Unilaterale Pyramidotomy del corticospinale Tract in ratti per la valutazione delle terapie-neuroplasticità inducono

I tassi di sopravvivenza. In uno studio rappresentativo condotto da noi abbiamo avuto un tasso di sopravvivenza di 16 su 20 ratti femmina incappucciati Lister (da 200 a 250 g). La complicanza più comune è difficoltà respiratorie a causa dello spostamento della trachea o danni ai centri respiratori del tronco encefalico appena dorsale alle piramidi (solitarii nucleo, ambigue e parabrachilis). Risultati simili sono stati riportati in letteratura 16. Esiti comportamentali. Una serie di test comportamentali sono stati utilizzati per valutare il risultato sensomotorio dopo pyramidotomy nei roditori: il test di scala orizzontale, il singolo pellet raggiungimento di prova, la prova di allevamento cilindro e test della scala Montoya sono le valutazioni comportamentali più comunemente utilizzati. Altri test descritti in letteratura sono il pellet raggiungimento test, test corda, analisi del cammino e test nastro adesivo3,17-19. La maggior parte di questi mostrano un deficit motorio funzionale 1 settimana dopo infortunio. Attualmente, la maggior parte degli studi descritti in letteratura solo eseguire test comportamentali fino a 42 giorni 4,11,13,20,21, o per un tempo più breve 3,18,22. Abbiamo effettuato test comportamentali per un periodo prolungato di tempo e visto sostanzialmente pieno recupero della funzione motoria 8 settimane dopo pyramidotomy per alcuni dei test comportamentali, tranne il test della scala Montoya e test scaletta orizzontale. Questo è probabilmente per diversi motivi. In primo luogo, il CST rostrale infortunato alla lesione può formare sinapsi sui neuroni nel tronco encefalico che agiscono come relè indiretti a neuroni motori del midollo spinale. In secondo luogo, il illeso (controlaterale) CST possono germogliare e forme sinapsi sui neuroni del tronco encefalico e del midollo spinale che agiscono come relè di motoneuroni. In terzo luogo, gli altri tratti motori risparmiato come i tratti reticulospinal, vestibulospinal o rubrospinal possono assumere una qualche funzione. Così, una t durataeffetto RATTAMENTO è difficile da rilevare con molti test comportamentali nel modello pyramidotomy. Alcuni test comportamentali in questo modello però potrebbe indicare recupero accelerato subito dopo l'infortunio, che è legato ad un trattamento. Test Cilindro allevamento 3,4,23 Sulla base del test di allevamento cilindro CST corrispondente alla zampa anteriore dominante è stato ferito. I ratti sono posti in un cilindro di plexiglass e comportamento allevamento viene osservato per un periodo di 3 min. Prelesione c'era una leggera preferenza per l'uso di una zampa, zampa dominante, durante l'esplorazione verticale (Figura 3A). La lesione colpisce il lato dominante e l'uso della zampa controlesionale scesa al 28% a 1 settimana Determina postinjury (ripetute ANOVA p <0,05; post-hoc analisi ha rivelato animali hanno deficit significative a settimana 1, 2 e 3, p <0,05, Fisher LSD). 4 settimane postinjury gli animali recuperati und usato la zampa anteriore interessata per il 45% dei posteriori, e dopo 6 settimane questo era il 57% (n = 16, media ± viene visualizzato errore standard). Topi Analogamente, Starkey et al. (4) hanno valutato utilizzando il test del cilindro fino a 42 giorni dopo pyramidotomy e segnalato una significativa diminuzione dell'uso della zampa interessata per tutto il periodo di prova. Test Montoya Scala 24 Ratti richiedono preformazione per questo test per acclimatarsi prima di lesioni. Per aumentare la motivazione durante gli animali sessione di test sono cibo limitata a 15 g di cibo per ratti la sera prima. I ratti alimentari privati ​​sono posti nella scala Montoya per 15 min. Su ogni lato, vi è una scala di 7 gradini con pozzetti, ciascuno contenente 3 pellets. Il numero totale di pellet recuperati su ogni lato sono registrati. Il numero di pellet recuperati con la zampa anteriore controlesionale / colpita è diminuita significativamente dal 61% pre-lesione al3% 3 giorni postinjury (Figura 3B). La possibilità di recuperare pellet era ancora significativamente compromessa a 4 settimane postinjury con il 20% di pellet recuperati. Ratti mostrano un deficit significativo fino alla settimana 8 con solo il 29% dei pellet mangiato in quel momento (Misure ripetute ANOVA p <0.05, analisi post hoc ha rivelato animali hanno disavanzi significativi sul lato controlesionale a tutti