JoVE Journal > Behavior
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Behavior

Flat-gevloerd Air-opgeheven Platform: Een nieuwe methode voor het combineren Gedrag met Microscopie of Electrofysiologie op Awake vrij bewegende Knaagdieren

Published: June 29, 2014
doi:
10.3791/51869
, , , , , , , , , , , , , ,
1Neuroscience Center,University of Helsinki, 2Neurotar LTD, 3A. I. Virtanen Institute for Molecular Sciences,University of Eastern Finland, 4Laboratory Animal Center,University of Helsinki

Summary

Deze methode zorgt voor een tastbaar, vertrouwde omgeving voor de muis te navigeren en te verkennen tijdens microscopische beeldvorming of eencellige elektrofysiologische opnames, die stevige fixatie van het hoofd van het dier nodig heeft.

Abstract

Het is algemeen erkend dat het gebruik van algemene anesthesie de relevantie van elektrofysiologische of microscopische gegevens verkregen uit de hersenen van een levend dier kan ondermijnen. Bovendien is de langdurige herstel van anesthesie beperkt de herhalingsfrequentie van de opname / weergave episoden longitudinale studies. Derhalve nieuwe methoden die stabiele opnamen van niet-verdoofde muizen gedragen zou kunnen worden verwacht dat het gebied van cellulaire en cognitieve neurowetenschappen bevorderen. Bestaande oplossingen variëren van louter fysieke fixatie meer verfijnde benadering, zoals lineaire en sferische loopbanden in combinatie met computerbeelden virtual reality. Hier wordt een nieuwe methode beschreven waarbij een head vaste muis kun je verplaatsen over een van airconditioning opgeheven mobiele homecage en haar omgeving te verkennen onder stress-vrije omstandigheden. Deze methode staat onderzoekers toe om gedrags-tests (bv., leren, gewenning of nieuw object herkenning) gelijktijdig uit te voeren mettwee-foton microscopische beeldvorming en / of patch-clamp, alle gecombineerd in een enkel experiment. Dit video-artikel beschrijft het gebruik van de wakkere dieren hoofd fixeerinrichting (mobiel homecage), toont de procedures van dieren gewenning en illustreert een aantal mogelijke toepassingen van de werkwijze.

Introduction

Een spannende recente trend in de neurowetenschappen is experimentele benaderingen voor moleculaire en cellulaire sonderen van neuronale netwerken in de hersenen van wakker, gedragen knaagdieren ontwikkelen. Dergelijke benaderingen houden beloven om nieuw licht te werpen op de neurofysiologische processen die motoriek, sensomotorische integratie, perceptie, leren, geheugen, evenals letsel progressie, neurodegeneratie en genetische ziekten ten grondslag liggen. Bovendien, het opnemen van de hersenen wakker dier houdt belofte in de ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen en behandelingen.

Er is een groeiend besef dat verdoving, dat is vaak gebruikt in neurofysiologische experimenten, kan invloed hebben op de fundamentele mechanismen van de hersenfunctie, wat kan leiden tot foutieve interpretatie van experimentele bevindingen. Zo, de meest gebruikte verdovingsmiddel ketamine verhoogt snel vorming van nieuwe spines en verbetert de synaptische functie 1; Een andere veel gebruikte anesthetic isofluraan bij chirurgische anesthesie niveaus volledig onderdrukt spontane corticale activiteit bij pasgeboren ratten en blokkeert spindel-burst oscillaties in volwassen dieren 2. Momenteel zijn er slechts een beperkt aantal benaderingen mogelijk experimenten in niet-verdoofde muizen door middel van twee-foton microscopische beeldvorming of patch-clamp. Deze benaderingen kunnen worden onderverdeeld in vrij bewegende en vaste kop-preparaten.

De unieke aantrekkingskracht van een vrij bewegende voorbereiding dier is dat het mogelijk de beoordeling van natuurlijk gedrag, met inbegrip van hele lichaamsbewegingen tijdens de navigatie. Een manier om de afbeelding in de hersenen van een vrij bewegende knaagdier is een geminiaturiseerde head-mounted microscoop of fiberscope 3-5 hechten. Echter, geminiaturiseerde apparaten vaak beperkte optische prestaties in vergelijking doelstellingen gebaseerde twee-foton microscopie en niet goed te combineren met whole cell patch-clamp 6.

De existing oplossingen voor-hoofd vaststelling van een wakkere knaagdier hebben vooral vertrouwd, hetzij op fysieke fixatie 7,8 of op het trainen van het dier om vrijwillige hoofdsteun 9 vertonen. Een andere populaire benadering is om poten van het dier te bewegen door het op bijvoorbeeld een bolvormige tredmolen 10; deze aanpak wordt vaak gecombineerd met de computer gegenereerde virtual reality. Elektrofysiologische experimenten hoofd vaste muizen meestal gebruikt extracellulaire opnames en werden gebruikt om centrale regulatie van cardiovasculaire functie 11 effecten van anesthesie op neuronale activiteit 12, de auditieve hersenstam respons in de 13 en informatieverwerking 14 bestuderen. De baanbrekende intracellulaire / whole-cell opnames in wakkere gedragen dieren werden uitgevoerd in de jaren 2000 en hebben zich gericht op neurale activiteit met betrekking tot waarneming en beweging 15-20. Rond dezelfde tijd werden de eerste microscopische beeldvorming studies op muizen wakker pubsteld, waar twee-foton microscopie werd gebruikt in de sensorische cortex van ratten fysiek tegengehouden 7 en muizen die op een bolvormig loopband 21.

Daaropvolgende in vivo microscopie en elektrofysiologie studies toonden aan dat een hoofd fixatie voorbereiding succesvol kunnen worden gecombineerd met gedrags-paradigma gebaseerd op voorpoot bewegingen, geur herkenning, kloppen, en likken 8,22-25. Muizen die op de bolvormige loopband kan getraind worden om de virtuele visuele omgeving gegenereerd door een computer 10,26 navigeren. Intracellulaire / extracellulaire opnames aangetoond dat in een vaste kop dier navigeren dergelijke virtuele omgeving, activering van hippocampale cellen plaats kan worden gedetecteerd 27. In een virtuele visuele omgeving, muizen tonen normale voortbewegingsapparaten theta ritme in het lokale veld potentieel en theta-fase precessie tijdens actieve beweging 27. Onlangs heeft de ruimtelijke en temporele Activiteity patronen van neuronale populaties optisch geregistreerd in muizen tijdens werkgeheugen beschikking taken in een virtuele omgeving 28.

