Détermination des interactions protéine-ligand à l'aide différentielle à balayage Fluorimétrie
Summary
Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.
Abstract
Une large gamme de méthodes sont actuellement disponibles pour la détermination de la constante de dissociation entre une protéine et l'interaction des petites molécules. Cependant, la plupart d'entre eux nécessitent l'accès à des équipements spécialisés, et ont souvent besoin d'un degré d'expertise d'établir efficacement des expériences fiables et analyser les données. Fluorimétrie à balayage différentiel (CSD) est de plus en plus utilisée comme une méthode robuste pour le criblage initial de protéines de petites molécules de l'interaction, soit pour l'identification de partenaires de découverte physiologiques ou de toucher. Cette technique présente l'avantage qu'il suffit d'une machine appropriée pour la PCR quantitative PCR, et si approprié instrumentation est disponible dans la plupart des institutions; une excellente gamme de protocoles sont déjà disponibles; et il existe de fortes précédents dans la littérature pour de multiples utilisations du procédé. Les travaux antérieurs a proposé plusieurs moyens de calculer les constantes de dissociation à partir des données de DSF, mais ceux-ci sont mathématiquement exigeant. Ici, nous DEMtrent un procédé d'estimation des constantes de dissociation à partir d'une quantité modérée de DSF des données expérimentales. Ces données peuvent généralement être recueillies et analysées en une seule journée. Nous démontrons comment les différents modèles peuvent être utilisés pour ajuster les données recueillies à partir des événements de liaison simples, et où les sites de liaison ou indépendants de liaison de coopération sommes présents. Enfin, nous présentons un exemple d'analyse de données dans le cas où les modèles standard ne s'appliquent pas. Ces méthodes sont illustrées avec les données recueillies sur les protéines de contrôle disponibles dans le commerce, et deux protéines de notre programme de recherche. Dans l'ensemble, notre méthode fournit un moyen simple pour les chercheurs d'acquérir rapidement d'autres renseignements sur les interactions protéine-ligand à l'aide de DSF.
Introduction
Toutes les protéines se lient avec des affinités variables, à un large éventail d'autres molécules de simples ions à d'autres grandes macromolécules. Dans de nombreux cas, les protéines se lient à des petites molécules partenaires dans le cadre de leur fonction normale (par exemple, une kinase de liaison à l'ATP). Autres interactions peuvent être sans rapport avec la fonction, mais sont expérimentalement utiles comme outils (par exemple, les petites molécules qui stabilisent les protéines pour améliorer la réussite de cristallisation, ou aider à maintenir les protéines en solution); tandis que les petites molécules qui se lient à des sites actifs et les sites allostériques des protéines peuvent agir comme des inhibiteurs, et ainsi de moduler l'activité des enzymes.
Il existe une grande variété de techniques qui peuvent être utilisées pour déterminer l'affinité pour les molécules de protéines partenaires. Calorimétrie de titration isotherme 1 est largement considéré comme un "étalon-or", car il fournit des informations riches sur les réactions, est le marqueur libre, et a limité les possibilités pour unertifacts de l'expérience. Cependant, malgré des améliorations récentes dans la sensibilité de l'instrumentation et de l'automatisation de montage expérimental, il est encore relativement coûteux en termes de besoins en protéines, a au mieux un débit faible à moyen, et est le mieux adapté aux interactions avec modéré à affinités élevées (10 nM à 100 pM Kd) 2. D'autres méthodes étiquettes libres, tels que la résonance des plasmons de surface ou bicouche interférométrie 3 offre des débits plus élevés, et ont réalisé la sensibilité pour détecter des molécules plus petites aussi faibles que 100 Da. Toutefois, les instruments à haut débit pour ces méthodes sont relativement coûteux, sont justifiées que si il y aura un débit continu de projets pertinents, et sont donc susceptibles d'être inaccessibles à de nombreux laboratoires universitaires.
Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF ou thermofluor) a été décrite pour la première fois en 2001 en tant que méthode 4 pour la découverte de médicaments. Dans cette méthod, les protéines sont incubées avec un colorant fluorescent (colorants initialement naphtalène-sulfonique ont été utilisés), ce qui modifie sa fluorescence lors de la liaison à des régions hydrophobes des protéines. L'échantillon de protéine-colorant est ensuite chauffé, et la fluorescence contrôlée comme la chaleur monte. Le dépliement de la protéine, et l'exposition des parties hydrophobes de la protéine, donne naissance à un motif caractéristique de la fluorescence en fonction de la température (Figure 1A). L'essai peut être réalisé en de petites quantités dans un instrument PCR quantitative commerciale, et donc en une seule expérience, un grand nombre d'échantillons peuvent être testés en même temps (habituellement 48, 96 ou 384 échantillons, en fonction du modèle de l'instrument). Des expériences peuvent être effectuées habituellement en environ une heure, offrant la possibilité d'une analyse à haut débit de 5 échantillons.
D'autres améliorations de la méthodologie ont vu l'adoption de colorants avec de meilleures propriétés spectrales 6,7 </sup>, outils génériques pour l'analyse des données, et suggéré des protocoles de dépistage initial 8,9. La gamme des applications de la méthode a été étendue, avec un accent particulier sur la création de conditions optimales pour la préparation et le stockage des protéines 10, et sur l'identification de partenaires potentiels de liaison pour faciliter la cristallisation 11. Le débit relativement élevé de la méthode, un coût relativement faible en protéines (~ 2 pg par réaction), et l'applicabilité à l'étude de la faiblesse des molécules de liaison a fait DSF un outil précieux pour le fragment basé la conception de médicaments, en particulier dans un contexte académique 12-14.
Malgré la large application de DSF à l'étude des interactions protéine-ligand, peu d'études ont décrit la détermination des constantes de dissociation de ces études. Toutefois, ceux-ci ont tendance à produire des équations détaillées décrivant le déroulement de la protéine, avec de nombreux paramètres qui doivent être montés sur des données éparses ou dans certains cas, estimated 7,15-17. Ces méthodes sont d'une importance particulière dans les cas difficiles, tels que les composés fortement contraignants, ou des protéines présentant des transitions inhabituelles. Cependant, pour de nombreux laboratoires, ces analyses détaillées sont trop lourdes pour une utilisation courante. Nous proposons donc des traitements alternatifs pour les différents scénarios, et montrons comment elles peuvent être utilisées pour ajuster les données résultant de différentes interactions protéine-ligand. Notre méthode utilise l'instrument StepOne qPCR, pour lequel le logiciel d'analyse de données sur mesure est disponible; tout ce qui accélère l'analyse des données, les résultats d'autres instruments peuvent être traitées en utilisant des procédés publiés antérieurement neuf, et en aval à la même analyse peut être effectuée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Différentielle à balayage fluorimétrie a démontré sa puissance comme une méthode robuste et polyvalent pour la caractérisation des protéines, et l'identification des ligands protéiques potentiels. Les succès bien documentés dans d'accélérer la stabilisation des protéines, la découverte de médicaments (en particulier dans les laboratoires moins bien financés) et la cristallisation 10,23-25 ont fait une méthode intéressante pour le dépistage initial de composés. Les composés ajoutés aux protéines montrent une augmentation dépendante de la dose dans le ressort clairement de 7,9 température de fusion. Cependant, il ya eu quelques tentatives d'utiliser les résultats de ces expériences pour déterminer les constantes de liaison apparentes pour aider dans le classement des composés pour leur affinité. Ici, nous présentons une méthode systématique permettant de déterminer une constante de dissociation apparente pour des protéines en présence d'un ligand.