settimane, p <0.05, Fisher LSD). Il zampe anteriori ipsilesionale è influenzato fino a 1 settimana postinjury; tuttavia questo recupera dalle seconda settimana (Misure ripetute ANOVA p <0.05, analisi post hoc ha rivelato animali hanno deficit significativi a Day 3 e Settimana 1 sulla zampa anteriore ipsilesionale, p <0.05, di Fisher LSD). I deficit iniziali della zampa anteriore ipsilesionale potrebbero essere spiegate con la lesione della parte ipsilaterale del tratto corticospinale che attraversa la piramide taglio, con conseguente germinazione e recupero. OrizzontaleTest Ladder 25 Ratti richiedono preformazione per questo test. Ratti a piedi tre volte una scala lunga 1 m con spaziatura gradino irregolare. I video vengono analizzati più avanti al rallentatore e il numero totale di piede scivola e manca di ogni zampa è quantificato. Il grafico in Figura 3C rappresenta il numero totale di mancate e slittamenti del lato colpito e meno interessato (forepaw + hindpaw) come percentuale del numero totale di passi effettuati. I ratti hanno un significativo aumento del numero di errori 1 settimana postinjury con il 10% o 11% sul lato interessato e sul lato meno colpite rispettivamente. Questo deficit è persistente sul lato controlesionale / colpiti fino alla settimana 8 con errori 10% fatta, però, si risolve nella parte ipsilesionale / meno colpite da 2 settimane (Misure ripetute ANOVA, analisi post hoc ha rivelato animali hanno disavanzi significativi a tutti settimane il lato controlesionale e disavanzi significativi a settimana 1 e 3 sul ipsilesionalelato, p <0.05, di Fisher LSD). Test elettrofisiologici In un terminale elettrofisiologico set-up l'animale è stato anestetizzato per via intraperitoneale con uretano. Durante il procedimento, è stato mantenuto a 37 ° C ± 1 ° C. La regione del collo ventrale, le sue zampe anteriori e regione toracica sono stati rasati e disinfettati con iodio macchia. Le piramidi sono stati esposti come descritto in precedenza e il nervo radiale è stata esposta nella parte superiore del braccio da un approccio ventrale incisione della pelle e il grande pettorale. L'estremità distale del nervo radiale è stato tagliato e il nervo fu posta su due fili argento Attacco elettrodi in un bagno di olio minerale. O piramide è stata stimolata con elettrodi bipolari concentrici a diverse profondità di 5 impulsi a 300 Hz e ampiezza crescente stimolazione. Le registrazioni sono state effettuate sempre dal nervo radiale del braccio disabili (Figura 4). Anim illesoals aveva una forte risposta a latenze tra 12 a 20 msec nel nervo radiale quando la piramide controlaterale è stata stimolata (Figura 4B). Stimolazione omolaterale traduce solo in attivazione occasionale (Figura 4C). Gli animali che hanno ricevuto precedenti pyramidotomies, sul lato controlaterale al braccio di registrazione mostrano alcuna risposta nel nervo radiale quando il tratto lesionato viene stimolata sopra della lesione (Figura 4B '). Tuttavia, la stimolazione delle fibre CST nelle piramidi ipsilaterale alla registrazione elettrodi hanno determinato una maggiore attivazione del nervo radiale rispetto agli animali illesi a 12 settimane postinjury (Figura 4C '). Risultati anatomici. Gli animali sono stati sacrificati 10 settimane dopo l'intervento chirurgico in base alla Tabella 1 degli animali (Procedure Scientifiche) Act 1986. Due settimane prima, il CST indenne è stata tracciata con biotinilatoammina destrano (BDA) iniezioni nel corteccia motoria ipsilaterale 26 al braccio disabili (Figura 1). Questo consente la quantificazione di fibre lesionate, che attraversano la linea mediana e forniscono il controlesionale midollo spinale (Figura 5C, D). Animali illeso hanno solo poche fibre che attraversano la linea mediana, mentre questo aumenta in risposta al danno. Midollo spinale cervicale trasversa sono state colorate con proteina chinasi C (PKC) gamma di valutare la percentuale di denervazione nel CST lesionato (Figura 5E) 16. In alternativa, la completezza della lesione può essere valutata iniettando BDA tracciante nella corteccia motore sul lato ipsilesionale della lesione pyramidotomy. L'assenza di etichettatura nel controlaterale dorsomediale CST e la ipsilaterale ventromediale CST costituisce una prova di completa transection unilaterale. <img alt="Figura 1" fo:conte nt-width = src "4in" = "/ files / ftp_upload / 51843 / 51843fig1highres.jpg" width = "400" /> Figura 1: Schema che mostra i tratti corticospinali nel ratto e assotomia