Ondanks baanbrekend onderzoek mogelijk heeft gemaakt, de sferische loopband ontwerp heeft een aantal inherente beperkingen. Eerst wordt het dier zijn om over een onbeperkt oppervlak van een roterende lucht tilde bal, die geen tastbare obstakels zoals muren of barrières vormt. Deze beperking is slechts gedeeltelijk gecompenseerd door de computer gegenereerde "virtual reality", omdat visuele input is aantoonbaar minder effectief op muizen en ratten in vergelijking met de tactiele sensorische input (bijv. whisker keer of likken), die deze soorten vanzelfsprekend rekenen op. Ten tweede kan de grote kromming van het oppervlak van de kogel ongemakkelijk voor laboratoriummuizen gebruikt lopen op een vlakke vloer in hun kooien. Tenslotte, de zuivere diameter van de kogel (minimaal 200 mm voor muizen en 300 mm voor ratten) maakt de verticale afmeting van het bolvormigeloopband apparaat relatief groot. Dit maakt het moeilijk sferische loopband combineren met de meeste commercieel verkrijgbare microscopie opstellingen en vereist vaak het bouwen van een nieuwe opstelling rond de loopband door middel van op maat gemaakte microscoop frames.

Hier wordt een nieuwe methode beschreven waarbij een head vaste muis kun je verplaatsen over een van airconditioning opgeheven mobiele homecage dat een vlakke vloer en tastbare muren voorzien, en verken de fysieke omgeving onder stress-vrije omstandigheden. Dit artikel toont de procedures van muis opleiding en hoofd fixatie en geeft representatieve voorbeelden waar twee-foton microscopie intrinsieke optische beeldvorming en patch-clamp worden uitgevoerd in de hersenen van muizen wakker gedragen.

