Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Bu yöntemin için mükemmel bir test substrat Heksokinaz olduğunu. Bu hali hazırda ticari olarak mevcut olan ve en çok laboratuvarda bulunan ve açık deneyde, yeniden üretilebilir sonuçlar elde edilmiştir, iki maddenin sahip olma avantajlarına sahiptir. Bir başlangıç ​​konsantrasyonu ekranı (Protokol 1), heksokinaz ve glükoz (Şekil 2A) ile, büyük olasılıkla Kd 0.2 ila 1.7 mM aralığında olacağını göstermektedir. Bu nedenle, daha büyük bir ekran (Protokol 2), Tablo 4. Sonuçlar (Şekil 2B) 'de gösterilen konsantrasyonu kullanılarak, gerçekleştirildi tek yerli ligand bağlanma denklemine iyi bir uyum gösterir (Protokol bölüm 3.3) [9] ve verdi K 1.2 ± 0.1 mM d. Varsayılan heptose-guanil transferaz WcbM 19,20 GTP (Şekil 3A) bağlanabilen güçlü bir ısı kayması göstermektedir. Bir başlangıç ​​ekranı önerdi Kd yaklaşık 100 uM aralığında olacaktır. . Nedenle, tam ekran 3.3 denklem sonuçların takılması Tablo 5'te gösterilen konsantrasyonlarda kullanarak, ayarlanmış bir makul uyum (0,981 arasında R 2, Şekil 3B) gösterdi .Ancak, veri ve arasında belirgin bir fark yoktur modeli farklı bir denklem gerekli olduğunu düşündürmektedir. WcbM dizisi ile protein veri bankası 21 ara yapılar bir şekilde dimerler belirlenmiş olan en yakın homologlarını gösterdi. Verileri, bu sebepten, kooperatif sıralı ve iki ligand (Protokol 4) bağlanması için bağımsız üç denklemler kullanılarak analiz edildi. Sıralı ve bağımsız bağlama modelleri hem 0,992 bir R2 değeri ve 0.480 ve 0.461 bir Sy.x verdi ise bir kooperatif modeli için uydurma istatistikler, bir R 2 0,998 değerini ve 0.215 artıkları (Sy.x) standart sapma verdi sırasıyla. Bu modeli önerirkooperatif modelinin veri için en uygun olan vermiştir: Burada, 230 ± 10 uM altındaki bir KD ½ gözlenmiştir, 0.52 ± 0.02 (Şekil 3C) arasında bir n değerine sahip. Bu bağlanma için negatif bir birliktelik göstermektedir. Kd için bahsedilen birimler, oldukça tatmin edici uM 0,52 olacak şekilde K ½ yerine Kd daha bu durumda kullanılan dikkat etmek gerekir. Varsayılan GDP-6-deoksi-β-D-manno -heptopyranose 2 -acetylase, O, WcbI 22, diferansiyel tarama florimetri oldukça sıradışı bir sonucunu göstermektedir. Herhangi bir ligand olmadığında, açık ve basit bir denatürasyon (Şekil 4A) göstermektedir. Protokolde tarif edildiği gibi koenzim A (CoA) DSF kullanarak bu proteinin bir ligand ve bu ortak proteinin afinite olarak tespit edilmiştir araştırılmıştır. CoA'nın yüksek konsantrasyonlarda güçlü bir in mevcudiyetindedaha yüksek bir sıcaklığa hift 15 ° C erime sıcaklığında bir değişiklikle gözlenmektedir. Bununla birlikte, orta konsantrasyonlarda, daha çok bir ara erime sıcaklığında bir tek fazlı erimesine kayması daha WcbI protein ligand içermeyen bir sıcaklıkta, ya tam olarak bağlı erime sıcaklığı (Şekil 4A), ya da eriyik azalmasıyla, iki fazlı bir erime göstermiştir . Daha yüksek bir sıcaklıkta (Şekil 4B) de eritilmiş oranı artan substrat konsantrasyonları artan, doza bağlı bir şekilde değişmiş iki türün oranları. Bu verilerin doğrudan analizi zor oldu: türev yöntemleri iki erime olayların meydana geldiği, ancak artan ligand konsantrasyonu ile bir değişiklik gösteren yardımcı olmadığını vurgulanan iken Boltzmann denklemine uydurma, çok kötü uyuyor verdi. Bu verileri analiz etmek için bir daha az geleneksel