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Behavior

Plataforma levantado-Air-plana con piso: un nuevo método para combinar Comportamiento con Microscopía o Electrofisiología en Awake moviéndose libremente Roedores

Published: June 29, 2014
doi:
10.3791/51869
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1Neuroscience Center,University of Helsinki, 2Neurotar LTD, 3A. I. Virtanen Institute for Molecular Sciences,University of Eastern Finland, 4Laboratory Animal Center,University of Helsinki

Summary

Este método crea un entorno tangible, familiar para el ratón para navegar y explorar durante microscópicas de imágenes o una sola célula de registros electrofisiológicos, los cuales requieren una fijación firme de la cabeza del animal.

Abstract

Es ampliamente reconocido que el uso de la anestesia general puede socavar la relevancia de los datos electrofisiológicos o microscópicas obtenidas del cerebro de un animal vivo. Por otra parte, la larga recuperación de la anestesia limita la frecuencia de los episodios de grabación / de formación de imágenes repetidas en estudios longitudinales. Por lo tanto, se espera que los nuevos métodos que permitan grabaciones estables de ratones comportando no anestesiados para avanzar en el campo de la neurociencia celular y cognitivas. Las soluciones existentes van desde la mera restricción física a los enfoques más sofisticados, tales como cintas de correr lineales y esféricos utilizados en combinación con la realidad virtual generada por ordenador. Aquí, un nuevo método se describe que un ratón de frente fijo puede moverse alrededor de un homecage móviles de aire levantada y explorar su medio ambiente en condiciones sin estrés. Este método permite a los investigadores para llevar a cabo las pruebas de comportamiento (por ejemplo, de aprendizaje, de habituación o una novela de reconocimiento de objetos) al mismo tiempo quede dos fotones de imágenes microscópicas y / o grabaciones de patch-clamp, todo combinado en un solo experimento. Esta-artículo de vídeo describe el uso del dispositivo de fijación cabeza de animal despierto (homecage móvil), demuestra los procedimientos de habituación de los animales, y ejemplifica un número de posibles aplicaciones del método.

Introduction

Un emocionante tendencia reciente en las Neurociencias es desarrollar enfoques experimentales para la molecular y celular de sondeo de las redes neuronales en el cerebro de despierto, comportándose roedores. Estos enfoques son prometedores para arrojar nueva luz sobre los procesos neurofisiológicos que subyacen a la función motora, la integración sensoriomotora, la percepción, el aprendizaje, la memoria, así como la progresión de la lesión, la neurodegeneración y enfermedades genéticas. Además, la grabación desde el cerebro de los animales despiertos es prometedora en el desarrollo de los agentes y de los tratamientos terapéuticos.

Hay una conciencia creciente de que la anestesia, que se ha utilizado comúnmente en experimentos neurofisiológicos, puede afectar a los mecanismos básicos de la función del cerebro, que puede conducir a una interpretación errónea de los resultados experimentales. Por lo tanto, la ketamina anestésica ampliamente utilizada aumenta rápidamente la formación de nuevas espinas dendríticas y mejora la función sináptica 1; otra anesthet comúnmente utilizadoic isoflurano en los niveles de anestesia quirúrgica suprime completamente la actividad cortical espontánea en ratas recién nacidas y bloquea las oscilaciones husillos estallar en animales adultos 2. En la actualidad, sólo un número limitado de enfoques permiten experimentos en ratones no anestesiados por medio de dos fotones de imágenes microscópicas o patch-clamp grabaciones. Estos enfoques se pueden dividir en las preparaciones que se mueve libremente y de la cabeza-fijo.

El atractivo única de una preparación de animales que se mueve libremente es que permite la evaluación de comportamiento natural, incluyendo movimientos de todo el cuerpo durante la navegación. Una forma de imagen dentro del cerebro de un roedor libremente en movimiento es para fijar un microscopio montado en la cabeza en miniatura o fibroscopio 3-5. Sin embargo, los dispositivos miniaturizados tienden a tener un rendimiento óptico limitado en comparación con la microscopía de dos fotones basado en objetivos, y no se puede combinar fácilmente con grabaciones de células enteras patch-clamp 6.

La exisoluciones de picadura para la cabeza de fijación de un roedor despierto se han basado principalmente ya sea por la restricción física o 7,8 en el entrenamiento del animal para exhibir reposacabezas voluntaria 9. Otro enfoque popular es para permitir que las extremidades del animal se mueva colocándolo en, por ejemplo, una cinta de correr esférica 10; este enfoque se combina a menudo con la realidad virtual generada por ordenador. Los experimentos electrofisiológicos sobre la cabeza de ratones fijo han utilizado sobre todo las grabaciones extracelulares y se utiliza para estudiar la regulación central de la función cardiovascular 11, los efectos de la anestesia en la actividad neuronal 12, la respuesta auditiva en el tronco cerebral y el procesamiento de la información 13 14. Las grabaciones / intracelulares pioneros de células enteras en animales despiertos se realizaron en la década de 2000 y se han centrado en la actividad neural relacionada con la percepción y el movimiento 15-20. Por la misma época, se publicaron los primeros estudios de imágenes microscópicas en ratones despiertoscido, donde se utilizó microscopía de dos fotones en la corteza sensorial de ratas refrenados físicamente 7 y en los ratones que se ejecutan en una cinta de correr esférica 21.

Vivo de microscopía y de electrofisiología Estudios posteriores demostraron que en una preparación de fijación de la cabeza se puede combinar con éxito con los paradigmas de comportamiento basados ​​en los movimientos de las extremidades anteriores, el reconocimiento de olores, batiendo, y lamiendo 8,22-25. Los ratones colocados en la cinta esférica pueden ser entrenados para navegar por el entorno visual virtual generado por una computadora 10,26. Grabaciones intracelulares / extracelulares demostraron que, en un animal de cabeza-fijo navegación tales entorno virtual, la activación de células de lugar del hipocampo se puede detectar 27. En un entorno virtual visual, los ratones demuestran normal de ritmo theta relacionada con el movimiento en el potencial de campo local y la precesión theta-fase durante el movimiento activo 27. Recientemente, el activit espacial y temporalpatrones xey de poblaciones neuronales se registraron ópticamente en ratones durante el trabajo tareas de decisión de la memoria en un entorno virtual 28.