Protocol

Alle hier gepresenteerde procedures werden uitgevoerd volgens de plaatselijke richtlijnen voor de verzorging van dieren (De Finse Wet op dierproeven (62/2006)). Het dier licentie (ESAVI/2857/04.10.03/2012) werd verkregen van de lokale overheid (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Volwassen muizen (leeftijd 1-3 maanden, gewicht 20-40 g) werden in groepshuisvesting kooien in de gecertificeerde dier faciliteit van de Universiteit van Helsinki gehouden en voorzien van voedsel en water ad libitum. 1. Craniale Window Implantatie Craniale venster geïmplanteerd volgens gepubliceerde protocollen 29-31 met kleine modificaties, zoals hieronder kort beschreven: Steriliseren van de instrumenten voor aanvang van de craniale venster implantatie. Handhaaf steriele omstandigheden tijdens de operatie om het risico op postoperatieve complicaties te minimaliseren. Dien een analgeticum (Ketoprofen, 2,5 mg / kg) 30 minuten voor de operatie en 24 uur na de operatie. Eenesthetize de muis met een mengsel van ketamine (80 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) intraperitoneaal geïnjecteerd. Regelmatig toezicht op de diepte van de anesthesie door poot knijpen. Gebruik een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur van het dier bij 37,0 ° C te houden De operatie-geïnduceerde ontsteking en cerebraal oedeem te verminderen, dienen dexamethason (2 mg / kg) door subcutane injectie. Solliciteer oogzalf om de ogen te beschermen tegen het krijgen van droog. Scheren hoofd van de muis en reinig het geschoren gebied. Snijd de huid met behulp van chirurgische schaar en pincet langs de lijn van het nekvel naar het voorhoofd. Verwijder eventuele bindweefsel bevestigd aan de schedel. Langzaam en voorzichtig boren een klein goed op de linker frontale bot met een hoge snelheid chirurgische boor. Schroef een mini-bout (zie materialen) in de geboorde put. Voer niet meer dan een-en-een-half vol omwentelingen van de schroef. OPMERKING: Vermijd die gebieden die zich direct boven de oppervlakkige corticale schepen. Verstoring van deze vessel kan leiden tot massale bloeden. Om craniotomy uitvoeren, boor een cirkelvormig venster (3-3.5 mm in diameter) in de rechter pariëtale bot. Breng een druppel van de cortex buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgSO 4 in gedestilleerd H2O aangevuld met penicilline 100 eenheden / ml streptomycine en 100 ug / ml) en voorzichtig het gedeelte van het bot gelegen binnen het cirkelvormige venster te verwijderen. OPMERKING: Een fluorescerend eiwit expressie in een specifieke subpopulatie van cellen, voeren intracraniale injectie van adeno-geassocieerde virale (AAV) vector of andere virale vectoren op dit punt in de procedure. Plaats een ronde glazen dekglaasje (# 1.5 dikte code) op de craniale venster. Bevestig de dekglaasje aan de schedel met polyacryl lijm. Plaats een metalen houder op de top van het dekglaasje en zet deze vast met het mengsel van tandheelkundige cement en polyacryl lijm. Opmerking: De hierboven beschreven werkwijze is geoptimaliseerd voor craniale ramenin optische beeldvorming experimenten. Om een ​​"omgekeerde" craniale venster geschikt voor elektrofysiologische experimenten voor te bereiden, gebruik maken van een andere procedure. Eerste, lijm de metalen houder aan de schedel. Boor een rond venster in de opening van de houder zoals toegelicht in de video. Alternatief maakt een kleiner craniotomie (minder dan 0,5 mm in diameter) in het gebied van belang te voorkomen of minimaliseren van de hersenen beweging 32. Vernieuw de corticale buffer of een druppel van siliconen lijm op de craniale venster, sluit het dan met een ronde glazen dekglaasje. Na het voltooien van de operatie, plaats het dier in een verwarmde kooi met gemakkelijk toegankelijke voedsel en water. Breng het dier naar de groepshuisvesting kooi pas nadat hij volledig herstelt van anesthesie. Opnieuw toedienen pijnstillende op het ontdekken van tekenen van pijn, met inbegrip van onwil om te bewegen, eten of drinken, gewichtsverlies, speekselvloed, pilo-erectie of abnormale respiratoire geluiden. 2. Animal Handling Neem de muis uit zijn kooi en gewoon houd het gedurende 5-10 minuten. Wees kalm bij omgang met het dier, voorkomen dat schokkerige bewegingen en geluiden. Na omgang, de terugkeer van de muis naar zijn kooi. Herhaal de werkprocedures 2-3x met ongelijke intervallen tussen behandeling episodes, teneinde de muis comfortabel met de experimentator maken. Neem een ​​kleine zachte doek en wikkel het dier 2-3x met ongelijke tussenpozen. Dier moeten kalm blijven en wennen aan wordt verpakt. Als de muis is opgewonden en nerveus, herhaal de behandeling en verpakking procedures. 3. Animal Training Start de training van het dier in de mobiele homecage de volgende dag na de gewenning aan handling en verpakking is voltooid. Noteer het dier dagelijks te wegen voor en tijdens de training. OPMERKING: Als u tijdens de training, het dier verliest meer dan 10% van zijn gewicht, het moet worden van t uitgeslotenhij experimenten. De verticale positie van het hoofd fixatie arm van het mobiele homecage inrichting om de grootte van het getrainde dier passen. Sluit de luchtinlaat van het apparaat om de standaard laboratorium perslucht uitlaat (typisch ofwel een gastank of een luchtpomp die een voldoende hoge druk en snelheid van de luchtstroom zorgt dus ongeveer 5 bar en 300 l / min). Wikkel het dier in een doek. Plaats de metalen houder, die aan het hoofd van het dier wordt bevestigd, in de kop fixatie arm en stevig te bevestigen door het aandraaien van de schroeven. Zet de luchtstroom en zorg ervoor dat de luchtstroom optimaal is voor gratis beursgang van de lucht opgeheven homecage. Laat het dier in de mobiele homecage door het verwijderen van het doek. Om het dier wennen aan geluid zorgen voor een constante blootstelling aan omgevingsgeluiden (met bijvoorbeeld radio of opgenomen muziek en spraak) tijdens alle trainingen en tijdens de experimenten. Dijdens de eerste training, houden de kamer licht op voor het eerste uur, toen het licht uit tot het einde van de training. Na 2 uur training in de mobiele homecage, laat het dier van