Les résultats présentés ici démontrent que DSF peut rapidement et vigoureusement fournir des estimations de la constante de dissociation pourune combinaison de la protéine-ligand. Les données observées peuvent être manipulés avec des outils disponibles dans le commerce pour fournir une détermination rapide de K d, sans la nécessité d'émettre des hypothèses sur la valeur probable de paramètres. La méthode a un avantage considérable sur certaines des méthodes comparables de parcimonie en protéines et en temps requis. L'expérience décrite ici va consommer 0,13 mg de protéine par essai (environ 0,4 mg pour des expériences répétées en triple exemplaire). Cela se compare favorablement avec calorimétrie de titration isotherme (ITC), où une expérience unique avec une protéine de 40 kDa moyenne va consommer un montant similaire. L'ensemble des expériences requises pour ce protocole consommer environ 4 heures, y compris la préparation, pour une seule série d'expériences. Encore une fois, cela est susceptible d'être beaucoup plus rapide que les procédés tels que le CCI ou résonance de plasmon de surface, qui ont souvent besoin tout puissant optimisation considérable pour atteindre les meilleures données.
Nos résultats démontrent qu'il subsiste un besoin d'examiner soigneusement les données brutes, l'ajustement de ces données afin de déterminer la température de fusion, et l'ajustement des données de température de fusion pour déterminer la constante de dissociation. Une première difficulté est la forme de données brutes produites dans la fusion de la protéine. Dans certains cas, la forme peut ne pas se rapprocher de celle observée sur la figure 1A. Les problèmes courants sont faibles changements de température sur la liaison de ligand, une forte fluorescence de fond, et de multiples transitions inhabituelles de température. Déplacements à basse température sont visibles sur la liaison d'un certain nombre de ligands. Pour cette méthode, le paramètre le plus critique est l'erreur sur la mesure de la T m, par rapport au changement de température. Les données peuvent généralement être monté normalement lorsque l'écart type de mesures triples ne dépasse pas 10% de la variation de température de fusion entre la protéine non liée et entièrement lié. Notre expérience est que lorsque cette températuredéplacements rature ne sont de 2 ° C, cela peut être suffisant pour ajuster les données, si les points de données individuels sont très précis. Une deuxième question est particulièrement en forme des courbes. Celles-ci diffèrent souvent entre les protéines libres et les formulaires de ligand lié, comme la liaison ligand affecte les modes de la protéine déroulement. Dans ces cas, l'utilisateur doit déterminer si les données peuvent être utilisés en tenant compte appropriée des modèles à utiliser pour la détermination de la température de fusion et la constante de dissociation. Un autre problème commun est que l'addition d'un cofacteur de la protéine (par exemple, MgCl 2 dans notre exemple avec l'hexokinase) est nécessaire pour obtenir les données les plus fiables. Notre expérience a été que l'examen minutieux de tous les facteurs susceptibles de l'expérience au stade de la prise de mesures initiales est essentielle pour obtenir les meilleurs résultats. En outre, les traitements théoriques alternatifs peuvent révéler des caractéristiques de ces données 15,17. Enfin, il n'est pas rare que certaines protéines qui contain nativement exposée régions hydrophobes à montrer une forte fluorescence de fond. Il ya un certain nombre de solutions à ces problèmes, qui ont été largement décrites ailleurs 6,9.
