Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em> Enterica סלמונלה</em> Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים
Summary
Assay תפוקה גבוהה לסלמונלה במבחנה פנוטיפ או עמותת חיידקים אחרת, פלישה, ושכפול בתאי phagocytic עם קיבולת תפוקה גבוהה פותח. השיטה הועסקה כדי להעריך זנים מוטנטים נוקאאוט גן סלמונלה למעורבותם באינטראקציות מאכסן לפתוגן.
Abstract
מיני סלמונלה הם פתוגנים zoonotic וגורמים המובילים למחל מזון מובל בבני אדם ובעלי החיים 1. הבנת המנגנונים בבסיס אינטראקציות -host סלמונלה הם חשובים על מנת להבהיר את הפתוגנזה המולקולרית של זיהום סלמונלה. Assay ההגנה גנטמיצין לפנוטיפ עמותת סלמונלה, פלישה ושכפול בתאי phagocytic הותאם כדי לאפשר הקרנת תפוקה גבוהה כדי להגדיר את התפקידים של מוטציות מחיקה של Typhimurium serotype enterica סלמונלה באינטראקציות מארח באמצעות 264.7 מקרופאגים עכבריים RAW. לפי פרוטוקול זה, את השונות במדידות מצטמצמת משמעותית בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי, כי wild-type וזנים מוטנטים מרובים, ניתן לבדוק באותו צלחת התרבות ובו בזמן. השימוש בטפטפות רבת ערוצים מגביר את התפוקה ומשפרת דיוק. יתר על כן, חששות הקשורים לשימוש בפחות הותאי st לכל גם בצלחת תרבות 96 היטב טופלו. הנה, בפרוטוקול של במבחנה assay פלישת סלמונלה שונה באמצעות תאי phagocytic הועסק בהצלחה לפנוטיפ 38 מוטציות מחיקת סלמונלה פרטניות לעמותה, פלישה ושכפול תאיים. פנוטיפים במבחנה מוצגים, שחלקם אישרו לאחר מכן יש בפנוטיפים vivo במודל חיה. לפיכך, assay שונה, הסטנדרטי לפנוטיפ סלמונלה עמותה, פלישה ושכפול במקרופאגים עם קיבולת תפוקה גבוהה יכולה להיות מנוצלת באופן רחב יותר כדי לחקור אינטראקציות חיידקים-מארח.
Introduction
Nontyphoidal סלמונלה הן גורמים חשובים במחל מעיים בכל החוליות. סלמונלה בבני האדם היא בין המחלות שמקורן במזון חיידקים העליונים 1. אפיון של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות של סלמונלה עם מארחי בעלי החיים שלהם מושגת בעיקר באמצעות המחקר של סלמונלה typhimurium serotype enterica (STM) במודלים של בעלי החיים תרבות ורקמות של זיהום. תובנה באינטראקציות STM-מארח תעזור לנו להבין איך סלמונלה לשרוד ולגדול בתוך תאי מארח. האתגר הראשון בחקר האינטראקציות אלה הוא לזהות גורמים המשתתפים רבים ככל האפשר משני מארח ופתוגן, אבל המאמצים הללו מופרים בעיקר על ידי הקשיים המשמעותיים של התמודדות עם שתי מערכות ביולוגיות מורכבות עצמאיות בו זמנית, כלומר, מארח וסלמונלה, בתנאים פיסיולוגיים. בנוסף, repert הגדולoire של סלמונלה וגני מארח פוטנציאלי קידוד גורמים מעורבים באינטראקציות מארח דורשים פלטפורמה ביולוגית תפוקה גבוהה כדי להתמודד עם אתגר זה.