kop fixatie en terug te sturen naar zijn kooi met een levering van water en voedsel. Laat het minstens 2 uur onder rusttoestand. Maak de mobiele homecage na elke training met een 70% ethanol-oplossing en spoel het met leidingwater. Soak-up het water met wegwerp papieren handdoek en droog de mobiele homecage voor het volgende gebruik. Voer je opeenvolgende trainingssessies gedurende 2 uur, met de kamer licht uitgeschakeld terwijl het dier wordt opgeleid. Voer de training twee keer per dag. Na 8 tot 12 trainingen, gebruikt het dier een experimentele sessie tot 2 uur per keer. OPMERKING: Tijdens langdurige trainingen die meer dan 1-2 uur duren, overwegen de muis wet drinkwater, die handmatig of met behulp van een pipet houder bevestigd aan de mobiele homecage frame kan worden geleverd. Als alternatief kan water worden toegevoerd voor ad libitum gebruik van het dier door het plaatsen viskeuze druppels hydro-gel direct op de wanden van de mobiele homecage. OPMERKING: Vergeet niet om de dieren af ​​te wegen elke dag voor de training om elke chronische stress effecten. Uitsluiten van een dier uit het experiment indien, op enig tijdstip, het toont stressreacties zoals bevriezing, vocalisatie, of stress-geïnduceerde diarree. 4. Toepassingen Twee-foton Imaging in Awake Muis bewegen de Mobile Homecage Monteer de mobiele homecage. Controleer posities van de brug en het hoofd fixatie arm. Wikkel de getrainde dier in een doek. Plaats het dier in de mobiele homecage. Klem de metalen houder in het hoofd fixatie arm. Verwijder de doek. Reinig het geïmplanteerde afdekglas van stof meteen 70% ethanol-oplossing en laat ze drogen. Een druppel van de onderdompeling vloeistof op het deksel klasse. Gebruik bij voorkeur een viskeuze oplossing, omdat het water snel zal verdampen. Plaats de mobiele homecage apparaat met de getrainde dier onder de microscoop (tenzij je een tweede, identieke inrichting, die stilstaat in de microscopie setup). Voer de beeldvorming met behulp van een op maat gemaakt of een commercieel verkrijgbare laser scanning microscoop imaging systeem uitgerust met een femtoseconde gepulste infrarode laser. Vind het interessegebied met het brede gebied modus van de fluorescentiemicroscoop. Gebruik lange pass filters om hersenenvasculature beoordelen en selecteer de gewenste doelgebied na bestudering van het patroon van de bloedvaten. Om het corticale vaatstelsel Injecteer een oplossing van 70.000 MW Texas Red-geconjugeerd dextraan (of analoog) 1%, hetzij in de staartader terwijl het dier wordt geïmmobiliseerd in de doek of retro-orbitaal terwijldier is gepositioneerd in de mobiele homecage. Stem de twee-foton laser tot 860 nm en gebruik de band pass filter (590-650 nm) tot het uitgezonden licht te verzamelen. Gebruik emissiefilter 515-560 nm de fijne details van neuronale morfologie of neuronale activiteit gebruikmaking beoordelen, bijvoorbeeld transgene muizen die YFP of Ca2 + drukken – fluorescente proteïne GCaMP3 in een subpopulatie van neuronen onder Thy1 promoter. Gebruik een geschikte software voor het acquisitie. Na beeldvorming, laat het dier uit het hoofd fixatie arm door het losdraaien van de schroeven. Terug het dier zijn kooi en laat het vervolgens gedurende ten minste 2 uur vóór het begin van opnamesessie. Bewaar de coördinaten van elke regio van belang (ROI) voor latere reimaging. Afbeelding dezelfde ROI tijd en coördinaten om iedere keer naar afbeelding overlap maximaliseren. Analyseer de beelden en maakt driedimensionale reconstructies met behulp van een geschikte softwzijn (bijvoorbeeld ImageJ, enz.). Intrinsieke Optical Imaging in Awake Muis bewegen de Mobile Homecage Monteer de mobiele homecage onder het beeld overname camera van een intrinsieke optische beeldvorming setup. Wikkel de getrainde dier in een doek. Plaats het dier in de mobiele homecage. Klem de metalen houder in het hoofd fixatie arm. Reinig het geïmplanteerde afdekglas uit stof met een 70% ethanol-oplossing en laat ze drogen. Breng een druppel glycerol op de geïmplanteerde glas en bedek het met een 8 mm rond dekglas. Plaats een manipulator met de lucht-blaasbuis tegenover de contralaterale vibrissa. Pas de positie van de high-speed camera en zich richten op de corticale vaatstelsel. Gebruik groen licht (filter 546BP30) zonder camera filter om de kaart te schepen te verwerven. Focus dieper in de cortex, ongeveer 400 micrometer onder de corticale oppervlak. Om het beeld thij bloedoxygenatie level-dependent (BOLD) optisch signaal, plaatst de 590LP filter voor de camera en verlichten de cortex met rood licht (filter 630BP30). Stel de verlichting van het corticale oppervlak dat gelijkmatig wordt verdeeld door het gebied van belang, het vermijden overbelichting. Stel de lichtintensiteit zodat de regio van belang binnen de 70-90% segment van het dynamische bereik van de camera valt. Gebruik LongDaq afbeelding acquisitie software om beelden uit de camera te halen. Gebruik beeldaanwinst frequentie van 1 tot 10 Hz (dwz tussen 1 en 10 frames per seconde) voor experimenten met lage frequentie stimulatie (0,05 Hz). Schakel het licht in de kamer om eventuele interferentie met de intrinsieke optisch signaal te voorkomen. Tenminste 30 minuten voor de muis aan te passen aan de mobiele homecage. Afbeelding de basislijn activiteit tijdens een 6-min episode zonder stimulatie. Om opgeroepen c opnemenortical activiteit stimuleren vibrissa in een 10 sec ON/10 sec OFF-mode (0,05 Hz stimulatie) met een hoge frequentie (25 Hz) trein van lucht pufjes voor de totale duur van 6 minuten. Na beeldaanwinst, laat u de muis uit het hoofd fixatie arm en terug te sturen naar zijn kooi. Geen extra gegevensfiltering niet voor frequentie, omdat de amplitude van de stimulatie respons meestal relatief hoog in wakkere dieren, wat resulteert in uitstekende signaal-ruisverhouding. Zetten de verkregen sets van beelden naar *. Tif stapel bestanden en ze verder analyseren met behulp van, bijvoorbeeld, de open source software FIJI (ImageJ). Aftrekken van de basislijn spontane activiteit van de verkregen tijdens vibrissa stimulatie met behulp van de Calculator gereedschap frames. Alternatief filter gegevens in het