A pesar de haber permitido la investigación de vanguardia, el diseño de la rueda de ardilla esférica tiene varias limitaciones inherentes. En primer lugar, se requiere que el animal se mueva en una superficie ilimitada de una pelota de aire elevada rotación, lo que plantea obstáculos tangibles, tales como paredes o barreras. Esta limitación es sólo en parte compensada por la "realidad virtual" generada por ordenador, porque la información visual es posiblemente menos eficaz en ratones y ratas, en comparación con la entrada sensorial táctil (por ejemplo, la barba-toque o lamer), que estas especies dependen naturalmente en. En segundo lugar, la considerable curvatura de la superficie de la bola puede ser incómodo para los ratones de laboratorio que se utilizan para caminar sobre un piso plano en sus jaulas. Por último, el gran diámetro de la bola (por lo menos 200 mm para los ratones y de 300 mm para ratas) hace que el tamaño vertical de la esféricadispositivo de cinta relativamente grande. Esto hace que sea difícil de combinar cinta de correr esférica con la mayoría de las configuraciones de microscopía disponibles comercialmente, y a menudo requiere la construcción de una nueva configuración alrededor de la cinta de correr por medio de marcos de microscopio a medida.

Aquí, un nuevo método se describe que un ratón de frente fijo puede moverse alrededor de un homecage móviles de aire levantado que cuenta con un suelo plano y paredes tangibles, y explorar el entorno físico en condiciones sin estrés. Este artículo demuestra los procedimientos de formación del ratón y fijación de la cabeza, y proporciona ejemplos representativos donde microscopía de dos fotones, imagenología óptica intrínseca y patch-clamp grabaciones se realizan en el cerebro de los ratones comportando despierto.