En particulier, l'utilisateur doit se demander si l'utilisation de l'Boltzmann ou modèles dérivés (figure 4), et dans le cas de l'utilisation d'instruments dérivés, si plusieurs fond doivent être modélisés. Les deux méthodes de modélisation du dépliement thermique diffèrent en ce que la méthode de Boltzmann correspond aux données expérimentales à l'équation de Boltzmann, en supposant une forme sigmoïdale régulière de la courbe de dépliement. En revanche, la méthode de la dérivée prend la première dérivée des données expérimentales à chaque point (en bas sur la figure 1A), et considère que la température de fusion pour être le point de la plus haute dérivée première. Procédé dérivé renvoie généralement une température de fusion supérieure d'environ 2-3 ° C. La plupart des protéines reviendront un plus cohérenterésultat (à savoir, l'erreur-type de la température de fusion pour les expériences en triple est plus faible) pour une des deux méthodes. Il s'agit généralement intimement liée à la forme précise de la courbe de dépliement des protéines, et il est nécessaire de déterminer la meilleure méthode empiriquement dans chaque cas. Lorsque le modèle dérivé est utilisé, il est également important de tenir compte de multiples événements de fusion. Certaines données montrent clairement preuve de transitions multiples, et dans ces cas, les résultats sont susceptibles d'être plus facile à interpréter si ces événements de fusion multiples sont modélisés. Dans le cadre de ce protocole, il est souvent le cas que l'addition de ligand peut provoquer une protéine de passer d'avoir plusieurs transitions de fusion à une seule transition (par exemple, en stabilisant le sous-domaine le plus thermiquement fragiles), ou vice versa. Nous serions donc plaider pour que les données brutes sont examinés ensemble avant d'envisager l'approche sera préférable d'utiliser.
À la suite de la modélisation des températures de fusion différentes, d'autres problèmes peuvent survenir dans le montage de ces modèles présentés dans la section de protocole. Il est impératif d'examiner attentivement la forme de l'équation constante de dissociation à l'aide d'une échelle logarithmique, comme cette analyse met en évidence souvent des écarts entre les données observées et le modèle (par ex., Figure 3). Alors que les résultats obtenus sont généralement robustes, les soins d'interprétation offre la possibilité d'extraire de meilleurs résultats, et le plus de sens, à partir des données.
Un problème particulier soulevé par ces données est l'interprétation qui doit être placé sur les protéines qui montrent coopérativité, ou des événements multiples de liaison, DSF. Nous avons, à ce jour, seulement observé ce phénomène dans les protéines qui sont censés avoir de multiples événements de liaison spécifiques (par exemple, WCBM, une protéine dont le meilleur homologue est un multimère 26, et qui agit comme un multimère sur la chromatographie d'exclusion stérique [données nonreprésenté]). Il n'est pas du tout évident que la coopérativité négative observée dans DSF dénaturation indique que l'enzyme sera finalement montrer coopérativité négative: non, cela peut être une indication de la liaison complexe qui doit être étudié de manière plus approfondie en utilisant un large éventail de méthodes. Cela ne nous suggèrent, cependant, que plus des études approfondies de ces protéines sont susceptibles d'identifier des effets intéressants.
Les valeurs indiquées pour la constante de dissociation à l'aide de ce procédé sont généralement du même ordre que ceux fournis par d'autres méthodes, telles que la calorimétrie de titration isotherme et la résonance de plasmon de surface. Toutefois, les valeurs absolues sont observées fréquemment supérieur à celui observé en utilisant ces méthodes. Ceci est au moins en partie une conséquence du fait que la constante de dissociation est observée à la température de fusion de la protéine avec un ligand. Cette valeur de Kd est généralement plus élevée que celle à des températures physiologiques. Le dissociation constant est lié à la température de la réaction par les équations:
[1]
[2]
(Où c θ est la concentration de référence standard, Δ R G est la variation de la réaction de Gibbs d'énergie libre, R est la constante molaire des gaz, Δ H est la variation d'enthalpie de la réaction, et Δ S est la variation d'entropie dans la réaction .)
Les réactions avec des constantes de dissociation dans la plage de mesure de ce procédé ont généralement un négatif Δ r G, et ainsi l'effet d'une augmentation de la température de l'équation [1] sera d'augmenter la constante de dissociation. Les deux termes Δ H et Δ S qui constituent l'énergie libre de Gibbs (équation [2]) sont température dépendante 27, et l'effet sur la constante de dissociation dépendront de l'ampleur et le signe de ces dépendances de température, et ne seront pas nécessairement interaction dépend. Par conséquent, il n'est pas surprenant que les constantes de dissociation calculées par cette méthode sont parfois supérieures à celles qui sont déterminées par des procédés qui fonctionnent à température ambiante. Influence de la température est, bien entendu, également une mise en garde de nombreuses autres méthodes, qui ont tendance à fournir la constante de dissociation à une température inférieure à la température physiologique.