frequentiedomein met geschikte software. Patch-clamp Recordings in Awake Muis bewegen de Mobile Homecage Monteer de mobiele homecage. Wikkel de getrainde dier in een doek. Dien trimethoprim (5 mg / kg) en sulfadoxine (25 mg / kg) om bacteriële infectie te voorkomen. Plaats het dier in de mobiele homecage. Klem de metalen houder in het hoofd fixatie arm. Reinig en ontsmet de geïmplanteerde tandheelkundig cement "cap" en dekking van glas met behulp van een 70% ethanol-oplossing of 0,5% chloorhexidinedigluconaat en laat ze drogen. Langzaam en voorzichtig verwijder het deksel glas uit de metalen houder. Vernieuw de corticale buffer aangevuld met penicilline, streptomycine en reinig de craniale venster van puin met een steriele hemostatische tampon. Plaats de massa-elektrode in de corticale buffer. Plaats de elektrofysiologie headstage in een micromanipulator. Fabriceren pipetten van borosilicaatglas, gericht op het puntje weerstand variërend van 6,5 tot 8.5MΩ. Vul de patch pipet met een intracellulaire oplossing. De samenstelling van de patch pipet oplossing is debedraagt ​​(in mM): 8 KCl, 111 K-gluconaat, 0,5 CaCl2, 2 NaOH, 10 glucose, 10 HEPES, 2 Mg-ATP en 5 BAPTA werd de pH ingesteld op 7,2 met KOH. De membraanpotentiaal waarden moeten worden gecorrigeerd voor een berekende vloeibare kruising potentieel van -12 mV 33. Target het interessegebied middels stereotaxische coördinaten en snel naar de elektrode in de hersenen en met een sterk positieve druk op de pipetpunt. Na de dura mater penetratie en de pipet positionering, meet de punt weerstand en gooi de elektroden dat een toename van de weerstand van meer dan 10-15%, om het succes van de volgende stappen verbetering tonen. Verminder de positieve druk met de helft tot zwelling van het omliggende hersenweefsel voorkomen. Verdere stappen zijn vergelijkbaar met de standaard "blinde patch" protocol. Een neuron opnemen vinden, laat de punt in de hersenen stapsgewijs tot een neuron wordt gedetecteerd in een nauwe proximity van de pipetpunt, zoals aangegeven door een karakteristieke temporele opeenvolging elektrode impedantieveranderingen. De bepalende factor voor de aanwezigheid van een neuron is een monotone toename elektrode weerstand tussen verschillende opeenvolgende stappen voorwaarts van de pipet (gewoonlijk een toename van 20% van de pipet weerstand over drie 2-micrometer stappen). Om een ​​gigaseal contact met de beoogde neuron vormen, breng dan een negatieve druk en hyperpolarisatie van de pipet. Breng een korte puls van een grotere negatieve druk op de cel om het gehele-cel configuratie vast. Trek de elektrode met 2-3 um om een ​​goede afdichting te houden. Opnemen spontane of opgewekte activiteit gedurende een gewenste tijdsduur, maximaal 20-40 minuten. Na het opnemen, verwijder de pipet uit de hersenen. Vernieuw de corticale buffer of een druppel van siliconen lijm op de craniale venster, dan lijm een ​​ronde glazen dekglaasje op de top van de metalen houder. Laat de animal uit het hoofd fixatie arm door het losdraaien van de schroeven. Zet de dier zijn kooi ten minste een dag voor de volgende opname. Analyseer gegevens met, bijvoorbeeld, de FitMaster software. Gewenning-dishabituation Reuk Test in Awake Muis bewegen de Mobile Homecage Bevestig een schone katoenen stuk (2 x 2 cm) gedoopt in leidingwater aan de binnenzijde van de wand van de mobiele homecage behulp van een dubbelzijdig tape. Verdeel de mobiele homecage muur in vier zones door het plaatsen kleurmarkeringen aan de buitenzijde van de wand, zodat het stuk katoen is gelegen in het midden van de "doelzone". Bevestig het dier in de headholder arm naar de muur segment tegenover het "target"-zone en laat het aan te passen aan de mobiele homecage gedurende 30 minuten. Neem een ​​ander stuk van schone katoenen en bevochtig het met een paar druppels van de 1% vanille-extract. Vervang de schone katoenen op de mobiele homecage muur met degene die de Vanilla geur. Presenteer de geur gedurende 5 minuten. Volgen de bewegingen van de mobiele homecage tijdens de geur presentatie periode. Schat de belangstelling de geur door meting van de totale tijd dat het dier besteedt tegenover de "target" zone van de totale tijd van de mobiele homecage beweging. Herhaal de 5-min toepassing sessie drie keer met de geur van vanille, met een 5 min inter-sessie interval. Gebruik een vers stukje "vanilla" katoen in elke sessie. Presenteer het dier met een maatschappelijk belangrijke geur tijdens de laatste, vijfde sessie. Bevochtig een schoon stuk katoen met enkele druppels urine (verkregen op de vorige dag van een dier van het andere geslacht) en plaats deze in het midden van de doelzone gedurende 5 minuten. Nieuwe geur erkenning in wakkere muis het bewegen rond de mobiele homecage Verdeel de muur in vier zones door het plaatsen kleurmarkeringen aan de buitenzijde van de mobiele homecage muur. Attach twee schone katoenen stukken (2 x 2 cm) ondergedompeld in kraanwater om de binnenzijde van de wand in het midden van de zone tegenover elkaar (aangeduid als doelzone 1 en target zone 2). Bevestig het dier de headholder arm tegenover een wandsegment buiten de doelzones en laat het aan de mobiele homecage gedurende 30 minuten. Vervang beide katoenen stukken met de verse op:. Plaats een katoenen stuk nat met de 1% vanille-extract tot zone 1 te richten en een andere nat met kraanwater tot zone 2 doelrecord de video van de mobiele bewegingen homecage gedurende 10 minuten tijdens de geur presentatiesessie. Bereken de geur bijwonen als het percentage van de tijd dat het dier besteedt geconfronteerd doelzone 1 ten opzichte van de totale tijd besteed geconfronteerd zones 1 en 2. Na een 10 minuten interval, plaats nog een paar applicators op de homecage muur voor de daarop volgende periode van 10 minuten. Plaats de "vanilla" katoen in hartslagzone 1 en katoenen applicator nat met 1% banaan extract in hartslagzone 2. Maak een video-opname van de mobiele bewegingen homecage. Bereken de voorkeur om nieuwe geur als het percentage van de tijd dat het dier besteedt naar de muur segment met de nieuwe geur (doelzone 2) ten opzichte van de totale tijd geconfronteerd zones 1 en 2.

