的iPS细胞从中间体可重编程小鼠模型的细胞表面标志物介导的净化

1，仪器设置/试剂准备/基因分型制备iPS细胞培养基：补充500毫升敲除DMEM培养基用75毫升胎牛血清（FBS）中，加入5ml L-谷氨酰胺，将5ml的非必需氨基酸，500微升β-巯基乙醇，5×10 5单位白血病抑制因子（ LIF）。请参阅材料清单用于产品和购买信息用于在该原稿的上下文中使用的试剂。 制备MEF培养基：补充500毫升DMEM培养基用50ml的FBS，加入5ml L-谷氨酰胺，将5ml的非必需氨基酸，加入5ml丙酮酸钠，500微升β-巯基乙醇。 准备冻存液：对于10毫升，结合9毫升FBS与1毫升DMSO中。 制备明胶涂覆的菜肴加入3-5毫升0.1％猪明胶溶液至T75烧瓶中，在室温下孵育至少10分钟，并吸出物使用前右。 准备FACS标签介质：对于10毫升，结合9.9毫升的PBS用0.1ml胎牛血清。 执行基因分型PCR检测的ROSA26 m2rtTA轨迹：与Taq DNA聚合酶，根据制造商的说明进行反应。使用修改过的氯化镁为3.5毫米和下面的3个引物-浓度：oIMR8052：5'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3'，oIMR8545：5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT达3'，oIMR8546：5'GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3'。循环条件为：94℃，3分钟; 35个循环（94℃，30秒，65℃1分钟，72℃1分钟）; 72℃，2分钟;保持在12℃。预计产品尺寸：650 bp的野生型等位基因和340个基点的突变等位基因。 进行基因分型PCR检测胶原StemCa / OKSM所在地：进行反应，与Taq DNA聚合酶按照说明进行操作。使用修改过的氯化镁 2.5毫米及以下3个引物-浓度：彩色/ FRT-B：5'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3'，COL / frtA1：5'GCACAGCATTGCGGACATGC 3'，COL / frtC1：5'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3'。循环条件为：95℃1分钟2个循环（94℃30秒，70℃45秒），6个循环（94℃30秒，68℃45秒）和30个循环的（94℃，20秒，60℃，1分钟）; 72℃，5分钟;保持在12℃。预计产品尺寸：331 bp的野生型等位基因和551个基点的突变等位基因。 进行所有离心步骤在400 XG为3分钟，在4℃。 2代小鼠胚胎成纤维细胞与m2rtTA应变的异性成员进行OKSM应变的动物之间的交配时机。在13.5天的胚胎剔除由母亲和去除子宫角收获胚胎。去除之前的子宫角，喷腹部用80％的乙醇溶液中，以避免微生物的污染。 转移子宫角成含有10毫升无菌磷酸盐缓冲盐水的10cm的组织培养皿（PBS）。用消毒的手术等级剪刀剪开子宫角到含有一个胚胎件（ 见图3A，B）。 使用解剖显微镜（最好放置在组织培养罩内），灭菌镊子小心取出子宫包膜及周围每个胚胎的胚外膜。每个胚胎转移到一个单独的10cm皿用10毫升的PBS。 通过移除胚胎的头，四肢，尾部和内脏器官（心脏，肝，肠等 ）用钳子进行（参见图3C）。转移胚胎的头到1.5毫升试管中，并冻结下来，因此它可以被用于基因分型，如果有必要的。 转移胚胎的躯干到空10厘米板及使用两个手术刀剁碎的胚胎，持续2分钟。加入200μl的胰蛋白酶/ EDTA溶液对胚胎切碎的顶部，并培育在室温下3-5分钟。继续切碎另外2分钟，加入2mL的MEF介质中激活胰蛋白酶，然后转移到一个15毫升的试管中。 用1000微升吸管，进一步分解机械轻柔吹打组织。