Une autre mise en garde de la méthode de DSF est qu'il s'agit d'une méthode marquée, à la différence de l'ITC. Le marqueur fluorescent utilisé (SYPRO Orange) est hydrophobe, et donc dans certains cas, ne peut rivaliser avec la liaison des ligands hydrophobes des protéines. Par conséquent, il est probable que dans certains cas, la constante de dissociation obtenu sera augmenté artificiellement raison de la compétition avec l'étiquette. Cependant, pour la comparaison de divers ligands, (la principale utilisation deDSF), les différences sont peu susceptibles d'être suffisamment importante pour influer sur le classement des composés par affinité.
Un inconvénient potentiel de cette méthode est la limite de détection que l'on peut obtenir. En principe, il ne devrait pas être possible de mesurer avec précision une valeur de Kd qui est inférieure à 50% de la concentration de protéine, et même des valeurs de cette gamme sont susceptibles d'être d'une précision douteuse. Bien que la limite de détection à cette extrémité de l'intervalle peut être prolongée par une petite réduction de la concentration de protéine et de colorant, la sensibilité de l'instrument permet d'éviter en outre la réduction de la concentration en protéine. De même, l'extrémité supérieure de la sensibilité est déterminée par la solubilité du ligand. Pour obtenir une estimation mathématique robuste K d, il est très important d'obtenir des données de 90% de la protéine présente dans le formulaire lié au ligand, ce qui nécessite des concentrations de ligands à être approximatifly dix fois Kd (en supposant l'absence coopérativité). La limite de détection sera donc nécessairement un dixième de la solubilité du ligand dans le tampon approprié. Cela signifie que les limites de détection de la méthode sera généralement comprise entre 1 pM et entre 1 et 100 mM, en fonction de la protéine et le ligand.
En conclusion, la fluorimétrie différentielle à balayage est une technique polyvalent applicable à une large gamme de protéines. En utilisant les procédés présentés ici, il est possible de déterminer rapidement et à moindre coût l'affinité d'une protéine pour différents ligands. Cela a un grand potentiel pour des applications dans la purification de protéines et de stabilisation, élucider la fonction ou la spécificité des enzymes de métagénomes, et dans la découverte de médicaments, en particulier dans les petits laboratoires.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.
Materials
| StepOne real time PCR instrument | Life Technologies | 4376357 | DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis. |
| Protein thermal shift software v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| MicroAmp Fast optical 48-well plates | Life Technologies | 4375816 | |
| Optical sealing tape | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier |
| U-bottomed 96-well plates | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692 |
| SPSS statistics version 20 | IBM | N/A | Other statistics packages will provide similar functionality |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | N/A | Other statistics packages will provide similar functionality |
| Hand applicator (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glucose | Fisher scientific | 10141520 |
References
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
- Ladbury, J. E. Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design. Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).
- Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering. Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
- Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).
- Davis, B. J., Erlanson, D. A. Learning from our mistakes: the ‘unknown knowns’ in fragment screening. Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).
- Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery. Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).
- Scott, D. E., et al. Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions. Chembiochem. 14, 332-342 (2013).
- Cimmperman, P., et al. A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands. Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).
- Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor. Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).
- Zubriene, A., et al. Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay – radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII. Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11, 835-841 (1997).
- Cuccui, J., et al. Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region. Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).
- DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant. Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).
- Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme. IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).
- Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein. J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).
- Uniewicz, K. A., et al. Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity. Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).
- Wan, K. F., et al. Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL. Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).
- Koropatkin, N. M., Holden, H. M. Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi. J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).
- Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB. J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).