Representative Results

De hier gepresenteerde methode is bedoeld voor microscopische beeldvorming of eencellige elektrofysiologische opnames in wakker, hoofd vast maar verder vrij-bewegen en gedragen muizen. Het dier kan bewegen in twee dimensies in een echte (in tegenstelling tot virtuele), tastbaar en vertrouwde omgeving, terwijl de schedel dieren stevig bevestigd aan het hoofd fixatie arm. Habituating de muizen om de lucht getild mobiele homecage bestaat uit 4-6 dagen van tweemaal daags 2-uur trainingen (figuur 1). De getrainde dieren kunnen vervolgens worden gebruikt in de experimenten onmiddellijk. Een kenmerkend onderzoek omvat een aantal beeldvormende sessies of patch-clamp opnames die met een tussenafstand variërend van enkele uren tot enkele dagen of weken. Belangrijk is dat zowel optische en electrofysiologische opnamen gelijktijdig worden uitgevoerd met cognitieve of gedragsmatige stimuli en uitlezingen binnen een enkel experiment. Om de mechanische stabiliteit van evaluerenmouse hoofd fixatie in de mobiele homecage de beeldsequenties van corticale vaartuigen gelabeld met fluorescerende-geconjugeerde dextran en corticale dendrieten expressie YFP verzameld terwijl de proefdieren navigeert de mobiele homecage (figuur 2). De maximale verplaatsing van de hersenen gedurende beweging dier niet typisch overschrijden 1-1,5 micrometer. Deze verplaatsingen opgetreden in de horizontale richting en zeer zelden resulteerde in een aantoonbare verschuiving van het beeldvlak, waardoor onnodige eventuele correctie van bewegingsartefacten. Stabiel hoofd fixatie in mobiele homecage maakt kwantificering van individuele vertakte stekels in wakkere dieren met dezelfde betrouwbaarheid als in verdoofde muizen. Dendritische spine-dichtheid, morfologie en omzet kunnen worden gecontroleerd tijdens longitudinale studies met meerdere beeldvormende sessies uitgevoerd met tussenpozen van enkele uren tot enkele dagen of weken. De bruikbaarheid van de mobile homecage functionele optische beeldvorming werd getest somatosensorische cortex van muizen wakker met twee benaderingen: i) twee-foton microscopie op Thy1-GCaMP3 transgene muizen en ii) intrinsieke lichtsignaal beeldvorming in wild-type muizen. Ca 2 + imaging werd uitgevoerd in laag 2/3, welke cel lichamen van vele fluorescent gelabelde neuronen, evenals hun dendrieten en axonen (figuur 3) bevat. De grafieken van fluorescentie-in-tijd van geselecteerde gebieden van belang (ROI) worden getoond in Figuur 3, waaruit spontane neuronale activiteit (gemeten als tijdelijke toename GCaMP3 fluorescentie) in de muis actieve navigatie in het mobiele homecage. Optische beeldvorming op basis van intrinsieke signalen laat kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van functionele domeinen. Figuur 4 illustreert golfachtige veranderingen in het bloed oxygenatie niveau (waarin regionale neuronale activatie) die voortgeplant langs somatosensorische cortex in reactie op vibrissa stimulatie bij de frequentie van 0,05 Hz. Om de haalbaarheid van patch-clamp opnames met mobiele homecage testen, gebruikten we 2-3 maanden oud C57BL/6J-muizen. Layer 2/3 neuronen in somatosensorische cortex werden geregistreerd uit in whole cell configuratie met stroomtang modus. Patch-clamp-opname in de hersenen van muizen wakker-hoofd vast op mobiele homecage wezen gelijkwaardig was aan patch-klemmen blind in de hersenen plakjes. Ongeveer 50% van de pogingen geresulteerd in succesvolle gigaseal vorming, waarvan meer dan 70% leverde stabiele whole-cell configuratie opnemen. Geen gebeurtenissen verliezen gigaseal contact door mechanische verplaatsing van cellen waargenomen. Figuur 5 illustreert een 60-seconden fragment van een representatieve 10-minuten lange stroom-klem opname gecorreleerd met episoden van muis actieve (lopen) en passieve (rust) toestanden. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in"src = "/ files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" width = "600" /> Figuur 1. Werkwijze hoofd fixatie van wakker muizen in de mobiele homecage. A) Overzicht van de lucht getild mobiele homecage ontwerpen en illustraties van het algemene concept. B) Diagram van een typische experimentele tijdlijn. De studie begint met de implantatie van de craniale venster twee weken voorafgaand aan habituating de muis te hanteren en verpakking, die wordt gevolgd door acht tweemaal daagse trainingen. De typische studie omvat een aantal beeldvormende sessies of patch clamp opnames die met een tussenafstand variërend van enkele uren tot enkele dagen of weken. Zowel optisch als elektrofysiologische metingen kunnen worden gedaan in parallel met cognitieve of gedragsproblemen stimuli en uitlezingen binnen een enkel experiment. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "altijd"> Figuur 2. Voorbeeld van twee-foton microscopische beeldvorming over wakker muizen bewegen rond de mobiele homecage. A, B) Corticale vasculatuur, gelabeld met het 70 kDa Texas Red-geconjugeerd dextraan. De diameter van de afzonderlijke segmenten schip gemeten door het uitzetten tijd het profiel van de in het lumen van het vat getrokken tijdens perioden van rust muis en actief (A). De snelheid van de bloedstroom in de slagaders en aders wordt gemeten door leiding aftasting langs de getrokken evenwijdig aan de vaatwand (B). C, D) Fijne details van neuronale morfologie zichtbaar in de hersenen van transgene muizen die YFP uiten subpopulatie regels neuronen onder de Thy1 promotor. Drie-dimensionale reconstructie van piramidale neuronen in muis somatosensorische cortex (C). De beelden van een dendritische branch verworven in een wakker, gedraagt ​​de muis zijn voldoende stabiel voor de kwantificering van individuele dendritische wervelkolom morfologie (D). E) Kwantificering van de hersenen de beweging veroorzaakt door bewegingen van de muis. Grotere amplitude verplaatsingen correleren met perioden van de muis draait. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3. Voorbeeld van neuronale activiteit in de bevolking wakker Thy1-GCaMP3 muis te bewegen rond de mobiele homecage. A) Twee-foton beeld van corticale laag II / III neuronen. ROI, bijvoorbeeld neuronale cellichamen, dendrieten en axonen worden in geel weergegeven. B) AF / F sporen van de GCaMP3 fluorescentie van ROI's getoond in A (tijd series opgenomen 1.5 sec / frame). C) Ingezoomde gebied dat wordt afgebeeld op 65 msec / frame. D) Fluorescentie van geel ROI C uitgezet in de tijd, wordt de tijdelijke verhogingen (rood) in de GCaMP3 fluorescentie die overeenkomen met de maatregelen potentiële geïnduceerde Ca 2 + influx afleveringen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4. Voorbeeld kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van functionele responsen in de cortex van een wakkere muis door middel van beeldvorming van de intrinsieke optische signalen. A) Bright-gezichtsveld van de oppervlakkige bloedvaten door het craniale venster. B) Hoogte kaart van de basislijn activiteit in mobiele homecage tijdens een 6-min episode. C) Hoogte kaart van neuronale activiteit teeltmateriaal langs somatosensorische cortex in reactie op de vibrissa stimulatie met een frequentie van 0,05 Hz. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 5. Voorbeeld van een whole-cell patch-clamp-opname in de cortex van een wakkere muis te bewegen rond de mobiele homecage. A) Current-clamp opname van een neuron in de muis corticale laag 2/3. 0,5 sec, 100-pA huidige injectie (onder het spoor aangegeven) resulteert in een uitbarsting van actiepotentialen. De cel bleek piek frequentie aanpassing kenmerkend voor piramidale neuronen. B) Continue stroom-clamp-opnameuit dezelfde neuron gecorreleerd met de muis 'bewegingsactiviteit (weergegeven in roze boven de sporen). Vertegenwoordiger spontane activiteit van de laag 2/3 neuron tijdens periodes van de muis rust (C) en actief (D). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6. Animal gewichtsverlies en bewegingsactiviteit van head-fixed/non-fixed muizen tijdens de trainingen in de mobiele homecage. A) Animal gewicht (gemiddelde + SD,%) voor de training sessies. Merk op dat het gewichtsverlies is volledig omgekeerd door de 7-8 ste trainingssessie. B) Traject van de muis horizontaal motoriek ten opzichte van de mobiele homecage,die werd afgeleid uit de bijgehouden beweging van de mobiele homecage gedurende 8 ste trainingssessie. C) Rups bewegingen van een niet-hoofd-vaste muis verkennen van de ronde kooi tijdens de 8 ste trainingssessie. D) Duur van de kop vast (cirkel) en niet-vaste (driehoek) muizen beweging tijdens 1-4 ste dag van de opleiding (gemiddelde + SD,%). Merk op dat, op dag 4,-head vaste muizen noch bevriezen (zoals op dag 1), noch buitensporig in bewegingsactiviteit te geven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Om een ​​beter begrip hersenen fysiologie en pathologie moet onderzoek worden uitgevoerd op verschillende niveaus preparaat complexiteit gebruikmaking van de meest geschikte technieken voor elk preparaat. Op dit moment zijn een breed scala van de neurowetenschappen methodieken (van full-body fMRI om suborganel STED microscopie) gemakkelijk toegepast op verdoofde dieren, terwijl experimenten met wakker en gedraagt ​​dieren een aanzienlijke methodologische uitdaging zijn vertegenwoordigd.