转移到明胶包被的10cm皿和MEF媒体增加一个额外的10毫升注意：无论是常氧和缺氧的孵化器，可用于文化，是指讨论的更多的信息。 经过24-48小时的板应密布的MEF。 可选地，所述细胞可以被进一步传播或冷冻下来。对于细胞的冷冻，取出培养基，冲洗培养皿，用10ml PBS以除去介质和覆盖痕迹用3ml胰蛋白酶/ EDTA溶液。孵育3-5分钟，在37℃以下，加入5ml的MEF媒体和转移到15ml离心管中失活胰蛋白酶消化。降速和悬浮颗粒在3毫升冷冻介质。转移到3离心管，并在单元格中冷冻集装箱冷冻下来。 3，重新编程的MEF ove_content“>注：离心沉淀细胞在200 XG 5分钟，在4℃下，用氧正常组织培养孵化器重新编程它可以是有益的派生和扩大缺氧条件下（5％的氧气在MEF中，更多信息见讨论。 ）。 快速解冻低传离心管（P0-P1，2-3神达细胞）在水浴（37℃），其内容用10ml预热的MEF媒体转移到管。颗粒细胞，重新悬浮于12ml新鲜MEF的媒体，调成明胶包被的T75培养瓶中，让细胞恢复在继续操作之前24-48小时。注意：MEF中也可以导出后直接使用。 以下去除培养基，用胰蛋白酶/ EDTA溶液（3ml 3-5分钟，在37℃）重叠洗MEFs细胞用PBS和cellularize。通过加入5ml的MEF介质的淬火胰蛋白酶和通过温和混合进一步解离的细胞，用10毫升吸管。确定使用血球细胞的数量。 对于reprogramming实验中，种子的MEF到明胶包被的T75烧瓶中，在6.7×10 3个细胞/ cm 2的密度（〜每瓶0.5宇细胞）在含有2微克/毫升的强力霉素的iPSC媒体。请参考表1关于播种的建议，得到大约2宇重编程的中间体，用于每个时间点。注：重新编程开始与另外强力霉素（2微克/毫升）的补充培养基对于第6天更换介质隔日新鲜强力霉素补充的iPSC媒体（12毫升每T75瓶中媒体）。超过此点更新媒体，每天如果有高的细胞数。双倍的培养体积，如果媒体的变化只能每隔一天进行。 收获的重编程的中间体在所需的时间点（建议：天3，6，9，12），通过除去介质，漂洗用PBS适当体积（10毫升的T75烧瓶）中，用胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖（3毫升的T75瓶）。孵育为在37℃下3-5分钟，并通过加入5ml的iPSC媒体接着温和移液急冷。 计数与血球细胞悬浮液（见上文），粒料通过离心，吸出上清液，重悬的细胞在10ml的PBS中，以除去胰蛋白酶的任何痕迹。再次沉淀细胞，吸出上清液，并继续执行步骤4.1隔离重编程的中间体。注：细胞进行重编程可冷冻保存，并在以后阶段解冻用于FACS分离。 要建立完全重编程的iPS培养，细胞生长在DOX无IPSC的媒体再4-7天。注：成功重编程的文化包含了大量由12天菌落（ 见图4）。在此期间，异常iPS细胞仍然需要OKSM表达会消失。 或者，传播剩余完全重新编程的iPS培养：起初，种子照射的MEF为15×10 3个细胞/ cm 2的密度</s达>于12ml的iPSC媒体上涂的T75明胶烧瓶一天或6小时前实验。 接着，cellularize iPS细胞培养物通过除去介质，漂洗的T75烧瓶中，用10ml的PBS中，重叠用3ml胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37℃温育3-5分钟。猝灭胰蛋白酶通过加入5ml的iPSC媒体接着温和的混合，转移到15毫升锥形管中，短暂离心，然后在10毫升的iPS媒体再悬浮。 转移500μl的该细胞悬浮液到被照射的MEF（T75瓶），并允许培养物中生长4-5天。注：建立的iPS培养物可以是冷冻保存或用于实验。克隆细胞系可以通过解剖显微镜22下选择单独的iPSC克隆得到。 冷冻保存汇合iPSC的培养在2.8描述的MEF。 