unilaterale del CST nelle piramidi immagine Top:. Neuroni cortico origine nel livello 5 cellule piramidali corticali. Biotinilato ammina destrano (rappresentato in verde) viene iniettato nella corteccia controlesionale due settimane prima della fine dell'esperimento. Immagine Middle: I tratti formano le piramidi sulla superficie ventrale del midollo e allo svincolo spinomedullary la maggior parte degli assoni decussate. Pyramidotomy unilaterale avviene nel midollo caudale (in rosso). Immagine inferiore: La maggior parte dei tratti corticospinali malandato nelle parti dorsomediale e dorsolaterale del midollo spinale. Una minoranza resta ipsilaterally e corre ventromedially. 1843fig2highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 2: vista ventrale del cervello di ratto. Le piramidi si distinguono perché sono sollevate, convessità parallele (scatola gialla). I confini delle piramidi sono definite medialmente dal dell'arteria basilare (BAS) sulla linea mediana e lateralmente alla base della convessità a metà strada tra l'arteria basilare e l'arteria paraolivary (Pol) come si vede in (C). Craniotomy avviene tramite l'arteria basilare e laterale estendendo all'arteria paraolivary (riquadro rosso in C). Una piramide è tagliato perpendicolarmente dell'arteria basilare (linea rossa in C, taglio viene visualizzato sul campione in A e B). Le lesioni poste troppo caudale vicino alle arterie vertebrali (vert) sarà incompleta perché il CST inizia a decussate e perché l'arteria vertebrale si trova lontano dalla linea mediana. (C) Immagine tratto da "The Rat sistema nervoso" di George Paxinos 27. NOTA: Questa figura mostra una lesione sul lato sinistro delle immagini: questo è rig dell'animaleht piramidale tratto perché è sdraiato supino. Si noti, tuttavia, che il video mostra una lesione a sinistra del tratto piramidale dell'animale. Figura 3:. I risultati rappresentativi per il test allevamento del cilindro, Montoya scala pellet raggiungere prova e prova Scala orizzontale C'è un deficit motorio rilevato da tutti i test dopo la lesione. Tuttavia, nessun deficit può essere rilevato con il test di allevamento del cilindro a 4 settimane postinjury, mentre i deficit prolungati possono essere rilevati con il test scala Montoya e il test di scala orizzontale fino a 8 settimane postinjury (n = 16 per gruppo, mezzi e errore standard sono mostrato). L'asterisco indica p <0.05 rispetto al basale pre-lesione (test LSD di Fisher). Si prega di fare clic suqui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4:. Elettrofisiologia valutare il tratto corticospinale prima e dopo pyramidotomy (A) mostra il set-up per l'esperimento terminale. Stimoliamo le piramidi con un treno di 5 impulsi a varie profondità rostrali al sito di lesione e decussation. Il tratto rosso è il tratto leso. Registriamo dal nervo radiale sul lato controlesionale. (B) e (C) visualizza esempio registrazioni con stimolazione ipsilesionale o la stimolazione controlesionale prima o 12 settimane dopo pyramidotomy. Stimolazioni ipsilesionale evocano più potenziali d'azione composto (picchi nella traccia) nel nervo radiale prima lesione (B). Questi sono abolite dalla ferita e l'attività non Return entro 12 settimane (B '). Stimolazione controlesionale evoca rare potenziali d'azione unico composto pre-lesione (C). 12 settimane dopo l'attività lesioni notevolmente è aumentata (C '), probabilmente a causa di assoni intatti spuntano tra la linea mediana e plastica cambiamenti all'interno del midollo spinale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5:. Valutazione anatomica dopo pyramidotomy (A, B, C, D) biotinilato ammina destrano è stato utilizzato per tracciare il tratto corticospinale iniettando nella corteccia del motore corrispondente al CST unlesioned (vedere verde in Figura 1). Il mediale dorsale, i componenti mediali ventrali del CST sono chiaramente visibili (A, dorsale parte mediale ingrandita in B). (C) e (D) sono ingrandimenti da (A) di fibre di germinazione attraverso la linea mediana nella materia grigia del lato denervata in risposta ad un trattamento. Per valutare la completezza della lesione sezioni trasversali del livello cervicale 4 (12 settimane postinjury tessuti) sono stati tagliati e colorati con anticorpi contro PKC gamma (E). Il CST sul lato sinistro dell'immagine è intatto e può essere visto sporgenti oltre la linea mediana nel lato denervata, presumibilmente a causa della disintegrazione strutturale dorsale feriti CST.