Hier wordt een nieuwe aanpak beschreven waarbij een proefdier, ondanks het feit dat stevig hoofd-vast, kun je verplaatsen over een van airconditioning opgeheven mobiele homecage en tastbare omgeving te verkennen onder stress-vrije omstandigheden. Het-hoofd vaste gedragen dier voorbereiding hier gepresenteerde biedt een aantal cruciale voordelen. Eerste, elektrofysiologische of beeldgegevens verkregen met deze methode zijn compromisloze noch door anesthesie noch door-perken veroorzaakte stress. Positionering van de muis in de stacaravankooi is snel en vereist geen verlamming van het dier zelfs kortstondig. Ten tweede, de lucht tilde homecage zorgt voor de mechanische stabiliteit die nodig is om veranderingen in de fijne neuronale morfologie kwantificeren en eencellige elektrofysiologische activiteit opnemen in wakkere dieren. Tenslotte ontwerp mobiele homecage is compacter in vergelijking met de sferische loopband, waardoor het positioneren van het mobiele homecage onder een standaard microscoop rechtop twee-foton imaging of patch-clamp-opname in de hersenen wakker muis.

Firm hoofd fixatie in de mobiele homecage vereist implantatie van een speciaal viervleugelige metalen houder met een ronde opening in het midden voor optische of elektrische toegang tot de onderliggende hersengebied. Deze metalen houders worden door een combinatie van lijm, tandcement en een kleine bout geschroefd in het schedelbeen aan de schedel bevestigd. De chirurgische procedure werd ontwikkeld gebaseerd op een groot aantal eerdergepubliceerde werkwijzen, en bleek te resulteren in een stabiele en reproduceerbare craniale raam bereiding. Voor in vivo elektrofysiologische experimenten, een maan-vormig venster 34, een klein formaat craniotomie (minder dan 0,5 mm) 32, en een geboord met glas overdekt voorbereiding 35 zijn gebruikt. Hier is de "omgekeerde" craniale venster geïmplanteerd met ofwel een grote (3,5 mm diameter) en kleine (minder dan 0,5 mm) craniotomie. Het minimaliseren van de hersenen beweging is van cruciaal belang voor een stabiele cel-opnamen, en daarom is het raadzaam om kleine formaat craniotomies voeren voor elektrofysiologische experimenten. Na implantatie van de craniale venster voor optische beeldvorming experimenten worden de dieren om te herstellen gedurende tenminste 2 of 3 weken, gedurende welke periode het eerste venster tijdelijk verliest de transparantie en herwint het (met 50-70% opbrengst, afhankelijk de genetische achtergrond van de muizenstam). Transparantie van de craniale raam en stabilteit van de tandheelkundige cement "cap" die aan de schedel kan worden geverifieerd door middel van een regelmatige binoculair microscoop en fysieke inspectie tijdens de handling van dieren. Aan het eind van de 2-3 weken herstelperiode moet de dieren die tekenen van residuele postoperationele ontsteking of mechanische defecten vertonen op tandheelkundig cement uit de experimenten worden uitgesloten en beëindigd.

De optimale leeftijd voor het trainen van de muizen 2-4 maanden (overeenkomend met het lichaamsgewicht van 20-40 g). Bij jongere dieren kunnen verankering van de tandheelkundige cement "cap" aan de schedel onbetrouwbaar zijn, dat zijn veerkracht kan afnemen om de mechanische belasting die wordt opgelegd door de motoriek van het hoofd vast muis in de mobiele homecage. Hoewel mannelijke en vrouwelijke muizen lijken eveneens bereid navigeren in mobiele homecage er een tendens om betere percentage craniale ramen herwinnen van de doorzichtigheid bij vrouwelijke muizen (gegevens niet getoond) verkrijgt. Vandaar dat, om to zorg voor een evenwichtige mix van geslachten in het cohort van geselecteerd voor beeldvorming dieren, implanteren craniale ramen in ongeveer 30% meer mannelijke muizen wordt aanbevolen. Sociale interacties zijn bekend bij de dieren welzijn te verbeteren en stress te verminderen, daarom is het raadzaam dat nestgenoten worden geëxploiteerd en getraind in parallel en bij elkaar gehouden in groepshuisvesting kooien.

In tegenstelling tot de gepubliceerde voor de sferische loopband bereiding 13 procedures, is de methode waarbij de mobiele homecage vereisen verlamming van de muis op het moment van hoofd fixatie. Dit verschil is van belang omdat het mogelijk maakt om elke resterende effecten dat zelfs een korte en "light" anesthesie episode kan hebben op de fysiologische metingen kort na verkregen. Zelfs hoewel de studies waarbij hoofd fixatie werd uitgevoerd onder verdoving en het werkelijke experimenten werden begonnen na een korte wachttijd 13, kan men nietmogelijke langdurige effecten van de korte verdoving episode op de experimentele gegevens uit te sluiten. Andere studies hebben zich op watertekort voor systematische gewenning van de dieren aan het hoofd fixatie en gebruikt water beloning als middel om het motiveren van de dier onbeweeglijk 36 te blijven. Echter, beperkt de beloning gebaseerd hoofd fixatiemethode de keuze van het toepasselijke gedrags-tests en, belangrijker nog, gevestigd in een van de gevestigde stimulus-beloning associaties. Daarentegen wordt de methode van de muis gewenning aan fixatie hoofd in mobiele homecage niet watertekort en de daaropvolgende beloning nodig.

Aanvulling van de mobiele homecage met een water levering systeem wordt aanbevolen voor langdurige experimenten. Het dier trainingen en experimenten hier gepresenteerd werden gedaan overdag (08:00-18:00), wat overeenkomt met de fysiologisch passieve periode voor die muizen die worden gehouden onder de standaard 12-uur licht schema (liGHTS op om 6 uur en uit op 6:00). Aangezien de inname van water direct wordt geassocieerd met de activiteit van de muis, in de passieve periode muizen vereisen geen water levering, indien de duur van een opleiding / beeldvorming / opnamesessie niet meer dan 2 uur. In aanvulling op het tijdstip en de duur van de trainingen, moet men het probleem van het optimale aantal sessies nodig voor habituating de dieren naar mobiele homecage pakken. Daartoe werden twee criteria gebruikt om de stress veroorzaakt door het hoofd fixatie procedures evalueren: i) gewichtsverlies, en ii) bewegingsactiviteit niveau. Zoals getoond in figuur 6, gewichtsverlies bereikt het gemiddelde van 6% op training dag 2 en wordt volledig omgekeerd door training dag 4 (figuur 6A). In overeenstemming met het wegen dynamiek, de bewegingsactiviteit niveau van-kop vaste dieren onderdrukt wordt op de eerste dag van de opleiding, maar stabiliseert door trainingsdag 4 (Figuur 6D). Op basis van deze metingen, we suggestiest de minimale duur van de muis stage op mobiele homecage is 4 dagen, zoals beschreven in het protocol wordt.

Gebruik van de lucht getild, vlakke vloer mobiele homecage maakt het toevoegen van complexe taken (sensomotorische, perceptuele en cognitieve) om de opleiding paradigma's voor-hoofd vast muizen. In de onderhavige studie twee protocollen van gedragstesten gepresenteerd. Beide protocollen maken gebruik van geur-signalen en kan gecombineerd worden met longitudinale beeldvorming / opnames in de muis cortex. Hoewel de mobiele homecage is vervaardigd uit niet-absorberend materiaal, moet men nog steeds rekening worden gehouden met mogelijke interferenties tussen de geur van het apparaat en testen geur (s). Een andere factor die kunnen interfereren met visuele / tactiele signalen van een gedrags-experiment is de kruising tussen de muur en het inzetstuk, die niet naadloos en kan dus door het dier worden gezien als een mijlpaal. Het is het vermelden waard dat hier, om de nood dier minimaliseren tijdens dergelijke interventions de plaatsing van een geur presenteren katoen mobiele homecage wand, moet de experimentator oefenen om dergelijke interventies zo snel mogelijk uitgevoerd en vermijd langdurige behandeling van de koolstof kooi. Alternatieve strategieën voor nieuwe presentatie geur / object denkbaar, bijvoorbeeld het plaatsen hydrogel gebaseerde oplossing verlaagt of objecten (zoals voedsel chips) op kleine planken bevestigd aan het binnenoppervlak van de koolstof kooi wand ter hoogte geschikt kop positionering van het dier.

