Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water
Summary
An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.
Abstract
Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.
Introduction
Human enterale virussen zijn belangrijke verwekkers van water overgebrachte ziekten 1-3, maar zijn over het algemeen aanwezig in lage aantallen in vervuilde milieu wateren, het maken van hun detectie moeilijk zonder concentratie. Procedures gebruikt om virussen te concentreren typisch een filtratiestap, gevolgd door elutie filter en secundaire concentratie van het filter eluaat. Een gemeenschappelijke filtratie procedure berust op het gebruik van geladen membranen zoals elektropositieve filters (onlangs besproken in 4,5). Deze filters vertrouwen op het vastleggen van virussen gesuspendeerd in water met behulp van elektrostatische interacties tussen het filter oppervlak (positief geladen) en gerichte virusdeeltjes (negatief geladen). Twee elektropositieve filters die commercieel verkrijgbaar zijn vertrouwen op deze technologie, de glas / cellulose en nano-alumina / glasvezelfilters. De glas / cellulose filter kosten tot 10 keer die van de nano-alumina / glasvezel, die het gebruik van het glas / ce beperkenllulose filters voor routine-virus monitoring. Recente studies hebben gesloten verschillen zijn nominale tussen deze twee filters in het herstel van enterovirussen van omgevingstemperatuur water 6,7, rechtvaardigt het gebruik van een goedkopere filter alternatief. Andere filter opties zoals elektronegatieve en glaswol filters werden onderzocht, maar ze hetzij de voorbehandeling van bronwater (elektronegatieve filters) of niet in de handel verkrijgbaar (glaswol filters). De ontwikkeling van het virus concentratie procedures is vooral gericht op het optimaliseren van de primaire concentratie technieken (filters) om virus terugvorderingen verbeteren van water. Echter, secundaire concentratie procedures, waarbij het volume van eluant verminderen meestal van 1 L tot volumes milliliters, kunnen ook een belangrijke impact op virus terugvorderingen 8.
Secundaire concentratie van enterale virussen berust meestal op een uitvlokkingsmiddel zoals sommige soorten rundvlees extract (organische floccuning) of magere melk flocculatie 9-12 om virusdeeltjes uit de filter oppervlakken te verwijderen. Recentelijk andere secundaire concentratieprocedure met vleesextract combinatie met de toevoeging van celiet (fijne deeltjes) blijkt belofte voor terugwinnen adenovirus, enterovirus en norovirus 8,13,14. Celite concentratie werken onder dezelfde beginselen die van de biologische flocculatie werkwijze die virusdeeltjes hechten aan en vrijkomen uit deeltjes (vlokken of celite) Door het veranderen van de pH van de suspensie-oplossing. Vergelijkingen tussen deze twee secundaire concentratie technieken zijn geëvalueerd in het herstel van spiked adenovirus (adv) typen 40 en 41 8. Deze studie concludeerde dat de twee secundaire concentratie technieken waren statistisch vergelijkbaar in het herstel van adenovirussen. De biologische flocculatie methode vereist een 30 min. incubatie bij pH 3,5, terwijl de celite techniek vereist een kortere incubatie (10 min) bij pH 4,0. De organische flocculation vereist ook het gebruik van dure laboratoriumapparatuur (centrifuges) tot vlokken deeltjes verzamelen tijdens tertiaire concentratie, de celite techniek daarentegen worden alleen elementaire laboratoriumapparatuur (vacuümfiltratie) om celite deeltjes scheiden van suspensie.
Bepaalde combinaties van filters en secundaire elutietechnieken kan ook van invloed virus terugvorderingen. Een onderzoek werd geconcludeerd dat bepaalde combinaties van primaire (elektropositief filters) en secundaire concentratie technieken (celliet of organische flocculatie) had een belangrijke impact op herstel van adenovirus 13. Deze bevindingen suggereren dat optimalisatie nodig om optimaal te herstellen doelwit virus uit een bepaalde watermatrix bij gebruik van deze technieken. Optimalisatie is een tijdrovend, lastig proces veel onderzoekers actief te vermijden, omdat tal van variabelen zal worden geëvalueerd (filter type / merk pH elutieoplossing, celliet / organische flocculatie).
Hiervoor study, een procedure die is ontwikkeld om optimale omstandigheden voor virus concentratie identificeren van water met behulp van spiked menselijk adenovirusstammen 40 en 41. Vermoedelijk, omdat elk type virus toont een unieke capside morfologie en specifieke capside lading, kan het nodig zijn concentratie protocollen worden geoptimaliseerd voor elk virus richten met het oog op een optimale virale herstel te bereiken. Deze studie geeft een aanpak voor adv 40 en 41 concentratie door: 1) het evalueren virus terugvorderingen in leidingwater met behulp elektropositief filter schijven gevolgd door 2) evaluatie van een gevestigde biologische flocculatie methode versus de celliet techniek als een secundaire concentratie, en 3) de evaluatie van elutiebuffers voor tertiaire concentratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektropositief filters zijn nuttig bij het concentreren van virussen uit het water; maar deze filters kunnen verschillen in hun structuur en samenstelling die op hun beurt kunnen veranderen hun doeltreffendheid. Compounding dit probleem, capside structuren en kosten variëren tussen de virusstammen die concentratie vereisen technieken worden afgestemd op optimaal herstel 15 te verzekeren. Door eenvoudige aanpassingen van de bestaande concentratie technieken (bijv elektropositieve filters, vleesextra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. . Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R. . ICR microbial laboratory manual. 178, (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
