Summary

Neurones olfactifs obtenus à l'aide biopsie nasale combinée avec laser-Microdissection: Une approche potentielle pour étudier la réponse au traitement dans les troubles mentaux

Published: December 04, 2014
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Summary

Dans cette étude, une nouvelle plate-forme d'enquêter signatures moléculaires intraneuronaux de la réponse au traitement dans le trouble bipolaire (BD) a été développé et validé. Épithélium olfactif chez des patients BD a été obtenue par des biopsies nasales. Puis-microdissection laser a été combinée avec Temps réel RT-PCR pour enquêter sur la signature moléculaire de la réponse de lithium dans BD.

Abstract

Le trouble bipolaire (BD) est un trouble neuropsychiatrique sévère avec physiopathologie mal compris et généralement traité avec le stabilisateur de l'humeur, le carbonate de lithium. Les études animales ainsi que des études génétiques humaines indiquent que le lithium affecte cibles moléculaires qui sont impliqués dans la croissance neuronale, la survie et la maturation, et notamment les molécules impliquées dans la signalisation Wnt. Compte tenu de l'enjeu éthique à l'obtention de biopsies du cerveau pour étudier les changements moléculaires dynamiques associés avec le lithium-réponse dans le système nerveux central (SNC), on peut envisager l'utilisation de neurones obtenus à partir de tissus olfactifs pour atteindre cet goal.The épithélium olfactif contient des neurones récepteurs olfactifs à différents stades de développement et des cellules gliales comme des cellules de soutien. Cette offre une occasion unique d'étudier les changements dynamiques dans le SNC de patients atteints de maladies neuropsychiatriques, en utilisant le tissu olfactif obtenu en toute sécurité à partir de biopsies nasales. Pour pallier l'inconvénient posé par substcontamination antial de tissu olfactif biopsie avec des cellules non neuronales, une nouvelle approche pour obtenir des populations cellulaires enrichies neuronale a été développé en combinant biopsies nasales avec le laser capture microdissection. Dans cette étude, un système pour étudier les changements moléculaires dynamiques traitement associé dans le tissu neuronal a été élaboré et validé, en utilisant un petit échantillon pilote de patients BD recrutés pour l'étude des mécanismes moléculaires de la réponse au traitement au lithium.

Introduction

Le trouble bipolaire (BD) est un trouble neuropsychiatrique sévère, caractérisée par des changements pathologiques de l'humeur, le dynamisme et la cognition 1. Lithium utilisé pour le traitement de BD a été montré pour modifier les niveaux d'ARNm de l'état d'équilibre d'un grand nombre de gènes dans les études animales 2, mais il reste inconnu si l'un de ces molécules est associée à la réponse clinique chez l'homme 2. Comprendre le mécanisme de la réponse au lithium faudrait étudier les changements moléculaires induite lithium dans les tissus neuronaux. Malheureusement, il ne est pas pratique d'obtenir des biopsies du cerveau de patients BD pré et post-traitement lithium pour identifier les signatures moléculaires de la réponse au lithium. Les tissus du cerveau post-mortem ont été utilisés pour étudier des biomarqueurs en BD, cependant, ils ne peuvent pas être utilisés pour évaluer les marqueurs moléculaires associés à des changements dynamiques dans les émotions, la cognition et de conduire; et la validité de la réponse au traitement a posteriori déterminé de lithium peut être problématique 4. Lymphocytes et les autres cellules sanguines pourraient être utiles, mais les changements moléculaires dans les cellules de sang peuvent ne pas refléter les modifications neuronales 3-5. Liquide céphalo-rachidien peut être insuffisant pour obtenir des informations sur les molécules intracellulaires qui peuvent refléter des changements intrinsèques associées à la maladie et des médicaments réversible.