Mobile homecage laat-head vaste dieren aan een breed scala van twee-dimensionale bewegingen waaronder horizontale voortbeweging, situp, verzorging, kloppen, likken, neus-prikken, geschoolde voorpoot bewegingen, en de muur aanraken met voorpoten, zoals geïllustreerd in de huidige studie uit te voeren . Het gebruik van mobiele homecage en de hier gepresenteerde protocollen, kunnen onderzoekers de sensomotorische neuronale systeem bestuderen met een hoge mate van controle over zowel de stimulatie condities en de gedrags-read-outs. Bovendien kan onderzoek naar cognitieve vaardigheden in wakkere muizen worden uitgevoerd tijdens het conditioneren, ruimtelijke navigatie en besluitvorming taken.

Er zijn verschillende praktische beperkingen van deze methode. Eerst wordt een aanzienlijke hoeveelheid perslucht nodig-homecage hefvermogen bereiken en langdurige experimenten. Ten tweede, de mobiele homecage in de huidige uitvoering is slechts 18 cm diameter en derhalve een relatief kleine en eenvoudige ruimte in vergelijking met virtual reality, waarbij een complexe experimentele omgeving kan worden ontworpen zonder ruimtelijke beperkingen. Ten derde, tijdens snorhaar stimulatie en beloning op basis van experimenten hier wordt gepresenteerd, is een apparaat dat wordt gebruikt dat de mogelijkheid van de muur-aanspreekpunt voor de muis beperkt. Toevoeging van een externe visuele of zintuiglijke stimulatiekanaal (zoals een oog gericht licht projector) zou vereisen ontwerpen van een meer ergonomisch en compact apparaat ten opzichtehet meervoudige scherm of dome projectie oplossingen zijn gebruikt in de sferische loopband experimenten.

Samengevat, het gebruik van de vaste kop-muizen bewegen in de lucht opgeheven mobiele homecage vergemakkelijkt de studies die cellulaire, moleculaire en gedragsmatige niveaus van waarneming en manipulatie in een enkel experiment te combineren. Specifieke toepassingen hier geïllustreerd omvatten twee-foton microscopische beeldvorming, intrinsieke optisch signaal beeldvorming en patch-clamp opnames in niet-verdoofde gedragen muizen. De verwachting is dat deze aanpak nieuwe perspectieven zal openen in experimenten op wakker, gedragen muis en dienen als een nuttig instrument om de ontwikkeling van geneesmiddelen en fundamenteel onderzoek van de hersenfunctie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs danken prof. Eero Castren voor zijn waardevolle commentaar op het manuscript. Het werk wordt ondersteund door subsidies van de Academie van Finland, Centrum voor Internationale Mobiliteit van Finland en de Finse Neurowetenschappen (Brain and Mind Doctoral Program).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Tweezers  Stainless Steel, 115mm XYtronic XY-2A-SA
Animal trimmer, shaving machine Aesculap Isis GT420
Binocular Microscope Zeiss  Stemi 2000
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad Supertech TMP-5b
Blunt microsurgical blade BD REF 374769
Borosilicate tube with filament Sutter Instruments BF120-69-10 For patch pipette production
Camera  Foscam FI8903W Night visibility
Carprofen Pfizer Rimadyl vet
Dental cement DrguDent, Dentsply REF 640 200 271
Dexamethasone FaunaPharma Rapidexon vet
Disposable drills Meisinger HP 310104001001008
Dulbeco’s PBS 10X Sigma D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm FST 91150-20
Eyes-lubricant Novartis Viscotears For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion 
Foredom drill control Foredom  FM3545
Foredom micro motor handpiece Foredom MH-145
Four-winged metal holder Neurotar
Head Holder for Mice Narishige SG-4N Assembled on stereotaxic instrument
Hemostasis Collagen Sponge Avitene, Ultrafoam BARD Ref 1050050
Imaris Bitplane
Ketamine Intervet Ketaminol vet
Kwik-Sil  WPI
Mai Tai DeepSee laser Spectra-Physics
Micro dressing forceps, 105 mm Aesculap BD302R
Microelectrode puller Narishige PC-10H Vertical puller for glass pipette production
Micromanipulator Sensapex
Mini bolt Centrostyle Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5
Mobile Homecage Neurotar
Multiphoton Laser Scanning Microscope Olympus FV1000MPE
Nonwoven swabs 5×5 Molnlycke Health Care Mesoft Surgical tampons
Polyacrylic glue Henkel Loctite 401
Round glass coverslip  Electron Microscopy Sciences
1.5 thickness 
Small animal stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900
Student iris scissors, straight 11.5 cm FST 91460-11
Xylazine Bayer Health Care Rompun vet
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329, 959-964 (2010).
  2. Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).
  3. Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903-912 (2001).
  4. Piyawattanametha, W., et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).
  5. Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).
  6. Fee, M. S. Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals. Neuron. 27, 461-468 (2000).
  7. Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats. Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).
  8. Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
  9. Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80, 371-384 (2013).
  10. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).
  11. Parry, T. J., McElligott, J. G. A method for restraining awake rats using head immobilization. Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).
  12. Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex. Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).
  13. Van Looij, M. A. J., Liem, S. -. S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing research. 193, 75-82 (2004).
  14. Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition. The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).
  15. Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).
  16. Crochet, S., Petersen, C. C. H. Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice. Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).
  17. Houweling, A. R., Brecht, M. Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex. Nature. 451, 65-68 (2008).
  18. Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice. Nature. 454, 881-885 (2008).
  19. Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).
  20. De Kock, C. P. J., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).
  21. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
  22. Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements. Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).
  23. Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents. J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).
  24. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67, 1048-1061 (2010).
  25. Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).
  26. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, 941-946 (2009).
  27. Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. How vision and movement combine in the hippocampal place code. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).
  28. Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).
  29. Holtmaat, A., et al. Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).
  30. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  31. Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  32. Garaschuk, O., Milos, R. -. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).
  33. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  34. Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity. The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).
  35. Polack, P. -. O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
  36. Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat–procedures and pitfalls. Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).

Tags

Flat-floored Air-lifted PlatformAwake Freely Moving RodentsNon-anesthetized Behaving MiceCellular And Cognitive NeurosciencesHead-fixed MouseTwo-photon Microscopic ImagingPatch-clamp RecordingsBehavioral TestsLearningHabituationNovel Object Recognition

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kislin, M., Mugantseva, E., Molotkov, D., Kulesskaya, N., Khirug, S., Kirilkin, I., Pryazhnikov, E., Kolikova, J., Toptunov, D., Yuryev, M., Giniatullin, R., Voikar, V., Rivera, C., Rauvala, H., Khiroug, L. Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents. J. Vis. Exp. (88), e51869, doi:10.3791/51869 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image