluorescence_summary.pl”（A）或“G1assay_summary.pl”（B）。作图的值施加到每个测定的栅极内的百分比的细胞的手段。横道从一式三份孔中计算的标准误差。未成，同方差T检验P为每击倒条件相比，非靶向siRNA值显示在上面绘制数据，其中P <0.001（**）和P <0.05（*）。 请点击此处查看本一个更大的版本数字。 图S1。设置单元格Profiler软件进行图像分析。细胞探查的（A）截图之前的任何图像分析都已设置。细胞探查（B）截图已经被加载包含在“3_channels_pipeline.cppipe”算法细节后。高在左上角点亮标签表明该屏幕显示的参数进行分析的'LoadImages“阶段。点击下面这个列表中的其他部分将揭示的细节，在分析后续步骤。探查细胞与细节输入文件夹和输出文件夹进入（C）截图。（D）后，细胞探查的屏幕截图的“分析图像“按钮被点击，开始分析。叠加有三个新视窗表示通过从所分析的图像的软件中产生的算法制作面具。这些窗口通过点击“眼”的图标到打开位置来访问的旁边在分析相关步骤，在主细胞Profiler窗口的左上角。这些意见帮助用户验证产生的纸屑色口罩的设置是否同意随行，原来，灰度数据。 耳鼻喉科“> 图S2。使用Perl和RStudio的栅极单个细胞的数据并绘制得到的细胞亚群。（A）右图显示选择了从细胞探查分析接收输出的.csv文件（绿色图标）的文件夹。提供稿件（蓝色图标）的Perl脚本复制到该文件夹。突出的是“2_gate_classifier.pl”的Perl脚本，它一直双击鼠标产生对话框，在左侧面板中。显示的是加载“analysis.R'脚本后，立即就要门从”Nuclei.csv“文件中的单个单元格数据提示，输入相应的答案。（B）截图RStudio的，突出显示的是从A上传数据选通到命令绘图之前（在线路5和6的细节注释软件将需要根据其中选通数据位于所述计算进行调整用于分析R）。（RStudio权证），一旦数据被上传截图。（RStudio呈现出D）截图强调了代码须出示在右下窗口中显示的情节块。代码为每个小区由空行分隔和情节类型分组。 siRNA靶 板以及地址 非定向（NT） E5，F5，G5 视网膜母细胞瘤（RB） E7，F7，G7 细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6） B2，C2，D2的 表1：井地址和在实施例的数据集用对 ​​应的siRNA的条件。