bir yaklaşım, bu nedenle (Protokolü 5) kabul edildi. Floresan dbağ olmadan ve yüksek bağ konsantrasyonda erivative sonuç, esas olarak düşük bir erime sıcaklığına tüm protein ya da daha yüksek erime sıcaklığı durumunu temsil olarak alınmıştır. Kalan türevi veriler birlik (Şekil 4C) toplanarak oranda, bu iki devletin her bir oranının toplamı olarak her noktada takıldı. Elde edilen veriler, daha sonra önce olduğu gibi aynı denklemler kullanılarak, bir görünür Kd elde etmek için daha önce olduğu gibi yerleştirilmiştir. Bu "yüksek" bağ noktası yalnızca 95% ligand bağlı olması muhtemel olduğunu vurguladı. Veriler daha sonra,% 100 bağlanan protein için sonuç tahmininde bir ekstrapole edilmiş ve veriler, 58 ± 2 uM kadar bir görünür Kd elde etmek için tekrarlanır donanımıdır. Bu bağlanma modeli (Şekil 4D) için deneysel sonuçların mükemmel bir uyum sağlanır. <img alt="Şekil 1" fo: İçerik-width = "5in" src = "/ files / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg" width = "500" /> Deneme set-up ve analizi 1. Örnekler Şekil. (A), bir termal denatürasyon profili, beklenen şekli Örneği (maya, heksokinaz için veri alınmıştır). Ham veri karakteristik şekli sığ bir düşüş takip maksimum floresan ilerleyen bir artış, (9 içinde daha detaylı olarak tartışılacaktır) göstermektedir. Bu floresan birinci türevinin tek bir tepe eşlik eder. GraphPad veri girişi (B) Örnek. Ligand konsantrasyonu x ekseni üzerinde verilir ve Y-ekseni üzerinde erime sıcaklıkları görülmektedir. GraphPad denklem tanımı (C) Örnek. (D) Örnekler doğru ve protein konsantrasyonu tespit değişkenlerin başlangıç ​​değerlerinin ayarlanması, ayrışma sabitinin doğru tespitine imkan vermek.m / files / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. . Diferansiyel tarama florimetri ile ölçülen glikoz ile heksokinazın Şekil 2. etkileşimi (A), glukoz konsantrasyonları, geniş bir dizi test İlk deneyde, Kd 0.2 aralığında olması muhtemel olduğunu -. 1.7 mM (B) 'ayrıntılı deney, glukoz 16 konsantrasyonlarını test, 1.12 ± 0.05 mM olarak görünür K d belirlenmesini sağlar. Veri (35.4 ± 0.2 oC ve 49.3 ± 0.5 ºC sırasıyla uydurma alt (T1) ve üst (T2) sıcaklıkları ile) tek bir bağlanma olay için model son derece iyi uyuyor. DikkatBu veriler, 10 mM MgCl2 mevcudiyetinde toplanmıştır. Bu görüntüler GraphPad kullanılarak hazırlanmıştır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. GTP ile WcbM Şekil 3. Etkileşim bir anti-kooperatif bağlanma ortaya koymaktadır. (A), GTP konsantrasyonları, geniş bir dizi test İlk deneyde, Kd 200 aralığında olması muhtemel olduğunu -. 500 uM GTP 16 konsantrasyonlarda test (B), ayrıntılı bir deneydir, belirgin bir değer göstermektedir 120 ± 20 mcM K d. Ancak, logaritmik ölçek x-ekseni için kullanıldığı zaman, önemli bir discre oradamodeli ve veri arasında Pancy. bir kooperatif modeli ile aynı verilerin (C) Analizi basit kooperatif modeli kullanılmıştır verilere mükemmel bir uyum gösterir. Burada, K 230 ± 20 mcM ½ (sırasıyla 69.63 ± 0.06 º C ve 79.9 ± 0.1 ºC uydurma alt (T1) ve üst (T2) sıcaklıkları ile) kooperativiteye katsayısı n = 0.52 ± 0.02 ile tespit edilmiştir. WcbM dimerik gibi göründüğü için, bu enzim, kendi GTP bağlanma mükemmel anticooperative olduğunu ima eder. Bu görüntüler GraphPad kullanılarak hazırlanmıştır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4. WcbI