Protocol

Todos los procedimientos que aquí se presentan se realizaron de acuerdo a la guía local para el cuidado de animales (La Ley finlandesa sobre la Experimentación Animal (62/2006)). La licencia de los animales (ESAVI/2857/04.10.03/2012) se obtuvo de las autoridades locales (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Los ratones adultos (edad de 1-3 meses, peso 20-40 g) fueron mantenidos en jaulas de alojamiento en grupo en las instalaciones de animales certificados de la Universidad de Helsinki y proporcionó alimentos y agua ad libitum. 1. Ventana de implantación craneal Ventana craneal se implanta de acuerdo con los protocolos publicados 29-31 con pequeñas modificaciones, como se describe brevemente a continuación: Esterilizar los instrumentos antes de iniciar la implantación ventana craneal. Mantener condiciones estériles durante la cirugía para minimizar el riesgo de complicaciones postoperatorias. Administrar un analgésico (Ketoprofeno, 2,5 mg / kg) 30 minutos antes de la cirugía y 24 horas después de la cirugía. Unesthetize el ratón utilizando una mezcla de ketamina (80 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) inyectado por vía intraperitoneal. Monitorear regularmente la profundidad de la anestesia por pinzamiento de la pata. Utilice una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del animal en 37,0 ° C. Para reducir la inflamación inducida por la cirugía y el edema cerebral, administrar dexametasona (2 mg / kg) por inyección subcutánea. Aplicar lubricante ocular para proteger los ojos se resequen. Afeitarse la cabeza del ratón y limpiar la zona afeitada. Cortar la piel con unas tijeras quirúrgicas y fórceps largo de la línea de la nuca hasta la frente. Retire el tejido conectivo unido al cráneo. Poco a poco y con cuidado perforar un pequeño pozo en el hueso frontal izquierdo con un taladro quirúrgico de alta velocidad. Atornille un mini tornillo (ver Materiales) en el pozo perforado. Lleve a cabo no más de uno-y-uno-mitad de vueltas completas del tornillo. NOTA: Evite las áreas que se encuentran directamente por encima de los vasos corticales superficiales. La interrupción de estas vesseles puede dar lugar a una hemorragia masiva. Para realizar la craneotomía, perforar una ventana circular (3-3,5 mm de diámetro) en el hueso parietal derecho. Aplicar una gota de la memoria intermedia de la corteza (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2 mM, y 2 mM de MgSO4 en H2O destilada suplementado con penicilina 100 unidades / ml y estreptomicina 100 mg / ml) y retire con cuidado la parte del hueso situado en el interior de la ventana circular. NOTA: Para expresar una proteína fluorescente en una subpoblación específica de células, realizar la inyección intracraneal de adeno-asociadas a virus (AAV) u otros vectores virales en este punto en el procedimiento. Coloque un cubreobjetos ronda (# 1.5 Código de espesor) en la ventana del cráneo. Coloque el cubreobjetos en el cráneo con el pegamento acrílico. Coloque un soporte de metal en la parte superior del cubreobjetos y fijarlo con la mezcla de cemento dental y el pegamento acrílico. NOTA: El procedimiento descrito anteriormente está optimizado para ventanas cranealesutilizado en los experimentos de imagen óptica. Para preparar una ventana craneal "invertida" apto para experimentos electrofisiológicos, utilizar un procedimiento diferente. En primer lugar, pegar el soporte de metal en el cráneo. Perforar una ventana circular en la apertura del titular como se ejemplifica en el video. Alternativamente, hacer una craneotomía más pequeño (menos de 0,5 mm de diámetro) sobre la región de interés para prevenir o minimizar el movimiento del cerebro 32. Actualizar la memoria intermedia cortical o colocar una gota de pegamento de silicona en la ventana del cráneo, y luego cerrarla con un cubreobjetos de cristal redondo. Después de completar la operación, coloque el animal en una jaula calentado con comida de fácil acceso y el agua. Volver al animal a la jaula de alojamiento en grupo sólo después de que se recupere completamente de la anestesia. Vuelva a administrar analgésicos después de detectar cualquier signo de dolor, incluyendo la renuencia a moverse, comer o beber, pérdida de peso, salivación, piloerección o sonidos respiratorios anormales. 2. Animal Manejo Tome el ratón de su jaula y simplemente mantenerlo durante 5-10 min. Mantenga la calma durante la manipulación de los animales, evitar hacer movimientos bruscos y ruidos. Después de su manipulación, devuelva el ratón a su jaula. Repita el procedimiento de manejo de 2 a 3 veces con intervalos desiguales entre los episodios de manipulación, con el fin de hacer que el ratón cómodo con el experimentador. Tome un pequeño trapo suave y envolver al animal 2-3x con intervalos desiguales. Animal debe mantener la calma y acostumbrarse a ser envuelto. Si el ratón está emocionado y nervioso, repita los procedimientos de manipulación y embalaje. 3. Entrenamiento Animal Comience el entrenamiento del animal en el homecage móvil al día siguiente después de la habituación a la manipulación y envasado se ha completado. Graba el animal del diario pesan antes y durante el entrenamiento. NOTA: Si durante el entrenamiento, el animal pierde más del 10% de su peso, debe ser excluido de la texperimenta. Ajuste la posición vertical del brazo de fijación del cabezal del dispositivo homecage móvil con el fin de que coincida con el tamaño del animal entrenado. Conectar la entrada de aire del dispositivo para la salida de aire estándar de laboratorio a presión (típicamente, ya sea un depósito de gas o una bomba de aire que proporciona una presión suficientemente alta y la tasa del flujo de aire, es decir, aproximadamente 5 bar y 300 l / min). Envuelva el animal en un trapo. Inserte el soporte de metal, que se adjunta a la cabeza del animal, en el brazo de fijación de la cabeza y fije firmemente apretando los tornillos. Encienda el flujo de aire y asegúrese de que el flujo de aire es óptimo para libre flotación del homecage aire levantado. Suelte el animal en el homecage móvil quitando el trapo. Para habituar al animal al ruido, proporcionan una constante exposición a sonidos ambientales (utilizando, por ejemplo, la radio o la música grabada y el habla) durante todas las sesiones de entrenamiento, así como durante los experimentos. Durante la primera sesión de entrenamiento, mantener la luz de la habitación en la primera hora, y luego apague la luz hasta el final de la sesión de entrenamiento. Después de 2 horas de entrenamiento en el homecage móvil, liberar al animal de fijación de la cabeza y devolverlo a su jaula con un suministro de agua y alimentos. Déjelo por lo menos 2 horas en condiciones de reposo. Limpie