L'épithélium olfactif (OE) est un élément unique du système nerveux central (SNC), embryologiquement liés aux structures limbiques 6; et il est facilement accessible par biopsies nasales. Il est constitué de cellules gliales cellules comme des cellules de soutien (par exemple, sustentaculaires), basales proliférantes, et les neurones récepteurs olfactifs à différents stades de développement 9.7. Par conséquent, OE offre une occasion unique d'étudier de manière accessible changements dynamiques dans le SNC de patients atteints de maladies neuropsychiatriques 7. Des études démontrent l'utilité de l'OE comme un tissu de substitution pour l'étude des maladies associées événements qui reflètent ces occurring dans les neurones du cerveau 8,9. Par exemple, des études ont utilisé OE pour enquêter sur les profils moléculaires associés à des troubles psychiatriques 10-14. Système olfactif sert également à identifier endophenoytpes cliniques tels que des déficits olfactifs qui sont associés à des symptômes négatifs de la schizophrénie 15. En outre, les processus neurodéveloppementaux continuent dans le OE long de la vie, en fournissant un moyen utile pour modéliser la physiopathologie sous-jacente des conditions psychiatriques 8,9.

Cependant, un inconvénient de l'utilisation de ce tissu est la contamination importante des biopsies olfactifs avec des cellules non neuronales 16. Par exemple, l'ARN total utilisé pour les études d'expression génique dans des études précédentes OE contenait l'ARN extrait à partir de l'ensemble du tissu nasal biopsie comprenant l'ARN à partir de cellules non neuronales 17. Par conséquent, les approches précédentes ont été limitées par la qualité des cellules. Pour surmonter ce problème, une nouvelle approche pour obtenir populations de cellules neuronales enrichies en combinant biopsies nasales avec laser capture microdissection (LCM) a été élaboré 18.

LCM est une technique qui permet l'isolement sélectif des cellules en utilisant le découpage au laser UV combinée à infra-rouge de 19 à 21 laser. Combinant LCM à l'approche OE minimiser la contamination importante de OE par les cellules non-neuronales, améliorant ainsi l'enrichissement des cellules neuronales 18. En outre, la couche neuronale peut être distinguée de la couche de sous-muqueuse au microscope, ce qui élimine la nécessité d'une coloration. Types de cellules neuronales peuvent en outre être distinguées des autres populations de cellules en utilisant des anticorps primaires qui sont exprimés par le type d'intérêt 7 de la cellule. Par conséquent, cette procédure établit une méthode plus simple pour l'enrichissement de la population de cellules presque purement neuronale qui peut être utilisé pour des études d'expression génique, immunohistochimie et autres investigations morphologiques.

ve_content "> Cette étude vise à établir une plate-forme expérimentale pour étudier les changements moléculaires dans les neurones olfactifs associés à des états pathologiques et la réponse au traitement. Pour y remédier, un petit groupe de patients non-fumeurs qui ont rencontré les critères diagnostiques du DSM-IV pour BD basée sur l'interview diagnostique pour les études génétiques (DIG) 22 a été recruté pour subir deux biopsies nasales: une biopsie pré-traitement avec le lithium et le deuxième biopsie, après 6 semaines de traitement quotidien de lithium orale outre, les patients BD éligibles doivent être:. symptomatique de la dépression , sur la base marquant ≥10 sur 60 dans le clinicien administré Montgomery Asberg-Rating Scale (MADRS) 23; symptomatique pour hypomanie ou de manie, basé sur un score ≥10 sur 56 sur le clinicien administré Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. ≥10 ou sur les deux MADRS et YMRS coefficient évaluateur-Inter-évaluateur d'accord entre les cliniciens pour les deux échelles est> 0,96 Après biopsies, les neurones étaient enri.ched d'OE par LCM. Suite à des mesures supplémentaires de contrôle de la qualité, afin d'assurer l'extraction de l'ARN de haute qualité du tissu neuronal et l'enrichissement, en temps réel RT-PCR a été menée pour étudier les niveaux pré- et post-expression de traitement de gènes d'intérêt. Les sections suivantes contiennent une description de la validation de cette approche, soulignant l'optimisation du protocole et les stratégies qui ont été appliquées pour le dépannage du protocole.