iki fazlı bir erime modelini göstermektedirligandı koenzim A (CoA) mevcudiyetinde. (A) 'WcbI ligant (mavi) yokluğunda, basit bir tek fazlı bir erime modelini göstermektedir. Yüksek ligand konsantrasyonlarda (1 mM; yeşil çizgi), benzer bir model görülmektedir. Bununla birlikte, ara bağ konsantrasyonlarda mevcuttur. (60 uM; kırmızı çizgi), iki farklı erime piki ligand içermeyen ve ligand-bağlı reseptör durumuna karşılık gelen görülmektedir (B), zirvelerin iki grup arasındaki geçiş doza bağımlı tam karşısında konsantrasyonlarının aralığı. ligand serbest ligand ve yüksek bir oranda bir toplamı olarak iki fazlı ergime (C) Modelleme (kırmızı çizgi ile karşılaştırıldığında, kesikli çizgi mor), bir veri iyi bir uyum sağlar. Bu uyum tam doluluk (kesikli mavi çizgi) ile (model göstermektedir ~% 95 doluluk) yüksek ligand konsantrasyonu için gözlemlenen sonucu ekstrapolasyonuyla geliştirilir. (D) CoA'dan Sho bağlı WcbI oranı için elde edilen veriler WS 58 ± 2 uM bir Kd ile basit bağlanma modeline, mükemmel bir uyum için (bu veriler sonuçların birinci kümesine bağlı olarak ikinci gün için seçilen biraz farklı ligand konsantrasyonları, iki ayrı günde toplanan verileri temsil eder). Paneller. – Graphpad kullanan (A C) Excel kullanılarak hazırlanmış ve paneli (D) verildi , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. İlk deneyler için Tablo 1. Tarif. Reaktif Karışımı hacmi (ul) Protein 0.11 mg / ml nihai konsantrasyona ; "> 5000X, SYPRO Orange 0.3 , 0.5 M HEPES pH 7.0 3.7 5 M NaCI 5.6 Su 180 ul Bu protokol, bölüm 1. Bu tampon karışımı genel proteinler için uygun olduğu tarif edildiği gibi, Kd bir tahminde bulunmak için bir ilk keşif deney için protein, saptama reaktif ve tampon A "ana karışımı" açıklar. Önceki sonuçlar diğer tamponlar kullanılmalıdır önermek durumlarda, bu ikame edilmelidir. Stok protein düşük bir yoğunlukta (yani, en az 0.3 mg / ml) ise, ilave tampon miktarını azaltmak için gerekli olabilir, protein numune tamponu içinde halihazırda mevcut olan telafi etmek için ilave edildi. <pclass = "jove_content"> K d belirlenmesi için Tablo 2. Tarif. Reaktif Karışımı hacmi (ul) Protein 0.11 mg / ml nihai konsantrasyona 5,000X SYPRO Turuncu 1.78 , 0.5 M HEPES pH 7.0 22.2 5 M NaCI 33.3 Su 180 ul Bu protein, saptama reaktif maddesi ve b "ana karışımı" nı tarifuffer bir protein numunesi için Kd tam tayini için, protokol bölüm 2'de tarif edildiği gibi, genel tampon karışımı proteinler için uygundur. Önceki sonuçlar diğer tamponlar kullanılmalıdır önermek durumlarda, bu ikame edilmelidir. Stok protein düşük bir yoğunlukta (yani, en az 0.3 mg / ml) ise, ilave tampon miktarını azaltmak için gerekli olabilir, protein numune tamponu içinde halihazırda mevcut olan telafi etmek için ilave edildi. Tablo 3. Denklem ve veri analizi için parametreleri. Deney protokolünde Aşama Denklem gerekli Parametreler gerekli Değişkenlerin ve parametrelerin açıklaması 3.3 </ Td> Bağlanma Tek sitesi ligand Y = Alt + ((Alt-Üst) * (1 – ((PK d -X + sqrt (((P + X + K d) ^ 2) – (4 * P * X))) / (2 * P )))) P: protein konsantrasyonu. Kd: Sabit ayrışma. P ve KD ligand konsantrasyonları için kullanılan aynı birimler cinsinden verilmiştir. Üst, Alt: sonsuz ligand konsantrasyonu ve sırasıyla hiçbir bağ konsantrasyonda erime sıcaklıkları. 