el homecage móvil después de cada sesión de entrenamiento con una solución de etanol al 70% y enjuagarlo con agua del grifo. Empapa-el agua con una toalla de papel desechable y seque el homecage móvil antes del siguiente uso. Lleve a cabo sesiones de entrenamiento consecutivas durante 2 horas, con la luz de la habitación apagada mientras el animal está siendo entrenado. Lleve a cabo la sesión de entrenamiento dos veces al día. Después de 8 a 12 sesiones de formación, usar el animal en una sesión experimental para un máximo de 2 horas a la vez. NOTA: Durante las sesiones de entrenamiento prolongadas que duran más de 1-2 horas, posibilidad de prestar el ratón wagua ith potable, que se puede entregar, ya sea manualmente o utilizando un soporte de pipeta unida al bastidor homecage móvil. Alternativamente, el agua puede ser suministrado para uso a voluntad del animal mediante la colocación de gotas viscosas de hidro-gel directamente sobre las paredes de la homecage móvil. NOTA: Recuerde que debe sopesar los animales todos los días antes de entrenar para descartar cualquier efecto de estrés crónico. Excluir a un animal de experimento si, en cualquier punto del tiempo, demuestra las reacciones de estrés, tales como la congelación, la vocalización, o diarrea inducida por el estrés. 4. Aplicaciones De dos fotones en ¡Despertad Ratón Desplazarse por la Homecage móvil Montar el homecage móvil. Compruebe las posiciones del puente y el brazo de fijación cabeza. Envuelva el animal entrenado en un trapo. Colocar el animal en el homecage móvil. Sujete el soporte de metal en el brazo de fijación cabeza. Retire el trapo. Limpie el cristal de la cubierta contra el polvo implantado utilizandouna solución de etanol al 70% y deje que se seque. Ponga una gota del líquido de inmersión en la clase de cobertura. Utilice preferentemente una solución viscosa, porque el agua se evaporará rápidamente. Coloque el dispositivo homecage móvil con el animal entrenado bajo el microscopio (a menos que tenga un segundo dispositivo, idénticos, que está parado en la configuración de la microscopía). Realizar la formación de imágenes utilizando un encargo o un sistema de formación de imágenes de microscopio de escaneo láser comercialmente disponible equipado con un láser de infrarrojos de impulsos de femtosegundos. Encontrar la región de interés se utiliza el modo de campo amplio del microscopio de fluorescencia. Utilice filtros de paso largo para evaluar la vasculatura cerebral y seleccionar un área objetivo apropiado después de examinar el patrón de los vasos sanguíneos. Para imagen vasculatura cortical, inyectar una solución de 1% de dextrano conjugado con Rojo de Texas 70.000 MW (o su análogo), ya sea en la vena de la cola mientras el animal se inmoviliza en el trapo, o retro-orbital, mientras que elanimal se coloca en la homecage móvil. Sintonice el láser de dos fotones de 860 nm y utilizar el filtro de paso de banda (590-650 nm) para recoger la luz emitida. Utilice el filtro de emisión de 515-560 nm para evaluar los detalles finos de la morfología neuronal o actividad neuronal utilizando, por ejemplo, los ratones transgénicos que expresan YFP o el Ca 2 + – sensible GCaMP3 proteína fluorescente en una subpoblación de neuronas bajo el promotor Thy1. Utilice un software apropiado para la adquisición de imágenes. Después de las imágenes, liberar al animal del brazo de fijación de cabeza, aflojando los tornillos. Volver al animal a su jaula y deje reposar durante al menos 2 horas antes de iniciar la siguiente sesión de imágenes. Guarde las coordenadas de cada región de interés (ROI) para la posterior creación de las imágenes. Imagen de la misma ROI con el tiempo, y ajustar las coordenadas de cada tiempo para maximizar el solapamiento de imagen. Analizará las imágenes y hacer reconstrucciones tridimensionales utilizando un softw apropiadason (por ejemplo, ImageJ, etc). Optico intrínseca en ¡Despertad Ratón Desplazarse por la Homecage móvil Montar el homecage móvil debajo de la cámara de adquisición de imágenes de una configuración intrínseca de imágenes ópticas. Envuelva el animal entrenado en un trapo. Colocar el animal en el homecage móvil. Sujete el soporte de metal en el brazo de fijación cabeza. Limpie la cubierta de cristal implantado contra el polvo con una solución de etanol al 70% y deje que se seque. Coloque una gota de glicerina en el cristal implantado y se cubre con un niño de 8 mm cubreobjetos ronda. Coloque un manipulador con el tubo de soplado de aire frente a la vibrisas contralateral. Ajuste la posición de la cámara de alta velocidad y se enfoque en la vasculatura cortical. Utilice luz verde (filtro 546BP30) sin un filtro de cámara para adquirir el mapa embarcaciones. Centrarse más en la corteza, cerca de 400 micrómetros por debajo de la superficie cortical. Para la imagen tque la señal óptica oxigenación de la sangre nivel-dependiente (BOLD), coloque el filtro 590LP delante de la cámara y se ilumina la corteza con la luz roja (filtro 630BP30). Ajustar la iluminación de la superficie cortical de manera que se distribuye de manera uniforme a través de la región de interés, evitando la exposición excesiva. Ajustar la intensidad de iluminación de manera que la región de interés cae dentro del segmento de 70-90% del rango dinámico de la cámara. Utilice LongDaq software de adquisición de imágenes para recoger imágenes de la cámara. Utilice la imagen frecuencia de adquisición de 1 a 10 Hz (es decir, entre 1 y 10 fotogramas por segundo) para los experimentos con estimulación de baja frecuencia (0,05 Hz). Apague la luz ambiente para evitar la interferencia con la señal óptica intrínseca. Deje por lo menos 30 min para el ratón para adaptarse a la homecage móvil. Imagen de la actividad de referencia durante un episodio de 6 minutos sin estimulación. Para grabar c evocadoactividad ortical, estimular vibrisas en un modo ON/10 seg OFF 10 seg (0,05 Hz estimulación) con una alta frecuencia (25 Hz) de tren de bocanadas de aire para el período total de 6 min. Después de la adquisición de imágenes, suelte el ratón desde el brazo de fijación de la cabeza y devolverlo a su jaula. No utilizar el filtrado de datos adicional para la frecuencia, debido a que las amplitudes de las respuestas de estimulación tienden a ser relativamente alta en animales despiertos, lo que resulta en una excelente relación señal-ruido. Convertir los conjuntos obtenidos de las imágenes a los archivos de la pila *. Tif y analizar más a fondo el uso de, por ejemplo, el software de código abierto de Fiji (ImageJ). Reste la actividad espontánea de referencia a partir de los fotogramas obtenidos durante vibrissa estimulación mediante la herramienta Calculadora de imagen. Alternativamente, los