4，抗体标记重新编程的文化重悬细胞沉淀，在第3节准备中FACS标签介质补充有抗体（抗Thy-1.2太平洋蓝1:400，抗SSEA-1的生物素1:400和抗EpCAM的FITC 1:400）。用200微升每5万个细胞补充标签组合和在冰上孵育。 10分钟后，轻轻拍打管使细胞重新悬浮，并培育在冰上另外的10分钟。加入10毫升冷PBS中，每管和离心。 对于每个管被染色的制备200μl的标签介质的补充有1微升链霉亲和PeCy7（1：200）每5百万个细胞。当细胞已沉淀，小心地吸去上清，重悬在补充有链亲和素-PeCy7标签介质的适当体积。 细胞保持在冰上10分钟，点击重悬，孵育冰上再过10分钟，每管加冷PBS 10毫升，降速和吸出上清液。 在标签介质重悬细胞沉淀物在约1×10 7个细胞/ ml补充有碘化丙啶（PI）（2微克/毫升）。通过将悬浮液通过70微米过滤去除细胞团块。转移细胞到一个适当的FACS管并保持在冰上。 准备与各个抗体单独样品（抗Thy-1.2，抗-SSEA-1和抗EpCAM的）。请注意：这些是必需的，以执行在分析中使用的三个通道的色彩补偿。此外，还需要未标记细胞来设置电压和栅极进行排序。理想的情况是iPS细胞用于补偿：对保持在照射的MEF 0.5-1×10 6个iPS细胞种群被存储在液氮中冻存管。 MEFs细胞的存在是必不可少的，以获得在THY-1.2信道的信号。 解冻iPS细​​胞的离心管所描述的的MEF（第3节）。离心，悬浮细胞在800微升标记缓冲液和200μL该样品被划为无标签的控制。 利用剩余的细胞作为补偿控制。 3 15ml试管，加入抗体之间的鸿沟细胞如下：太平洋蓝补偿控制：添加抗Thy-1.2太平洋蓝抗体的0.5微升。 FITC补偿管：添加抗-EpCAM-FITC抗体的0.5微升。 PE-Cy7的补偿控制：0.5μL抗SSEA-1-生物素的抗体。 保持细胞 – 抗体样品在冰上10分钟后，通过敲击混合并孵育在冰上10分钟。 洗涤样品，用10ml冷PBS以除去未结合的抗体，向下自旋细胞，吸出上清液。重悬细胞沉淀物中加入200μl的FACS标签介质。 抗SSEA-1-生物素标记的样品，加入链霉亲和PeCy7共轭（每200微升细胞1微升）。标签单元所描述的第一抗体（SSEA-1-生物素）。 通过所有样本，包括未标记的控制通过一个70微米的过滤器，并添加PI（2微克/毫升）。细胞转移到FACS管并保持在冰上，直到需要。 中间体5，流式细胞仪分离注意：细胞用荧光激活细胞分选仪用405纳米，488纳米和560纳米激发激光器和一个100微米的喷嘴排列。 对于前向和侧向散射设电压，使得细胞群被正确显示。 如图5A所示，以排除杂物细胞周围画一个门。注：电压对细胞分选正确的设置可能会很复杂，需要一个有经验的流式细胞仪操作员。 使用前向散射（FSC）的高度相对于FSC区域排除聚集体（ 图5B）。 在可视化的PI信道与FSC到栅极上的PI阴性的活细胞（ 图5C）。 使用未标记细胞调整为PB，FITC / GFP，PE-Cy7的的荧光通道的电压。在各通道的下端理想地定位在细胞群。 置栅极与未标记的对照细胞中， 如图6A，B到子级分的重编程崇拜URES进入第3天，6和9群：SSEA-1 / THY-1.2 +细胞; SSEA-1 / THY-1.2〜细胞;和重新编程中间体SSEA-1 + / THY-1.2 – 细胞。 进一步细分的第9天SSEA-1 + / THY-1.2〜部分采用PE-Cy7的抗FITC印迹;周围画SSE-A1 + / EPCAM +细胞及SSEA-1 + / Epcam-细胞的大门。置栅极与未标记的对照细胞中， 如图6C所示，D。 排序所需的亚群（参见图7为用于MEF中代表性的FACS型材，3天/第6天/第9天/ 12天培养物和iPS细胞）之前预先填入与iPS细胞介质（1-2毫升）中相应的收集管。 流式细胞仪分选，根据制造商的协议执行。 经过流式细胞仪分离提交的细胞分子分析（RNA /蛋白提取，染色质免疫沉淀的DNA甲基化分析等）。可替代地，各种细胞组分可以是培养的。