Assay שונה, סטנדרטי לפנוטיפ עמותת סלמונלה, פלישה ושכפול במקרופאגים עם קיבולת תפוקה גבוהה פותח כדי לבחון קבוצה גדולה של גנים סביר העוסקים ביחסי גומלין -host סלמונלה. Assay ההגנה גנטמיצין פותח בשנת 1973 2, אבל ראשון שתואר ביסודיות על ידי Elsinghorst ב -1994 3,4. עכשיו זה הפך להיות כלי סטנדרטי ללימוד רב פתוגנים תאיים חיידקי vivo לשעבר, כולל סלמונלה 5,6. חיידקים הפנימו להימנע מלהיות נהרגו על ידי כמה אנטיביוטיקה, כמו גנטמיצין, שלא יכול לחדור לתאים אוקריוטים 3. על ידי ניצול של תופעה זו, assay הגנת גנטמיצין מודד את ההישרדות וצמיחה של ba תאייםפתוגנים cterial. שלושה אירועים במהלך הזיהום, כלומר, שיתוף עם תאים, פלישה ושכפול אוקריוטים, ניתן להעריך לחיידקים פתוגנים תאית המבוססים על מרווח הזמן בין זיהום, טיפול גנטמיצין, ודגירה נוספת (איור 1). שורות תאים אוקריוטים לספק סביבה פיזיולוגית שהיא פחות מורכב ממודלים של בעלי חיים רלוונטיים ללימודי אינטראקציה המאכסן לפתוגן.
Assay ההגנה גנטמיצין הוא פלטפורמה מתאימה כדי לחקור אינטראקציות STM-מארח, אבל assay הסטנדרטי בצלחת תרבות 24 גם יש קיבולת נמוכה תפוקה. אנליזה חישובית של in vivo מערכי נתונים מזוהה 149 מוצרי גן סלמונלה שהם חזו אינטראקציה עם כ 300 מוצרי גן המארח (נתונים שלא פורסמו). Assay ההגנה גנטמיצין הסטנדרטי אין את יכולת פנוטיפ מספר זה של מוטציות ביעילות.
בadditיון, assay הגנת גנטמיצין יכול באופן תיאורטי לזהות הפלישה של אפילו חיידק בודד. בגלל רגישות טבעית זו, את הנתונים הגולמיים רגישים לסטיות טכניות כאשר חזרו בזמנים שונים. הבקרות הפנימיות ולהצגה נתונים היחסית לאחר הנורמליזציה חיוניות לפרשנות משמעותית של התוצאות. בהתחשב בשיקולים אלה,, assay הגנת גנטמיצין הותאם סטנדרטי פותח כדי לשפר את יכולת בדיקה ולהגדיל את הדיוק.
הפרוטוקול הבא הוא מפורט ומאויר לבצע assay הגנת גנטמיצין שונה באמצעות כלים תרבות 96 היטב ושורת תאי RAW264.7 מקרופאג העכברית. בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי בכלי תרבות 24 גם, יש הפרוטוקול שונה את היתרונות הבאים: 1) שימוש בכלי תרבות 96 גם מאפשר עד 10 זנים מוטנטים שונים כדי להיות phenotyped כולל בקרות חיוביות ושליליות פנימיות עם עוצמה סטטיסטית מספקת;2) השונות של תוצאות מצטמצמת משמעותי, משום שהזנים מוטנטים נבדקים באותה צלחת התרבות ובו בזמן; 3) השימוש בטפטפות רבת ערוצים מגבירה את התפוקה תוך הפחתת עייפות מפעיל. לבסוף, בהשוואה לתרבות מנות 24 גם, חששות של תאי מארח פחות לכל גם בצלחת תרבות 96 היטב טופלו באמצעות אופטימיזציה פרוטוקול ותקינה.
לסיכום, assay שונה, הסטנדרטי במבחנת סלמונלה פנוטיפ או עמותת חיידקים אחרת, פלישה ושכפול בתאי phagocytic מגביר דיוק ומשיג יכולת תפוקה גבוהה תוך הפחתת עייפות מפעיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay ההגנה גנטמיצין הוא בשימוש נרחב כדי לחקור את הפלישה ושכפול של חיידקים פתוגנים תאיים בתוך תא מארח, וזה בעיקר כלי ביולוגי חשוב ללימוד פתוגנים, כמו סלמונלה, הפלישה שלו הוא צעד תנאי מוקדם להקמת זיהום 1. Assay ההגנה גנטמיצין הסטנדרטי בקהילת מחקר סלמונלה מיו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה נתמך על חלקו על ידי מענק למכונים לאומיים לבריאות NIAID (לAJB וLGA, R01 AI076246). אוסף המוטציה סלמונלה נתמכה בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים (לMM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 וR01 AI075093-01), בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים (לנייח, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). אנו מודים סטפן Prowollik להעתק ציפוי ומאשר את מוטציות באוסף.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