datos de filtro en el dominio de la frecuencia usando el software apropiado. Patch-clamp grabaciones en Awake Ratón Desplazarse por la Homecage móvil Montar el homecage móvil. Envuelva el animal entrenado en un trapo. Administrar trimetoprima (5 mg / kg) y sulfadoxina (25 mg / kg) para prevenir la infección bacteriana. Colocar el animal en el homecage móvil. Sujete el soporte de metal en el brazo de fijación cabeza. Limpie y esterilice el cemento "tope" dental implantado y cubierta de vidrio utilizando una solución de etanol al 70% o el 0,5% de digluconato de clorhexidina y deje que se seque. Poco a poco y con cuidado retire la cubierta de cristal del soporte metálico. Actualizar la memoria intermedia cortical suplementado con penicilina, estreptomicina y limpiar la ventana craneal de los desechos con un tampón hemostático estéril. Coloque el electrodo de tierra en el búfer cortical. Coloque el headstage electrofisiología en un micromanipulador. Fabrique pipetas de vidrio de borosilicato, con miras a la resistencia de punta que van desde 6,5 a 8.5MΩ. Llene la pipeta de parche con una solución intracelular. La composición de la solución de la pipeta de parche es lasiguiente (en mM): KCl 8, 111 K-gluconato, 0,5 de CaCl 2, 2 de NaOH, 10 glucosa, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, y 5 BAPTA, el pH se ajustó a 7,2 con KOH. Los valores de potencial de membrana deben corregirse para tener un potencial de unión líquida calculada de -12 mV 33. Apunte la región de interés mediante coordenadas estereotáxica, y rápidamente se mueve el electrodo en el cerebro mientras se mantiene una fuerte presión positiva en la punta de la pipeta. Después de la penetración de la duramadre y el posicionamiento de la pipeta, medir la resistencia de la punta y descartar los electrodos que muestran un aumento en la resistencia de más de 10-15%, con el fin de mejorar la tasa de éxito de los pasos subsiguientes. Reducir la presión positiva por medio de evitar la hinchazón del tejido cerebral circundante. Otros pasos son similares al protocolo estándar "parche a ciegas". Para encontrar una neurona a grabar, baje la punta en el cerebro de una manera gradual hasta que se detecte una neurona en una estrecha proximidad a piY de la punta de la pipeta, como se indica por una secuencia temporal característico de cambios de impedancia de los electrodos. El indicador clave de la presencia de una neurona es un aumento monotónico en la resistencia del electrodo a través de varios pasos consecutivos hacia adelante de la pipeta (típicamente, un aumento del 20% en la resistencia de la pipeta a través de tres pasos de 2 micras). Para formar un contacto gigaseal con la neurona objetivo, aplicar una presión negativa y la hiperpolarización de la pipeta. Aplicar un breve pulso de una presión negativa más grande a la célula con el fin de establecer la configuración de célula completa. Repliegue el electrodo por 2-3 micras para mantener un buen sello. Actividad espontánea o evocada Grabar durante un período de tiempo deseado, hasta 20-40 min. Después de la grabación, extraiga la pipeta del cerebro. Actualizar la memoria intermedia cortical o colocar una gota de adhesivo de silicona en la ventana craneal, luego pegar un cubreobjetos de vidrio redonda en la parte superior del soporte metálico. Suelte el animAL desde el brazo de fijación de la cabeza aflojando los tornillos. Volver al animal a su jaula durante al menos un día antes de la siguiente grabación. Analizar los datos con, por ejemplo, el software FitMaster. La habituación-deshabituación olfativa prueba en ¡Despertad Ratón Desplazarse por la Homecage móvil Coloque un trozo de algodón limpio (2 x 2 cm) sumergido en el agua del grifo en el lado interno de la pared de la homecage móvil, utilizando una cinta adhesiva de doble cara. Divida la pared homecage móvil en cuatro zonas mediante la colocación de marcadores de color en el lado exterior de la pared de manera que la pieza de algodón se encuentra en el centro de la "zona objetivo". Fijar el animal en el brazo headholder frente al segmento de pared opuesta a la zona de "objetivo" y deje que se adapte a la homecage móvil durante 30 minutos. Tome otro pedazo de algodón limpio y mojado con unas gotas de la esencia de vainilla 1%. Vuelva a colocar el algodón limpio en la pared homecage móvil con el que lleva la vanilLa olor. Presentar el olor durante 5 min. Sigue los movimientos del homecage móvil durante el período de presentación de olor. Estimar el nivel de interés por el olor, midiendo el tiempo acumulado que el animal pasa frente a la zona de "objetivo" en relación con el tiempo total de movimiento homecage móvil. Repita la sesión de aplicación de 5-min tres veces mediante el olor de la vainilla, con un intervalo entre sesiones 5 min. Utilice un nuevo pedazo de algodón "vainilla" en cada sesión. Presentar al animal con un olor socialmente significativos durante el último, quinto período de sesiones. Moje un pedazo limpio de algodón con unas gotas de orina (obtenidos el día anterior de un animal del sexo opuesto) y lo coloca en el medio de la zona objetivo durante 5 min. Reconocimiento olor novela en movimiento despierta ratón por la homecage móvil Divida la pared en cuatro zonas mediante la colocación de marcadores de color en el lado exterior de la pared homecage móvil. AttACH dos piezas limpios de algodón (2 x 2 cm) sumergido en el agua del grifo en el lado interior de la pared en el medio de las zonas opuestas entre sí (designada como zona objetivo 1 y zona objetivo 2). Fijar el animal en el brazo headholder frente a un segmento de la pared exterior de las zonas objetivo y deje que se adapte a la homecage móvil durante 30 minutos. Vuelva a colocar las dos piezas de algodón con los frescos:. Ponga un pedazo de algodón mojado con el extracto de vainilla 1% para apuntar la zona 1 y otra mojada con agua de la llave para atacar la zona 2 Grabe el video de los movimientos homecage móviles durante 10 minutos durante el olfato sesión de presentación. Calcular el olor asistir como el porcentaje del tiempo que el animal pasa frente a la zona objetivo 1 relativa el tiempo acumulado pasó frente a las zonas 1 y 2. Después de un intervalo de 10 minutos, colocar otro par de aplicadores en la pared homecage para el posterior período de 10 min. Coloque el algodón "vainilla" en la zona de objetivo 1 y el aplicador de algodón mojado con 1% de plátano eXtract en Zona Objetivo 2. Realice una grabación de video de los movimientos homecage móviles. Calcular la preferencia a nuevos derivados de olor como el porcentaje de tiempo que el animal pasa frente al segmento de pared con la novela olor (zona objetivo 2) en relación con el tiempo acumulado frente a las zonas 1 y 2.