Protocol

REMARQUE: Tous les bénévoles de recherche dans cette étude ont été administrés documents de consentement éclairé approuvés par la Commission de révision institutionnel de l'Université Howard et l'Université Johns Hopkins. Seuls les participants qui ont accepté en signant les documents de consentement éclairé ont été enrôlés dans l'étude. La base d'étude pour cette analyse a consisté à: 20 sujets (12 BD et 10 contrôles, 30% des hommes) et l'âge (sd) de 38,2 (14,1) ans signifie…

Representative Results

La stratégie de protocole et le dépannage dans l'étude des signatures moléculaires ont été optimisés avec succès. la qualité de l'ARN et les critères d'enrichissement neuronaux pour les échantillons à utiliser dans une analyse plus approfondie réel aval PCR en temps ont été normalisés. RIN et la concentration d'ARN ont été examinées comme des facteurs de confusion à des niveaux d'expression détectés. Sur la base de l'analyse de plusieurs échantillons avec RIN allant de 1 à…

Discussion

Une nouvelle plate-forme pour obtenir des couches de neurones olfactifs enrichis en combinant la biopsie nasale et LCM est présenté et a été validé dans cette étude. Cette technique peut avoir de vastes répercussions. Il peut être appliqué vers des études de biomarqueurs, y compris ceux pour la réponse au traitement, et les efforts de découverte de médicaments pour d'autres affections neuropsychiatriques, avoir un impact plus large dans le domaine.

Pour obtenir neurones de h…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by USPHS grants MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), and MH-096208 (K.I.), grants from DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. and K.I.), and Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. and K.I.).

We sincerely appreciate the efforts and contributions of Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema and Mark Christie towards coordination of the biopsy process.

Materials

Reagent Manufacturuer  Manufacturer Catalog #
Tissue Preparation
Tissue-Tek Cryomold Molds Sakura Finetek 4557
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura Finetek 4583
Cryosectioning
Membrane Slide 1.0 PEN (D) Carl Zeiss Microscopy 415190-9041-000
Rnase Zap Ambion AM9780
DEPC Treated Water Quality Biological 351-068-131
Microdissection
Microscope: PALM Series MicroLaser System Carl Zeiss Microscopy
Model: Axiovert 200M
Software: Robo v3.2
No.5 Dumont Microdissction Forceps Roboz RS-49085
RNA Extraction
RNAqueous Micro Kit Ambion AM1931
cDNA Synthesis
SuperScript III First Strand Synthesis Kit Invitrogen  18080-051
OMP qPCR
SYBR GreenER qPCR SuperMix Invitrogen  11760-500
Taqman qPCR
TaqMan Expression Assay Probes Applied Biosystems Various
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016

References

  1. Goodwin, F. K., Jamison, K. R. . Manic-depressive illness. , (1990).
  2. Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).
  3. Severino, G., et al. Pharmacogenomics of bipolar disorder. Pharmacogenomics. 14 (6), 655-674 (2013).
  4. Beech, R. D., et al. Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS). Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).
  5. Horiuchi, Y., et al. Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders. Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).
  6. Dryer, L., Graziadei, P. P. Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon. Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).
  7. Hahn, C. G., et al. In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium. J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).
  8. Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research. J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).
  9. Sawa, A., Cascella, N. G. Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia. Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).
  10. Mor, E., et al. MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients. Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).
  11. Kano, S., et al. Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia. Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).
  12. Toritsuka, M., et al. Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).
  13. Evgrafov, O. V., et al. Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders. Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).
  14. Fan, Y., et al. Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia. Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).
  15. Ishizuka, K., et al. Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test. Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).
  16. Sattler, R., et al. Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development. Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).
  17. Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations. BMC Genomics. 10, 572 (2009).
  18. Tajinda, K., et al. Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection. Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).
  19. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
  20. Fink, L., et al. Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking. Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).
  21. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  22. Nurnberger, J. I., et al. Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training. NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).
  23. Montgomery, S. A., Asberg, M. A new depression scale designed to be sensitive to change. Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).
  24. Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity. Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).

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Narayan, S., McLean, C., Sawa, A., Lin, S. Y., Rai, N., Hipolito, M. S., Cascella, N., Nurnberger, Jr., J. J., Ishizuka, K., Nwulia, E. A. Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders. J. Vis. Exp. (94), e51853, doi:10.3791/51853 (2014).

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