3.4 Alt = * Ymin Ymin: (Bu durumda düşük deneysel protein Tm) Y minimum değeri En = * Ymax </td> Ymax: Y maksimum değeri (en yüksek deneysel protein Tm) Kd = * X, en YMID YMID: yMin ve Ymax ortalamasına tekabül Y değer. X (burada, ilgili ligand konsantrasyonu) dahilinde ilgili X değeri P = (Başlangıç ​​değer, uygun olması için) 4.1 Basit kooperatif modeli Y = Alt + ((Alt-Üst) * (((X / Kd) ^ n) / (1 + ((X / Kd) ^ n)))) K Hhasta katsayısı. Bu protein bir birliktelik ya da diğer biyokimyasal özellikleri açıklanmaktadır, ve kesin olarak protein ligand bağlama sitelerinin sayısına ilişkin bir tahmin değildir. Birine göre bir Hill katsayısı herhangi bir birliktelik temsil eder; Birden düşük değerler negatif bir birliktelik gösterir ve birden büyük pozitif bir birliktelik değerleri. Alt = * Ymin En = * Ymax Kd = * X, en YMID P = (Başlangıç ​​değer, uygun olmak ) n = (Başlangıç ​​değer, uygun olması için) İki ligandların bağlanma Sıralı Y = Alt + ((Alt-Üst) * ((X ^ 2) / (K d * K2)) / (1 ​​+ (X / K d) + ((X ^ 2) / (K d * K2))) ) K2: ikinci bağlanma olayı için sürekli ayrışma. Alt = * Ymin En = * Ymax DTH: 123px; "> K d = * X YMID at YMID K2 = * X, P = (Başlangıç ​​değer, uygun olması için) Bağımsız iki ligand bağlanmasının Y = Alt + ((Alt-Üst) * ((X ^ 2) / (K d * K2)) / (1 ​​+ (2 * X / K d) + ((X ^ 2) / (K d * K2) ))) Alt = * Ymin h: 123px; "> En = * Ymax Kd = * X, en YMID YMID K2 = * X, P = (Başlangıç ​​değer, uygun olması için) 5.5 Erime sıcaklığı ikili kaymalar analizi Y = 1 – ((PK d = X + sqrt (((P + X + Kd) ^ 2) – (4 * p * X,))) / (2 x P) göre) 23px; "> Alt = * Ymin En = * Ymax Kd = * X, en YMID P = (Başlangıç ​​değer, uygun olması için) 5.8 Sonsuz ligand konsantrasyonu Dışdeğerbiçim (C2 – ((1 $ R $ 2) * B2)) / $ R $ 2 B2: hiçbir ligand sonucunu içeren bir hücre. C2: Maksimum ligand ile sonucunu içeren hücre. $ R $ 2: maksimum ligand konsantrasyonunda bağlı oranını içeren hücre. 4, 3 ve 5 numaralı adımları analiz yazılımı içine ayrıntılı denklemlerin eklenmesi ve veri analizi için başlangıç ​​parametrelerin kesin tanımını gerektirir. Her bir ilgili adım için denklemler parametrelerin doğru bir seçim ile gösterilir. Değişkenlerin ve parametrelerin anlamı bir açıklama başvuru için sağlanmıştır. Tablo glikoz ile heksokinazın etkileşim taranması için 4. Konsantrasyonları. Örneklem nokta Ligand (da glikoze) konsantrasyonu (mM) 1 0 2 0.001 3 0.005 4 0.01 5 0.03 6 0.1 7 0.3 8 0.4 9 0.7 10 1.1 11 2.1 12 3.7 13 5.3 14 7 15 9 16 11 Protokolde tarif edildiği gibi bilinen bir magnezyum kofaktör olarak çiçek mayası Saccharomyces cerevisiae ikinci heksokinaz, 10 mM MgCl2 ile takviye edilmiş, ana karışıma ilave edildi. Kd başlangıç ​​tahmini 0.5 ile 2 mm arasında olmuştur. Deneyler glikoz belirtilen nihai konsantrasyonlar elde etmek için oluşturulmuştur. Tablo GSYİH ile WcbM etkileşiminin taranması için 5. Konsantrasyonları. <table border="1" cellpadding= "0" cellspacing = "0"> Örneklem nokta Ligand (GTP) konsantrasyonu (uM) 1 0 2 0.5 3 1 4 5 5 10 6 25 7 50 8 100 9 250 10 8px; "> 500 11 1.000 12 2.500 13 5.000 14 7.500 15 10.000 16 20.000 Protokolde tarif edildiği gibi, Burkholderia pseudomallei ikinci WcbM ana karışıma ilave edildi. K d ilk tahmini yaklaşık 100 uM'ydi. Deneyler yukarıda ve aşağıda Kd büyüklük en az iki sıra kapatılmasına yönelik, GTP belirtilmedikçe nihai konsantrasyonları sağlamak için kurulmuştur.