Representative Results

El método que aquí se presenta está diseñado para imágenes microscópicas unicelulares o registros electrofisiológicos en, cabeza de ratones fijo pero por lo demás se mueven libremente y comportarse despierto. El animal puede moverse en dos dimensiones en un real (en oposición a virtual), el medio ambiente tangible y familiar, mientras que el cráneo de los animales se fija firmemente al brazo de fijación cabeza. Habituar a los ratones a la homecage móviles de aire levantada consta de 4-6 días de las sesiones de entrenamiento de 2 horas dos veces al día (Figura 1). Los animales entrenados a continuación, pueden ser utilizados en los experimentos de inmediato. Un estudio típico incluye una serie de sesiones de formación de imágenes o grabaciones de patch-clamp que están espaciados a intervalos que van desde unas horas hasta varios días o semanas. Es importante destacar que, ambas grabaciones ópticas y electrofisiológicas se pueden realizar simultáneamente con estímulos y lecturas cognitivos o de comportamiento, dentro de un solo experimento. Para evaluar la estabilidad mecánica defijación de la cabeza del ratón en la homecage móvil, se recogieron las secuencias de imágenes de los vasos corticales marcados con dextrano fluorescente conjugado y de dendritas corticales que expresan YFP mientras que los animales de experimentación navegaban el homecage móvil (Figura 2). Los desplazamientos máximos del cerebro durante la locomoción de los animales no suelen superar los 1-1,5 micras. Estos desplazamientos se produjeron en las direcciones horizontal y muy rara vez dieron como resultado un cambio detectable de la plano de la imagen, lo que hace innecesaria cualquier corrección de artefactos de movimiento. Fijación de la cabeza estable en homecage móvil permite la cuantificación de las espinas dendríticas individuales en animales despiertos con la misma fiabilidad que en ratones anestesiados. Densidad de la espina dendrítica, la morfología y la rotación pueden ser monitoreados durante los estudios longitudinales con múltiples sesiones de imagen realizadas a intervalos que van desde unas pocas horas hasta varios días o semanas. La facilidad de uso de la mobile homecage de imagen óptica funcional fue probada en la corteza somatosensorial de los ratones despiertos utilizando dos enfoques: i) microscopía de dos fotones en los ratones transgénicos Thy1-GCaMP3 y ii) de imagen de la señal óptica intrínseca en ratones de tipo salvaje. Ca 2 + de imágenes se realizó en la capa 2/3, que contiene los cuerpos celulares de muchas neuronas marcadas con fluorescencia, así como sus dendritas y axones (Figura 3). Las parcelas de tiempo-fluorescencia a lo largo de las regiones seleccionadas de interés (ROI) se muestran en la Figura 3, lo que demuestra la actividad neuronal espontánea (medida como aumento transitorio en la fluorescencia GCaMP3) durante la navegación activa del ratón en la homecage móvil. De formación de imágenes óptico basado en señales intrínsecas permite el mapeo de la distribución espacial de los dominios funcionales. Figura 4 ilustra cambios en la onda como en el nivel de oxigenación de la sangre (que reflejan la activación neuronal regional) que propagan a lo largo de la corteza somatosensorial en respuesta a Vibrissa estimulación a la frecuencia de 0,05 Hz. Para poner a prueba la viabilidad de patch-clamp grabaciones con homecage móvil, hemos utilizado ratones C57Bl/6J 2-3 meses de edad. Layer 2/3 neuronas en la corteza somatosensorial se registraron a partir de la configuración de célula completa utilizando el modo de pinza de corriente. Grabación de Patch-clamp en el cerebro de los ratones despiertos cabeza fija en homecage móvil era esencialmente similar a cegar patch-sujeción en rodajas de cerebro. Aproximadamente el 50% de los intentos resultó en la formación de gigaseal éxito, de los cuales más de 70% produjo la grabación de la configuración de células enteras estable. No se observaron eventos de perder el contacto gigaseal debido al desplazamiento mecánico de las células. Figura 5 muestra un fragmento de 60 segundos de un tiempo de grabación actual-clamp 10-min representante correspondieron a episodios de del ratón activa (en ejecución) y pasivas (descanso) estados. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in"src = "/ files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" width = "600" /> Figura 1. El método de fijación de la cabeza de los ratones despiertos en el homecage móvil. A) Descripción general del diseño homecage móviles de aire levantado y las ilustraciones del concepto general. B) Diagrama de una línea de tiempo típica experimental. El estudio se inicia con la implantación de la ventana craneal dos semanas antes de habituar el ratón a la manipulación y embalaje, que es seguido por ocho sesiones de entrenamiento dos veces al día. El estudio típico incluye una serie de sesiones de formación de imágenes o grabaciones de patch clamp que están espaciados a intervalos que van desde unas horas hasta varios días o semanas. Ambas mediciones ópticas y electrofisiológicas se puede hacer en paralelo con los estímulos y lecturas cognitivas o de comportamiento dentro de un solo experimento. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 2. Ejemplo de dos fotones de imágenes microscópicas en ratones despiertos moviéndose alrededor del homecage móvil. A, B) vasculatura cortical, etiquetado con el dextrano conjugado con Rojo de Texas 70 kDa. El diámetro de los segmentos de buques individuales se mide mediante el trazado con el tiempo el perfil de las líneas dibujadas a través de la luz del vaso durante períodos de reposo y en funcionamiento de ratón (A). La velocidad del flujo sanguíneo en las arterias y venas se mide por la línea de exploración a lo largo de las líneas dibujadas en paralelo a la pared del vaso (B). C, d) Los detalles finos de la morfología neuronal visualizado en el cerebro de ratones transgénicos que expresan YFP en subpoblación de neuronas bajo el promotor Thy1. Reconstrucción tridimensional de las neuronas piramidales de la corteza somatosensorial del ratón (C). Las imágenes de un b dendríticasrancho adquirida en una, ratón comportarse despierto son suficientemente estables para la cuantificación de la morfología de la espina dendrítica individuo (D). E) Cuantificación de movimiento cerebral causado por los movimientos del ratón. Grandes desplazamientos de amplitud se correlacionan con períodos de funcionamiento del ratón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Ejemplo de actividad de la población neuronal en despiertos ratón Thy1-GCaMP3 moverse por la homecage móvil. A) Imagen de dos fotones de la capa cortical neuronas II / III. ROI, por ejemplo se muestran los cuerpos celulares neuronales, dendritas y axones en amarillo. B) Df / F rastros de la fluorescencia GCaMP3 de ROIs mostradas en A (tiempo de serie grabado en 1.5 segundos / cuadros). C) zoom en la zona visualizada a 65 ms / frame. D) Fluorescencia de ROIs amarillas en C trazada a través del tiempo, se muestran los aumentos transitorios (rojos) en la fluorescencia GCaMP3 que corresponden a la acción Ca 2 + inducida por episodios potenciales de afluencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Ejemplo de mapeo de la distribución espacial de las respuestas funcionales en la corteza de un ratón despierto por medio de imágenes de las señales ópticas intrínsecas. A) vista de campo brillante de los vasos sanguíneos superficiales a través de la ventana craneal. B) Mapa de la magnitud de la actividad de línea de base en Ho móvilmecage durante un episodio de 6 min. C) Mapa de la magnitud de la actividad neuronal se propaga a lo largo de la corteza somatosensorial en respuesta a la estimulación vibrisas a una frecuencia de 0,05 Hz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5. Ejemplo de grabación de patch-clamp de células enteras en la corteza de un ratón despierto en movimiento alrededor de la homecage móvil. A) la grabación actual-clamp de una neurona en la capa cortical del ratón 2/3. A 0,5 segundos, 100 pA inyección de corriente (se indica a continuación la traza) da lugar a una explosión de los potenciales de acción. La célula mostró característico adaptación de frecuencia pico para las neuronas piramidales. B) de grabación actual-clamp Continuode la misma neurona correlacionado con la actividad del ratón 'locomotor (en rosado encima de la traza). Actividad espontánea Representante de la capa 2/3 de las neuronas en los períodos de la del ratón en reposo (C) y en funcionamiento (D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6. Pérdida de peso de los animales y la actividad locomotora de los ratones head-fixed/non-fixed durante las sesiones de entrenamiento en el homecage móvil. A) El peso del animal (media + SD,%), antes de las sesiones de entrenamiento. Tenga en cuenta que la pérdida de peso está totalmente revertido por la 7-8 ª sesión de entrenamiento. B) Trayectoria del ratón locomoción horizontal con respecto al homecage móvil,que fue extrapolada a partir del movimiento de seguimiento del homecage móvil durante la 8 ª sesión de entrenamiento. c) los movimientos de oruga de un ratón fijo-no la cabeza explorar la jaula redonda durante la 8 ª sesión de entrenamiento. D) Duración de la cabeza fija (círculo) y no fijos (triángulo) movimiento ratones durante 1-4 días del entrenamiento (media + SD,%). Tenga en cuenta que, en el día 4, la cabeza de ratones fija muestran ni de congelación (como en el día 1), ni la actividad locomotora excesivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Para entender mejor la fisiología del cerebro y de la patología, la investigación se debe realizar en una variedad de niveles de complejidad de preparación, la utilización de las técnicas más apropiadas para cada preparación. En la actualidad, una amplia gama de metodologías de neurociencia (de todo el cuerpo fMRI para microscopía STED sub-orgánulo) se aplican fácilmente a los animales anestesiados, mientras que los experimentos en animales despiertos y comportándose han representado un desafío metodológico significativo.

