Activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs Répétition protocole d'amplification (TRAP) Dosage
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
La télomérase, une ribonucléoprotéique, est responsable du maintien de la longueur des télomères et donc la promotion de l'intégrité génomique, la prolifération et la durée de vie. En outre, la télomérase protège les mitochondries de stress oxydatif et confère une résistance à l'apoptose, ce qui suggère son importance possible pour le survivant de non-mitotique des cellules hautement actifs tels que les neurones. Nous avons démontré précédemment la possibilité de nouveaux activateurs de la télomérase pour augmenter l'activité de la télomérase et d'expression dans les diverses régions du cerveau de la souris et pour protéger les cellules des neurones moteurs du stress oxydatif. Ces résultats renforcent l'idée que la télomérase est impliqué dans la protection des neurones à partir de diverses lésions. Pour souligner le rôle de la télomérase dans le cerveau, nous comparons ici l'activité de la télomérase dans le cerveau mâle et femelle souris et sa dépendance à l'âge. test TRAP est un procédé standard pour la détection de l'activité de la télomérase dans différents tissus ou lignées cellulaires. Ici, nous démontrons l'analysis de l'activité télomérase dans les trois régions du cerveau de souris non dénaturant par extraction de protéines à l'aide de CHAPS tampon de lyse suivi d'une modification de la méthode TRAP standard.
Dans cet essai, deux étapes, la télomérase endogène s'allonge un substrat spécifique de la télomérase (TS d'amorce) en ajoutant 6 répétitions TTAGGG pb (réaction de télomérase). Les produits de la réaction de télomérase sont amplifiés par réaction de PCR créer une échelle d'ADN de six incréments de pb. L'analyse de l'échelle de l'ADN est effectué par 4,5% en haute résolution électrophorèse sur gel d'agarose suivie par une coloration avec très sensible aux taches d'acide nucléique.
Par rapport à la méthode TRAP traditionnels qui utilisent marqué au 32P radioactif dCTP de la détection de l'ADN et de polyacrylamide électrophorèse sur gel de résolution de l'échelle de l'ADN, ce protocole offre un gain de test TRAP pour évaluer l'activité de la télomérase dans le cerveau de la souris, ce qui démontre la capacité de temps de non-toxique détecter des différences dans telomerasl'activité dans les différents e région du cerveau de la souris mâle et femelle.
Introduction
La télomérase est une ribonucléoprotéine composé de télomérase transcriptase inverse (TERT), la sous-unité catalytique de la télomérase, et un composant d'ARN (TERC). Le rôle canonique de la télomérase est de préserver la bonne longueur des télomères en ajoutant des séquences répétitives (TTAGGG) aux extrémités télomériques, favorisant ainsi l'intégrité du génome, et une prolifération cellulaire. Autres rôles ont été attribués à TERT dans les cellules, c'est à dire qu'il confère une résistance à l'apoptose induite par divers agent endommageant 2, protège les cellules souches mésenchymateuses humaines du stress oxydatif 3, et joue un rôle pro-survie dans les neurones complètement différenciées par son association à TIA1 ARN positif 4 granules.
TERT et est exprimé principalement actif dans les cellules somatiques et de division dans la plupart des types de cancers, alors que les niveaux d'expression et l'activité enzymatique sont étroitement régulés dans les cellules ne se divisant pas 5,6. Des études ont montré que dans le rcerveau Odent, l'activité de la télomérase devient indétectable par jour postnatal 10, tandis que TERT ARNm est maintenue à des niveaux inférieurs à l'âge adulte 7. D'autres études ont démontré l'activité télomérase à l'intérieur de la zone sous-ventriculaire adulte, le bulbe olfactif, l'hippocampe et dans le cervelet et le cortex adulte 8. Nous avons récemment démontré que les nouveaux composés qui augmentent l'expression et l'activité de la télomérase dans le cerveau et la moelle épinière des cordons exercent des effets neuroprotecteurs de la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) – souris injectées, ont retardé l'apparition et la progression de la maladie de sclérose latérale amyotrophique dans SOD1 transgénique souris et augmente la survie des motoneurones dans la moelle épinière de ces souris 9. Pour bien comprendre le rôle pro-survie de la télomérase dans les neurones et dans le cerveau, il est essentiel de développer un test rapide simple et relativement sensible pour la détection de l'activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau.
Le télomérique rprotocole d'amplification épéter (TRAP) est un essai sensible bien connu combinant l'activité de la télomérase canonique et la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Dans cet essai, la télomérase ajoute TTAGGG répète sur un substrat de la télomérase (TS amorce) oligonucléotide, suivie d'une amplification PCR qui génère des 6 paires de bases (pb) échelle d'ADN à l'aide du TS amorce inverse -. ACX marqué au 32P dCTP son sont utilisés pour détecter le faible quantité de produits de PCR. L'échelle d'ADN est résolu par électrophorèse sur gel de séquençage de Polyacrylamide (PAGE). Tant l'intensité des bandes d'ADN et la longueur de l'échelle d'ADN reflètent la quantité de molécules d'enzymes actives et leur aptitude à la maturation, respectivement 10.
Cette analyse traditionnelle détient des difficultés majeures: Le danger de l'exposition à des substances radioactives, de grandes et difficiles à gérer séquençage PAGE et la consommation de temps de gel fonctionnement et l'exposition du film du produit radioactif (nuit dans les deux cas). </p>
Ce protocole offre un test d'agarose non radioactif amélioration mini-gel à base. Le pb échelle ADN 6 est résolu en utilisant un gel à 4,5% d'agarose à haute résolution et la détection est réalisée en utilisant très sensible aux taches d'acide nucléique. La combinaison de l'utilisation à haute résolution d'agarose des mini-gel et sensible aux taches d'acide nucléique propose dosage facile à manipuler, permet d'éliminer le risque d'exposition à la radioactivité et de raccourcir considérablement la durée totale de l'essai de 3 jours à plusieurs heures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse de l'activité de la télomérase dans le cerveau de la souris par le test TRAP est constitué de quatre étapes principales: 1) l'extraction des protéines à partir de régions spécifiques du tissu cérébral 2) TS élongation d'amorce par la télomérase – réaction télomérase 3) l'amplification des produits de la réaction de télomérase par PCR 4 ) séparation des produits de PCR en utilisant un gel d'agarose de haute résolution.
Ce test TRAP modifié r?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
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