Aquí, un nuevo enfoque se describe en el animal de laboratorio, a pesar de estar firmemente fijado cabeza-, se puede mover alrededor de un homecage móviles de aire levantado y explorar su entorno tangible en condiciones sin estrés. La preparación de animales cabeza-fijo comportarse presentado aquí proporciona una serie de ventajas cruciales. En primer lugar, los datos electrofisiológicos o imágenes obtenidas con este método son sin compromisos ni por la anestesia, ni por el estrés inducido por la constricción. Posicionamiento del ratón en la casa móviljaula es rápida y no requiere anestesiar al animal, incluso de forma transitoria. En segundo lugar, la homecage aire levantado asegura la estabilidad mecánica que es necesaria para cuantificar los cambios en la morfología neuronal y fina para grabar una sola célula de la actividad electrofisiológica en animales despiertos. Por último, el diseño de la homecage móvil es más compacto en comparación con la cinta de correr esférica, permitiendo así el posicionamiento de la homecage móvil bajo un microscopio vertical estándar para dos fotones de imágenes o la grabación de patch-clamp en el cerebro de ratón despierto.

Fijación de la cabeza firme en el homecage móvil requiere la implantación de un soporte de metal de cuatro alas de diseño especial, con una abertura redonda en el centro de acceso óptico o eléctrico a la región cerebral subyacente. Estos soportes metálicos están unidos al cráneo por medio de una combinación de pegamento, cemento dental y un pequeño perno atornillado en el hueso del cráneo. Este procedimiento quirúrgico se desarrolló sobre la base de un gran número de anterioridadprocedimientos publicados, y se encontró que resultar en una preparación de ventana craneal estable y reproducible. Para experimentos in vivo electrofisiológicos, una ventana en forma de luna 34, un pequeño tamaño de la craneotomía (menos de 0,5 mm) 32, y una preparación de cubiertas de vidrio perforado 35 se han utilizado. Aquí, la ventana craneal "invertida" se implantó con cualquiera de un gran (3,5 mm de diámetro) o pequeña (menos de 0,5 mm de diámetro) craneotomía. Minimizar el movimiento del cerebro es fundamental para las grabaciones de células individuales estables, por lo que es aconsejable realizar la craneotomía de pequeño tamaño para experimentos electrofisiológicos. Tras la implantación de la ventana craneal para los experimentos de imagen óptica, los animales se dejaron recuperar durante al menos 2 o 3 semanas, período durante el cual la ventana pierde el primero transitoriamente su transparencia y a continuación, recupera (con un rendimiento de 50-70%, dependiendo el fondo genético de la cepa de ratón). La transparencia de la ventana craneal y estabilidaddad del cemento "tope" dental ajustado al cráneo puede ser verificada por medio de un microscopio binocular regular y la inspección física durante el manejo animal. Al final del período de recuperación de 2-3 semanas, los animales que exhiben ningún signo de inflamación post-operativa residual o defectos mecánicos en el cemento dental deben ser excluidos de los experimentos y se termina.

La edad óptima para el inicio de la formación de los ratones es de 2-4 meses (correspondientes al peso corporal de 20-40 g). En animales jóvenes, el anclaje del cemento "tope" dental en el cráneo puede ser poco fiable, lo que puede disminuir su capacidad de resistencia a la tensión mecánica que se impone por la locomoción del ratón de cabeza fija en el homecage móvil. Aunque los ratones masculinos y femeninos aparecen igualmente dispuestos para navegar en homecage móvil, hay una tendencia para lograr un mejor porcentaje de ventanas craneales recuperar su transparencia en ratones hembra (datos no mostrados). Por lo tanto, con el fin de to asegurar una mezcla equilibrada de los géneros en la cohorte de animales seleccionados para la imagen, la implantación de las ventanas craneales en aproximadamente el 30% de los ratones más masculina se recomienda. Las interacciones sociales son conocidos por mejorar el bienestar de los animales y reducir el estrés, por lo tanto, es aconsejable que las camadas son operadas y entrenados en paralelo y se mantienen juntos en jaulas de alojamiento en grupo.

En contraste con los procedimientos publicados para la preparación cinta de correr esférica 13, el método que utiliza la homecage móvil no requiere anestesiar el ratón en el momento de la fijación de la cabeza. Esta diferencia es importante porque permite descartar la existencia de efectos residuales que incluso una breve y "luz" episodio anestesia es probable que tenga sobre las medidas fisiológicas obtenidas poco después. De hecho, a pesar de que en los estudios en los que la fijación de la cabeza se realiza con anestesia y los experimentos reales se iniciaron después de un breve tiempo de espera 13, no se puedeexcluir posibles efectos a largo plazo del breve episodio de anestesia en los datos experimentales. Otros estudios se han basado en la privación de agua durante la habituación sistemática de los animales a la cabeza de la fijación y utilizado recompensa agua como medio de motivar al animal a permanecer inmóvil 36. Sin embargo, el método de fijación de la cabeza basado en recompensas limita la elección de pruebas de comportamiento aplicables y, sobre todo, ocupa una de las asociaciones de estímulo-recompensa bien establecidos. En contraste, el método de la habituación ratón para cabeza de fijación en homecage móvil no requiere privación de agua y la posterior recompensa.

Que complementa la homecage móvil con un sistema de distribución de agua se recomienda para los experimentos de larga duración. Las sesiones de entrenamiento de los animales y los experimentos que aquí se presentan se realizaron durante el día (08 a.m.-6 p.m.), que corresponde al período fisiológicamente pasivo para aquellos ratones que se mantienen en el marco del programa de luz de 12 horas estándar (lilos dere a las 6 de la mañana y sale a las 6 horas). Desde la toma de agua está directamente relacionada con la actividad del ratón, durante los pasivos ratones período no requieren el suministro de agua si la duración de una sesión de entrenamiento / imagen / grabación no exceda de 2 horas. Además de la fecha y la duración de las sesiones de entrenamiento, hay que abordar el tema del número óptimo de sesiones necesarias para habituar a los animales a homecage móvil. Para este fin, se usaron dos criterios para evaluar inducida por procedimientos cabeza de fijación estrés: i) la pérdida de peso, y ii) el nivel de actividad locomotora. Como se muestra en la Figura 6, la pérdida de peso alcanza el nivel promedio de 6% en el día de entrenamiento 2, y está completamente revertida por día de entrenamiento de 4 (Figura 6A). En consonancia con la dinámica de pesaje, el nivel de actividad locomotora de los animales en la cabeza-fijo se suprime el primer día de entrenamiento, pero se estabiliza por día de entrenamiento de 4 (Figura 6D). Sobre la base de estas mediciones, que sugerenciast que la duración mínima del período de formación del ratón en homecage móvil es de 4 días, como se describe en el protocolo de la presente.

El uso de la, homecage móvil plana con piso aire levantado permite agregar tareas complejas (sensoriomotoras, perceptivas y cognitivas) a los paradigmas de formación para la cabeza de ratones fijo. En el presente estudio se presentan dos protocolos de pruebas de comportamiento. Ambos protocolos utilizan señales del olor y pueden combinarse con longitudinales de formación de imágenes / grabaciones en la corteza del ratón. Aunque el homecage móvil está fabricado a partir de materiales no absorbentes, todavía se tiene que tomar en cuenta las posibles interferencias entre el olor del dispositivo y olor (s) de prueba. Otro factor que puede interferir con las señales visuales / táctiles de un experimento conductual es la unión entre la pared y el inserto, lo que no es perfecto y puede, por tanto, ser percibidos por el animal como un hito. Vale la pena señalar aquí que, a fin de reducir al mínimo la angustia del animal durante tales interventions como la colocación de un algodón olor presentadoras a la pared homecage móvil, el experimentador deben practicar para realizar este tipo de intervenciones tan rápidamente como sea posible y evitar la manipulación prolongada de la jaula de carbono. Estrategias alternativas para novela presentación olor / objeto son concebibles, por ejemplo, la colocación de solución a base de hidrogel gotas o objetos (tales como virutas de alimento) en pequeños estantes unidos a la superficie interior de la pared de la jaula de carbono en la altura compatible con el posicionamiento de la cabeza del animal.

Homecage Mobile permite a los animales en la cabeza-fija para llevar a cabo una amplia gama de movimientos de dos dimensiones incluyendo la locomoción horizontal, situp, el aseo, batiendo, lamiendo, nariz-poking, los movimientos de la pata delantera cualificados, y tocar la pared con las extremidades anteriores, como se ilustra en el presente estudio . Usando homecage móvil y los protocolos que aquí se presentan, los investigadores pueden estudiar el sistema neuronal sensoriomotor con un alto nivel de control sobre tanto la condición de estimulacións y los conductuales read-outs. Por otra parte, los estudios de las capacidades cognitivas en ratones despiertos se pueden realizar durante el acondicionamiento, la navegación espacial y tareas de toma de decisiones.

Existen varias limitaciones prácticas de este método. En primer lugar, se necesita una cantidad significativa de aire a presión para alcanzar la potencia homecage-elevación y para llevar a cabo experimentos de larga duración. En segundo lugar, la homecage móvil en su presente aplicación es sólo 18 cm de diámetro, y por lo tanto proporciona un espacio relativamente pequeño y sencillo en comparación con la realidad virtual, donde un entorno experimental complejo puede ser diseñado sin ningún tipo de restricciones espaciales. En tercer lugar, durante la estimulación bigote y experimentos basados ​​en recompensa presentados aquí, se utilizó un dispositivo que limita la posibilidad de que la pared de contacto para el ratón. La adición de un canal de estimulación visual o sensorial externo (como un proyector de luz del ojo dirigida) requeriría el diseño de un dispositivo más ergonómico y compacto en comparación conlas soluciones de pantalla múltiple o de cúpula de proyección que se han utilizado en los experimentos de cinta rodante esféricas.

En resumen, el uso de los ratones de cabeza-fijo se mueven en la homecage móviles de aire levantado facilita en gran medida los estudios que combinan niveles celulares, moleculares y de comportamiento de observación y manipulación dentro de un solo experimento. Aplicaciones específicas ilustradas aquí son imágenes microscópicas de dos fotones, las imágenes de la señal óptica intrínseca y patch-clamp grabaciones en ratones comportando no anestesiados. Se espera que este enfoque abrirá nuevos horizontes en la experimentación sobre despierto, ratón comportarse y de servir como una herramienta útil tanto para el desarrollo de fármacos e investigación básica de la función cerebral.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen al profesor Eero Castren por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. El trabajo es apoyado por becas de la Academia de Finlandia, Centro para la Movilidad Internacional de Finlandia, y el finlandés Graduate School of Neuroscience (Programa de Doctorado Mente Cerebro y).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Tweezers  Stainless Steel, 115mm XYtronic XY-2A-SA
Animal trimmer, shaving machine Aesculap Isis GT420
Binocular Microscope Zeiss  Stemi 2000
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad Supertech TMP-5b
Blunt microsurgical blade BD REF 374769
Borosilicate tube with filament Sutter Instruments BF120-69-10 For patch pipette production
Camera  Foscam FI8903W Night visibility
Carprofen Pfizer Rimadyl vet
Dental cement DrguDent, Dentsply REF 640 200 271
Dexamethasone FaunaPharma Rapidexon vet
Disposable drills Meisinger HP 310104001001008
Dulbeco’s PBS 10X Sigma D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm FST 91150-20
Eyes-lubricant Novartis Viscotears For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion 
Foredom drill control Foredom  FM3545
Foredom micro motor handpiece Foredom MH-145
Four-winged metal holder Neurotar
Head Holder for Mice Narishige SG-4N Assembled on stereotaxic instrument
Hemostasis Collagen Sponge Avitene, Ultrafoam BARD Ref 1050050
Imaris Bitplane
Ketamine Intervet Ketaminol vet
Kwik-Sil  WPI
Mai Tai DeepSee laser Spectra-Physics
Micro dressing forceps, 105 mm Aesculap BD302R
Microelectrode puller Narishige PC-10H Vertical puller for glass pipette production
Micromanipulator Sensapex
Mini bolt Centrostyle Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5
Mobile Homecage Neurotar
Multiphoton Laser Scanning Microscope Olympus FV1000MPE
Nonwoven swabs 5×5 Molnlycke Health Care Mesoft Surgical tampons
Polyacrylic glue Henkel Loctite 401
Round glass coverslip  Electron Microscopy Sciences
1.5 thickness 
Small animal stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900
Student iris scissors, straight 11.5 cm FST 91460-11
Xylazine Bayer Health Care Rompun vet
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References

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Kislin, M., Mugantseva, E., Molotkov, D., Kulesskaya, N., Khirug, S., Kirilkin, I., Pryazhnikov, E., Kolikova, J., Toptunov, D., Yuryev, M., Giniatullin, R., Voikar, V., Rivera, C., Rauvala, H., Khiroug, L. Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents. J. Vis. Exp. (88), e51869, doi:10.3791/51869 (2014).
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